PCR技術(shù)原理及其應(yīng)用

1、PCR 技術(shù)原理及其應(yīng)用【摘要】 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，是八十年代中期發(fā)展起來的新技術(shù)，它 的誕生改變了分子生物學(xué)研究的指導(dǎo)方法。由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適 溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進行，使目的 DNA 得以迅速擴增，具有 特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。因此， PCR 技術(shù)在建立的短短 幾十年中，便迅速進入生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究、遺傳工程、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)、人類 學(xué)等領(lǐng)域，并取得豐碩成果?！娟P(guān)鍵詞】 PCR 原理， PCR 技術(shù)的應(yīng)用一、PCR技術(shù)原理PCR技術(shù)是一種特異性DNA序列的體外酶促合成方法。其基本點是重復(fù)利 用擴增引物，以擴增的目標序列為模板，在DNA聚

2、合酶作用下進行體外目標序 列的合成。一個循環(huán)周期包括三個步驟，即模板DNA變性，一定溫度一定時間 使靶序列雙鏈解離成單鏈；引物與靶序列退火，一定溫度一定時間使兩個引物分 別結(jié)合到靶序列DNA兩條鏈的3末端；引物延伸，引物沿靶DNA3末端向5 末端延伸。這樣三步形成一個循環(huán)，并且，前一循環(huán)的產(chǎn)物作為后一循環(huán)的模板， 使靶序列呈指數(shù)倍數(shù)進行擴增。1、PCR技術(shù)操作的反應(yīng)體系（1）擴增緩沖液標準的緩沖液含10mM TrisHCl ，pH為8.3-9.0（室溫），而在延伸溫度（72 C）下，pH值接近7.2。緩沖液中含有一 種二價陽離子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2+ ，有時

3、使用 Mn2+ 。一般以 MgCl2 的形式提供，標準濃度為 1.5mM 。 Mg2+ 濃 度的高低會影響擴增的特異性和產(chǎn)率。緩沖液中還含有 50mM 的鉀離子。有些緩沖液中還加入一些添加劑和共溶劑可降低錯配率，提高富含 G+C 模 板的擴增效（2）脫氧核苷三磷酸（ dNTP ）脫氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物，標準的 PCR 反應(yīng)體系中含有等摩爾濃度的 4 種 dNTP ，即 dATP 、dTTP、 dCTP 和 dGTP ，終濃度一般為 200mM （即飽和濃度）。 dNTP 的濃度會影 響擴增的產(chǎn)量、特異性和忠實性。（ 3）引物在多數(shù)試驗中人們習(xí)慣使用的引物濃度為各 1mM ，即lp

4、mol/ml , 在100卩l(xiāng)反應(yīng)體系中相當于6x1013個分子。如果5%用 于擴增1kb的DNA片段，可得到3.3 p g的產(chǎn)物，足以用于常規(guī)分析。（4） 模板模板的數(shù)量會直接影響擴增的效果。對于一般的 PCR 擴 增，104 至107 個模板分子可達到滿意的效果。 用人類或哺乳動物基因組 DNA 進行擴增時，一般使用1 p g DNA ,相當于單拷貝基因有3 X 105個拷貝。 以酵母菌、細菌、質(zhì)粒的 DNA 作模板時，要達到這么多拷貝數(shù)分別需要 10ng ， 1ng ， 1pg 。（5）DNA 聚合酶 TaqDNA 聚合酶來自嗜熱古細菌的嗜熱水生菌，為 單分子酶，在75 C活性最強。具有

5、5-3合成活性和5-3外切活性， 但是無3-5外切活性。在95 C的半衰期為40分鐘。啟動PCR反應(yīng) 的能力很強，聚合速度快，在 72C 的聚合速度為每秒 30-100 堿基。由 于沒有 3-5 外切活性，在擴增過程中有 8.9-11x10 -5 的錯配幾率。2、PCR 技術(shù)操作的溫度監(jiān)控在典型的反應(yīng)中，9095C使雙鏈DNA變性，在4060C下讓引物與模板DNA退火，在7075 C下用Taq聚合酶催化新鏈延伸。反應(yīng)時間應(yīng)與 放大的片段長度而定，開始時模板變性時間要適當延長，最后一次循環(huán)延 伸時間要保持5分鐘，反應(yīng)終止要立即放到4C中或加入10mM EDTA以終止 反應(yīng)。3、反應(yīng)體系各組分的特

