中草藥鑒定種特異性DNA探針的篩選方法

1、中草藥鑒定種特異性DNA探針的篩選方法【摘要】基因芯片技術為中草藥高效、并行、快速鑒定提供了可能。而中草藥種特異性探針的篩選是中草藥基因芯片鑒定技術開發(fā)的關劍文章結合當今中藥鑒別芯片和其它物種鑒定芯片研究進展總結了幾種適合中草藥特異性探針篩選的方法?！娟P鍵詞】基因芯片；中草藥鑒別；種特異；DNA探針Abstrat:DNAhiptehnlgyakesitfeasibletidentifyhineseherbalediinerapidly,effiientlyandinparallel.Thesreeningfspeies-speifiDNAprbesfrediinalplantsisthekey

2、stepindevelpingDNAhipfrtheauthentiatinfhineseherbalediines.binedithurrentDNAhipresearhesnidentifiatinfherbalplantsrtherspeies,seethdsavailablefrthesreeningfediinalplantsspeies-speifiDNAprbeseresuarizedinthispaper.Keyrds：DNAhip;Herbalediine;Speies-speifiDNAPrbe在中藥材基因鑒別和特征性基因測序的基礎上，建立以基因診斷和基因芯片為載體的中藥材

3、分子鑒別技術和方法是今后中藥生物技術研究中的努力方向之一1。中藥鑒定的基因芯片技術是指采用原位合成或顯微打印手段，將中藥種特異性DNA探針固定在玻璃片、尼龍膜或其它支持物表面上，形成二維DNA探針陣列，然后與熒光或DIG標記待檢中藥基因組DNA樣本雜交，通過檢測雜交信號來實現對中藥的準確、并行、高效地檢測。雖然DNA芯片技術已廣泛應用于DNA測序2、單核苷酸多態(tài)性分析3、基因表達分析4、基因診斷5、藥物篩選6、微生物種類鑒定等7各個方面，但應用于中藥鑒定尚處于起步階段，近年來隨著基因芯片技術的廣泛應用，國內外一些研究機構已開始研究使用基因芯片對中藥(材)進行鑒別8，9。采用基因芯片技術鑒定中藥

4、的基本過程是10：應用分子生物學技術找出待鑒定中藥的特定寡核苷酸序列；以此寡核苷酸序列作為探針，裝配到芯片上；檢測樣品（DNA）的提娶擴增和標記；雜交檢測及結果分析。其中找出待定中藥的特定DNA序列（DNA探針）是建立中草藥鑒定基因芯片的關鍵。本文結合近年來中藥及其它物種鑒別芯片研究進展總結了幾種可用于中草藥特異性DNA片段篩選的方法，并對這些方法的優(yōu)勢和不足做出評價。1利用現有藥用植物基因資源篩選其特異性片段首先，登錄GeneBank網站，在核酸數據庫中檢索研究對象及其相關種屬的基因序列(如植物的rRNA的ITS序列或微衛(wèi)星序列或某種功能基因)，應用分析軟件（如aVetr6.5.1軟件包中的

5、lustalALingnent程序），對這些序列進行對齊和分析，得到堿基對齊圖和聚類分析的結果。然后根據對齊圖找出具有高度多態(tài)性的區(qū)段，在這一區(qū)段用Priers程序設計引物并在相應區(qū)段結合lig5.0程序找出所有可能的探針，經過篩選后在Genebank中進行Blast查詢，篩選出特異性最好的片段作為探針使用。這種方法簡單、快捷，充分利用了現有的基因資源。目前很多微生物檢測探針11,12及植物DNA探針13都是根據已公開的基因序列設計的。然而，對于大多數藥用植物種類，其遺傳背景很不清楚。已注冊的藥用植物DNA序列的數量相對于總的藥用植物資源非常有限，而且這些已知序列中大多集中在少數植物種類14，

6、所以，這種方法只適合于遺傳背景比較清楚或已有相關序列發(fā)布的藥用植物。2通過構建的DNA文庫篩選這種方法要求先構建DNA克隆文庫或DNA文庫，然后從文庫中隨機選出若干克隆，將各克隆插入片段斑點印跡在雜交膜上(如硝酸纖維膜、尼龍膜)，用標記的本種基因組和其他種基因組的總DNA為探針分別進行斑點雜交，選擇與本種基因組雜交時雜交信號強，而與其他基因組雜交時無雜交信號的克隆，該克隆的插入序列即為本種基因組的特異序列。Q.ai.R.Bullen15從梯牧草屬(Phleu)兩個野生種P.alpinu和P.bertlnii的DNA文庫中分別篩選到它們的特異性探針。首先，提取P.alpinu和P.bertlni

