葡萄糖氧化酶活力測(cè)定分光度法

1、文檔編碼 : CB6L1M3D9T5 HO8E7S3R3B8 ZG4Y9L4B4J10葡萄糖氧化酶活力測(cè)定（分光度法）1.原理（1）葡萄糖氧化酶的催化特性：葡萄糖氧化酶的每個(gè)酶分子中含有兩單位 FAD （黃素腺嘌呤二核苷酸）,作為受氫體催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸,并產(chǎn)生過氧化氫；氧化酶 C6H12O 6+O2= C6H12 O7+H 2O2 在確定時(shí)間內(nèi)葡萄糖經(jīng)氧化酶催化發(fā)生反應(yīng)后,可算出葡萄糖氧化酶的活力；測(cè)定其反應(yīng)液的過氧化氫濃度即（2）葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化產(chǎn)生的過氧化氫在確定 pH 值的緩沖溶液中和加熱條件下能使靛藍(lán)胭脂紅發(fā)生褪色反應(yīng),并且其反應(yīng)速度在確定范疇內(nèi)和過氧化氫濃度成正比

2、,據(jù)此測(cè)定出產(chǎn)生的過氧化氫的量,進(jìn)而運(yùn)算出葡萄糖氧化酶活力；（3）第一利用一系列濃度的過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液與靛藍(lán)胭脂紅反應(yīng),在 615nm 波特長(zhǎng)測(cè)定吸光度,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后,作葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反應(yīng),再取其反應(yīng)液與確定濃度的靛藍(lán)胭脂紅溶液反應(yīng)隨后測(cè)定其在 615nm 波特長(zhǎng)測(cè)定吸光度,將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程后可推算出氧化酶活力；2 藥品（1）葡萄糖溶液:稱取一水葡萄糖定容于時(shí)備用,2 天 100.00mL 冷藏3 小內(nèi)有效；（2）1010-3mol/L 靛藍(lán)胭脂紅溶液：稱取靛藍(lán)胭脂紅定容于 1000mL；（2）0.2M 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液pH=5.2 ：稱取三水醋酸鈉及 冰醋酸定容至

3、 1000mL （4）12mg/L 過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.040g 30%的過氧化氫溶液（過氧化氫需事先標(biāo)定取實(shí)際值）定容于 1000mL；3 試驗(yàn)方法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確吸取0,1,2,3,4,5,6mL 過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液12mg/L,分別置于第 1 頁,共 3 頁-3 25mL 比色管中,加人1.3mL 靛藍(lán)胭脂紅溶液10 10 mol/L 和30mL 乙酸一乙酸鈉緩沖液,再加人蒸餾水稀釋至25mL 配成含有過氧化氫,mg/L, mg/L , mg/L, mg/L, mg/L , mg/L 的溶液,于沸 水浴中加熱13min 后,用流水冷卻比色管5min；用1cm 比色皿,以蒸

4、餾水作參比,在波長(zhǎng)615nm 處測(cè)定其吸光度,以吸光度對(duì)過氧化氫濃度作圖（分光度作橫坐標(biāo),過氧化氫濃度為叢坐標(biāo)）得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；（2）按酶活大小稱取適量葡萄糖氧化酶以醋酸- 醋酸鈉緩沖液稀釋至約6U/mL 的濃度,某些酶產(chǎn)品水溶性很差,加稀釋液混均定容好后需過濾取濾清夜測(cè)定；（3）將稀釋好的酶液置于37水浴中計(jì)時(shí)保溫5 分鐘；（4）吸取葡萄糖溶液置于比色管中,將其放入37水浴中計(jì)時(shí)保溫5分鐘；（5）保溫時(shí)間到后吸取10 酶稀釋液加入上述預(yù)放有葡萄糖溶液分鐘；的比色管中混勻,保溫反應(yīng)（6）取出比色管轉(zhuǎn)置于冰浴中,同時(shí)取一25mL 具塞比色管中,分別加入乙酸一乙酸鈉緩沖溶液30 mL 和的靛紅溶液

5、,再加入 1mL 的上述反應(yīng)液,稀釋至刻度,于沸水浴中加熱13min 后,取出用流水冷卻5min,終止反應(yīng)；（7）用1cm 比色皿,在波長(zhǎng)615nm 處,以蒸餾水作參比,測(cè)定其吸光度A0；（8）空白樣測(cè)定時(shí),先加三氯醋酸后加酶稀釋液,其余各步湊相同；4 運(yùn)算葡萄糖氧化酶活力定義為：37條件下,1min 內(nèi)催化葡萄糖反應(yīng)產(chǎn) 1g 過氧生化氫（H2 O2）所需的酶量為1U；X0 =（A-A 0 *K+C 0 ）*25*10 -3 *10 * （4/1）* （1/2）/10 3（A-A 0*K+C 0 ）*5 X= X 0*N/m X0 ：酶稀釋液的酶濃度,U/mL A：樣液的吸光度值A(chǔ)0 ：樣液的吸光度值 K：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率C0：標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距第 2 頁,共 3 頁25：反應(yīng)液稀釋25 倍 10 -3 ：?jiǎn)挝粨Q算,毫升轉(zhuǎn)為升 3 10 ：?jiǎn)挝粨Q算,毫克轉(zhuǎn)為微克 4/1：從4 毫升反應(yīng)液中吸取1 毫升用于