6、異性影響(1)模板DNA模板可以是dsDNA、ssDNA、mDNA (逆轉(zhuǎn)錄為cDNA )。操作中對模板要求不高，純度要求低，用量少，甚至可以用單個細胞的水 煮裂解物。實驗表明，目標片段起始量過高反而使擴增效率下降。( 2)引物引物為人工合成。 PCR 技術(shù)操作要求目標片段兩側(cè)序列可知。擴增片段長度由引物決定，引物特異性決定擴增片段的特異性。一 般對引物要求：1530bp引物(特別是3端)應(yīng)盡量避免發(fā)夾結(jié)構(gòu) 兩引物避免有互補與核算序列庫其他序列無明顯同源性兩引物的 C+G% 含量盡可能相似。引物設(shè)計不當則特異性差，非特異擴增產(chǎn)物增加，甚至 不擴增出所需目標片段。Taq聚合酶 通常的聚合酶在95

7、C已完全變性，Taq聚合酶具 熱穩(wěn)定性，該酶具有5 3聚合活性和5 3外切酶活性，即不能校 對錯誤摻入堿基。Taq 聚合酶在 95C1 小時仍有 40%的活力，這一特點完全適合 PCR 反應(yīng)， 其最適溫度為7580 C。其催化效率達150NT/秒/酶分子。使反應(yīng)在高溫 下得以完成，大大降低 DNA 二級結(jié)構(gòu)的影響，可擴增較長片段，也使模板 與引物雜交專一性提高。4)Mg2+ 為 Taq 聚合酶所必需 ,但過高會影響酶活性 ,也影響退火等。K+可促進退火，過高也抑制酶活性。四種dNTP濃度過高將使參入錯誤增高。二、 PCR 技術(shù)的應(yīng)用1、研究方面PCR 技術(shù)在研究方面的應(yīng)用， 主要是體外擴增 D

8、NA 的直接序列測定； 使 用可直接進行化學(xué)修飾的 PCR 引物在 PCR 產(chǎn)物中導(dǎo)入所希望的變化；應(yīng)用 PCR、GC夾子和變性梯度凝膠電泳測突變；稀少轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的快速克隆和序 列測定；反向 PCR 擴增原來位于核心順序兩側(cè)的 DNA 序列，從而產(chǎn)生未知 序列的探針或確定上游和下游兩側(cè)區(qū)域的序列；通過 PCR 技術(shù)的進化分析， 如 mtDNA 的 PCR 擴增及直接測定序列獲得了對證實“人類 mtDNA 進化樹的 根源在非洲”這一想法有價值的資料。 Thomas 從保存標本的皮膚擴增 m +DNA，在DNA序列上進行了鼠類的群體研究。PCR的應(yīng)用使研究對象的非創(chuàng) 造性采樣成為可能，對瀕危物種的研

9、究也有較大價值。2、臨床醫(yī)學(xué)方面遺傳疾病多為基因的重排、 缺失和突變。 PCR 技術(shù)作為基因分析手段已 被應(yīng)用于疾病的診斷，如鐮刀狀貧血病、地中海貧血癥及Bart s 等的基因分析以及產(chǎn)前基因診斷、基因轉(zhuǎn)位活化癌基因的分析、感染性治病原的 檢測和致病基因的檢測，例如已成功地用于與 AIDS 相關(guān)的 HIV-I 的檢測， 并已研制成對乙肝 HBV 和與宮頸癌有關(guān)的 HPV 病毒的分析檢測試劑盒。3、分子考古、法醫(yī)學(xué)、和人類學(xué)方面DNA 來源量少，如頭發(fā)、血跡、單個二倍體細胞、單個精子等，可用 PCR 技術(shù)從中提取微量 DNA 做模板進行擴增，產(chǎn)生目標片段供分析研究。如 從 4 萬年前西伯利亞長毛

10、象冰凍的象毛中提取 DNA 經(jīng) PCR 擴增經(jīng)行分子考 古。又如人的 DNA 中很多特定序列具有高度多態(tài)性（如 HLA D 區(qū)），這些 序列對每個人都是特定的，這就是 DNA 指紋，通過 PCR 技術(shù)可用于血緣關(guān) 系、法醫(yī)學(xué)以及人類學(xué)上的基因分析。PCR 技術(shù)的廣泛應(yīng)用，充分顯示出其獨特的優(yōu)越性，但是， PCR 技術(shù)本 身還有待進一步完善。在擴增時，仍然存在一定頻率的錯配，導(dǎo)致擴增產(chǎn) 物發(fā)生突變。因此，如何提高擴增產(chǎn)物的質(zhì)量、提高反應(yīng)的特異性、消除 擴增平臺期以及怎樣快速、簡便制備 PCR 樣本都有待進一步解決。總之，PCR技術(shù)正以強大的生命力向各個領(lǐng)域滲透，已經(jīng)取得了很大的成就。但是就技術(shù)本身而言，需要進一步發(fā)展和完善，在實踐中進一步拓 展其應(yīng)用領(lǐng)域。總結(jié)在遺傳學(xué)實驗課上，通過 PCR 方法測定人類性別的實驗，對 PCR 技術(shù)有了 初步的了解，但對其原理和應(yīng)用范圍仍存在許多不了解和疑問。于是經(jīng)過查文獻 和資料，進一步了