7、i的總DNA，用Sau3AI部分酶切，然后將消化后片段用pU19作為載體克隆到E.liDH5ar.構建了P.alpinu和P.bertlnii的部分基因組DNA文庫（P.alpinu含3030個lnies，P.bertlnii含3240個lnies），接著從P.alpinuDNA文庫中選了1230個克隆，從P.bertlniiDNA文庫中選了1320個克隆斑點印跡在膜上，最后和通過缺口平移法采用32P-dTP標記的P.alpinu和P.bertlnii總基因組探針雜交，根據雜交信號挑選到P.alpinu特異性克隆8個，P.bertlnii特異性克隆13個，對其進行測序后篩選到3個P.alpin

8、u特異性探針和3個P.bertlnii特異性探針。還有其它通過類似方法篩選到植物種特異性探針的例子16,17。這種方法可以一次篩選大量克隆，能得到相當數量的探針，主要問題是構建DNA庫過程比較繁瑣，耗時費力，文庫質量也會影響篩選效果。再是如果從DNA文庫中篩選，因DNA是切除了內含子的DNA序列，而很多內含子本身在種間具有高度多態(tài)性（如rDNA中IST序列），這些序列的切除會降低種特異性探針的篩選效率。3從nrDNA篩選因結構和功能上的差異，植物基因組不同部位的序列變異速度很不一致，一般情況編碼區(qū)比較保守，而非編碼區(qū)序列因其功能上的限制較少,比編碼區(qū)表現出更快的進化速率，不同種間各編碼序列或非

9、編碼序列的變異方式和速率也是千差萬別。植物細胞核中編碼rRNA的基因分編碼區(qū)和非編碼區(qū)，其中編碼區(qū)的18S與5.8S，5.8S與26S基因間被兩個非編碼區(qū)ITS1和ITS2所間隔（如圖1所示）。它們共同組成一轉錄單位順反子(istrn)，順反子高度重復(幾百至幾千次),以串聯(lián)的方式排列于核染色體上,并且這些核糖體RNA順反子拷貝表現出高度的均一性(hgenEity)18。據此特征，可根據保守區(qū)序列設計引物，擴增出易變異區(qū)DNA片段，通過對擴增產物測序分析后，從中篩選出可做為種特異性探針的寡核苷酸序列19。3.1ITS(內轉錄間隔區(qū))高等植物中nrDNA序列差異主要表現在ITS、ETS及IGS等

10、非編碼區(qū)上。被子植物中ITS序列既具有核苷酸序列的高度變異性又有長度上的保守性。有研究表明18：被子植物大多數科屬其ITS序列的種間差異值為1.2%10.2%，屬間差異值為9.6%28.8%，這對系統(tǒng)發(fā)育研究來說都是較合適的范圍，也適合從這些序列中篩選種特異性探針。ZhangYB等20將16個不同種屬石斛的ITS1-5.8S-ITS2序列固定于玻片上制作了基因芯片，并用熒光標記的ITS2序列作為探針,可檢測出5種已被載入中國藥典的石斛。該基因芯片還可檢測出含有9種不同的中藥材復方中的石斛。劉建全等21從市售“藏茵陳”藥材中提取DNA,PR擴增ITS1-5.8SrDNA-ITS2整個片段，擴增產

11、物直接測序得到約700bp片段，采用排序和系統(tǒng)發(fā)育分析軟件分析“藏茵陳”原植物的親緣關系，據此設計的特異性分子快速鑒定試劑盒可對市場上的藏茵陳進行檢測。3.226SrDNAnrDNA編碼區(qū)比較保守，但其中有些可變區(qū)，不同的植物類群，其可變區(qū)變異率有很大差別。對于變異率大的類群，可以據此從中篩選到鑒別DNA探針。為了對不同種的貝母進行區(qū)分，香港城市大學及香港理工大學的研究者22設計了一種基因芯片可有效地對不同種的貝母進行區(qū)分。他們首先提取9種貝母球莖的基因組DNA，用引物對(上游引物5-GAGTGGGTTGTTTGGGA-3；下游引物5-GTATTGAGGGAAATT-3)對其26SrDNA基因

12、D2與D3區(qū)進行擴增和測序，從其多態(tài)性區(qū)段設計了各種屬特異性寡核苷酸探針，然后將不同種屬寡核苷探針點置于經多聚賴氨酸處理包被的芯片。用來自不同種貝母的熒光素標記的PR產物與DNA芯片進行雜交，可在芯片特定位置檢測到不同種貝母的熒光信號從而達到區(qū)分不同貝母的目的。陳月琴等23從采自陜西秦嶺和廣東自然保護區(qū)的杜仲中提取總DNA，PR擴增產物與質粒載體PTZ19連接，Sanger終止法測定26SrDNA片段，采用計算機分析軟件Pgene610比較了金縷梅、栓皮櫟、水青樹、領春木及前人測定的8種植物的同源序列，找出其特征性核苷酸序列，為進一步開展杜仲的專一性核酸分子探針研究奠定基矗3.35.8SrDN

13、Aarlesaria等24設計和制作了一種能鑒別有毒中草藥的DNA芯片。芯片中種特異性寡核苷酸探針來源于Anituarihaeli，A.kusnezffi，Alasiaarrrhiza，rtntigliu，等17種中藥的5.8SrRNA基因及Anitupendulu和Stellerahaaejase的Leu-tRNA基因，這些探針通過巰基連接固定在硅片上，靶基因序列通過不對稱PR擴增和熒光標記后與芯片雜交，通過這種并行的基因分型技術（parallelgentyping）可以將多種有毒草藥種類鑒別出來。3.418SrDNAG.fragilis是一種產生大量粘液狀物質的微藻，在亞德里亞海的大量繁殖

14、時嚴重影響水產和旅游業(yè)。為了對其進行監(jiān)測，F.TintiL等25從G.fragilis的18SrDNA中篩選出了可用作檢測海水中G.fragilis的寡核苷酸探針。主要過程是：從培養(yǎng)的G.fragilis細胞提取其總DNA，用引物對16S1N-16S2N擴增其18SrDNA基因，對擴增產物純化后進行測序，測序結果與GeneBank中Linguldiniuplyedru,Gnyaulaxspinifera,Prteratiuretiulatu（亞德里亞海中浮生植物群落中常和G.fragilis生長在一起）的同源序列進行比對，比對后發(fā)現G.fragilis的18SrDNA核苷酸序列與其它種有明顯的

15、不同，因此可用此序列用于G.fragilis鑒定的特異性探針或制成芯片用于海水中這種有害藻種的常規(guī)監(jiān)測。從上述例子可以看到有些探針的是從rRNA編碼區(qū)基因篩選出來，因這些區(qū)段的保守性，在不同品種間的變化比較有限，難于篩選到有較大差異的長探針，對有些類群的植物甚至難于奏效，如需鑒別的種類較近緣時，從非編碼區(qū)篩選可能會得到更好的結果。4從葉綠體DNAatK，trnL基因篩選目前常用于生藥分析的葉綠體基因組中的基因片段有核酮糖-1,5-二磷酸酯羧化酶基因(rbL)，編碼成熟酶基因(atK)，編碼RNA聚合酶B亞基基因(rp)，編碼tRNA-lysine基因(trnL)，編碼核糖體大亞基蛋白16基因(

16、rpl16)，編碼核糖體小亞基蛋白4基因(rps4)等26。其中atK基因在葉綠體基因組中的所有編碼蛋白基因中進化速率最快，常被用來研究被子植物科內水平的近緣關系研究中。再就是trnL基因，trnL基因內有三段非編碼區(qū)，由于不受功能的限制，其進化速率大于功能編碼區(qū)，目前被廣泛用于植物系統(tǒng)學研究，也可以作為種特異性探針篩選的目標區(qū)段。目前還未見從葉綠體基因中篩選中藥鑒別探針的報道，但應用其相關序列進行鑒別的事例很多，如章群27運用PR產物直接測序法測定杜仲原植物atK基因序列，通過lustal軟件將其與GenBank中同源序列進行排序比較，發(fā)現32個特異性位點和一個杜仲所獨有的GA插入序列，結論

17、認為atK基序列的測序分析可成為杜仲正品鑒定的有效手段。5從差減DNA克隆庫中篩選抑制差減雜交法是Diathenk等28所創(chuàng)立，最初是應用于建立差異DNA文庫，它是一種在差減DNA和RDA的基礎上發(fā)展起來的基于PR的差異基因表達篩選方法。其基本原理是利用鏈內退火優(yōu)于鏈間退火，比鏈間退火更穩(wěn)定，從而使非目的序列片段兩端反向重復序列在退火時產生類似于“鍋柄”的結構，無法與引物配對，從而選擇性地抑制了非目的片段的擴增，而差異片段得到富集。李同祥29利用該方法進行石斛鑒別DNA探針的篩選（其過程見圖2）。首先獲得兩種石斛之間差減片段，然后選部分差異片段克隆分別和所有實驗石斛的總DNA雜交，從中篩選出能

18、與同種石斛DNA雜交而與其它種DNA不能雜交的克隆作為該種石斛專屬DNA探針，將這些探針點在尼龍膜上制成微陣列，可靈敏而快速地鑒別出迭鞘石斛(D.aurantiauKerr)，金釵石斛(D.nbileLind.)，鐵皮石斛(D.finaleKiuraetig)，鼓糙石斛(D.hrystxuLindl.)，流蘇石斛(D.fibriatuHk)。因抑制差減雜交法的篩選目標基因是整個基因組，所以可以得到大量的探針，而且可以得到長堿基序列的探針，選擇更近緣的種做為Driver有利于提高差減克隆中種特異性探針的比例，從而提高篩選效率，不足之處是過程比較復雜，各步驟反應條件難于把握。6利用RAPD、AFL

19、P分子標記構建探針RAPD、AFLP分子標記不但可以直接用來進行中藥材的鑒別和藥材道地性鑒定（如Sha等30用RAPD擴增產物能有效地鑒別人參、西洋參、三七及其偽品；胡珊梅等31用RAPD技術探討澤瀉道地藥材與非道地藥材之間遺傳變異的大小，并建立了道地藥材的品質鑒定方法），還可以通過回收RAPD，AFLP多態(tài)性產物，克隆后作為RFLP探針32或作為篩選人工染色體文庫(BA、YA文庫)的特異性探針33，或對多態(tài)性產物進行測序，設計特異性引物探針34，用于中草藥的鑒別。此方法涉及4個步驟:DNA抽提；RAPD或AFLP擴增；特異性條帶的回收測序；探針的設計和驗證。莊南生等35應用AFLP標記技術獲

20、得了甘蔗祖親種的AFLP特異片段478條，對其中部分AFLP特異片段通過斑點雜交和Suthern雜交分析，篩選出了5個甘蔗屬特異性探針，2個斑茅特異性探針。通過RAPD或AFLP的方法不設計引物，方法上比較簡單省事，但獲得的探針數量有限，很多情況難以得到探針。綜上所述，中藥鑒別種特異性探針可以從多種途徑獲得，可以根據特定的設計選擇有效的篩選途徑。需要指出的是某DNA同源區(qū)段具多態(tài)性并不代表能從其中篩選出特異性探針，這是因為特異性探針在長度、堿基組成及其與其它種相應區(qū)段的變異程度都有一定的要求；另外，為提高芯片鑒別的準確性，有必要制備同一物種的多枚探針以增強其特異性，即使這樣，這種特異性是相對的

21、，只是增加探針的數量會最大限度地減少其它植物種類中同時出現相同序列的概率。隨著中藥現代化的進程及分子生物學技術在中藥研究中更廣泛的應用，會有越來越多的中藥基因特征性序列被揭示，只有足夠數量中草藥種類相應的特異性探針被設計出來，利用基因芯片技術對中藥的并行、快速、高效的檢測才能真正實現?！緟⒖嘉墨I】1曾慶平.生物醫(yī)藥前沿技術.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：690.2ArlinghausHF,strp,Friedrihs,etal.GenediagnstisithTF-SISApplSurfJ.Siene,2003,203-204:689.3EidngD,arsa,Krushina,etal.F

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