雞爪槭金陵丹楓和金陵黃楓葉片呈色分析

1、PAGE 15 -雞爪槭金陵丹楓和金陵黃楓葉片呈色分析摘要：以江蘇省農(nóng)業(yè)科學院自主選育的雞爪槭新品種金陵丹楓和金陵黃楓為研究對象，對其4月至7月觀賞期葉片進行葉色對比觀察，發(fā)現(xiàn)金陵丹楓新葉為亮紅色，而后紅色逐漸變淡，而金陵黃楓新葉為黃色，邊緣呈淺珊瑚色，而后逐漸變?yōu)榻瘘S色。比對金陵丹楓和金陵黃楓葉片中的葉綠素、類胡蘿卜素、花青素和黃酮類物質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)金陵丹楓亮紅色葉片中各種色素含量均高于同時期的金陵黃楓金黃色葉片，且花青素和黃酮生物合成途徑中一系列關鍵基因（ApPAL、ApCHS、ApCHI、ApF3H、ApF3H、ApDFR和ApANS）的相對表達量在金陵丹楓葉片中上調(diào)。研究結果提示，這些色

2、素含量的不同可能是導致金陵丹楓和金陵黃楓葉片呈色不同的主要原因。尤其是3種花青素（飛燕草素、矢車菊素和矢車菊半乳糖苷）在金陵丹楓亮紅色葉片中的含量遠高于金陵黃楓金黃色葉片，表明花青素在金陵丹楓葉片呈色中起到關鍵作用。關鍵詞：雞爪槭;葉片;色素中圖分類號：S687文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2022）02-0521-07AnalysisonleafcolourgenerationofAcerpalmatumJinlingDanfengandJinlingHuangfengZHULuWENJing，MAQiu-yue，YANKun-yuan，DUYi-ming，LIShu-shun

3、，LIQian-zhongAbstract：NewvarietiesofAcerpalmatumTdJinlingDanfengandJinlingHuangfengbreededbyJiangsuAcademyofAgriculturalSciencesindependentlywereusedasexperimentalmaterialsandcoloursoftheleavesduringornamentalperiodfromApriltoJulywereobservedandcompared.ItwasfoundthatthenewleavesofJinlingDanfengwere

4、brightredandthenthecolourgraduallyfaded，whilethenewleavesofJinlingHuangfengwereyellowwithlightcoralontheedges，whichgraduallyturnedintogoldenyellow.Aftercomparingthecontentsofchlorophyll，carotenoids，anthocyaninsandflavonoidsintheleavesofJinlingDanfengandJinlingHuangfeng，itwasfoundthatcontentsofvariou

5、spigmentsinthebrightredleavesofJinlingDanfengwerehigherthanthatingoldenyellowleavesofJinlingHuangfengatthesameperiod，andtherelativetranscriptlevelsofaseriesofkeygenes（ApPAL，ApCHS，ApCHI，ApF3H，ApF3H，ApDFRandApANS）inanthocyaninandflavonoidbiosyntheticpathwaysintheleavesofJinlingDanfengwereup-regulated.

6、Theresultsindicatedthat，differencesinpigmentscontentmaybethemainreasonforthedifferentcoloursgenerationinJinlingDanfengandJinlingHuangfengleaves.Inparticular，thecontentsofthreeanthocyanins（delphinidin，cyanidinandcyanidin3-galactoside）inthebrightredleavesofJinlingDanfengweremuchhigherthanthoseinthegol

7、denyellowleavesofJinlingHuangfeng，indicatingthattheanthocyaninsplayedakeyroleinthecolourgenerationintheleavesofJinlingDanfeng.Keywords：Acerpalmatum;leaf;pigment雞爪槭（AcerpalmatumThunb.）為槭樹科槭屬落葉小喬木，因其葉片豐富的季相變化和優(yōu)美的形態(tài)，成為中國極為重要的觀賞彩葉樹種，并被廣泛應用于園林景觀和城市綠化中1-2。隨著季節(jié)更替，不斷變化的葉色是雞爪槭重要的觀賞性狀之一。影響植物葉色呈現(xiàn)的因素非常復雜，其中色素（主

8、要包括葉綠素、類胡蘿卜素和花青素等）的組成、含量及配比是最為直接的影響因素3-5。葉綠素（Chlorophyll）不僅是植物進行光合作用的重要物質(zhì)基礎，也是葉片呈現(xiàn)綠色至關重要的原因。葉綠素代謝途徑主要包含葉綠素合成、循環(huán)和降解6-7。其中任何一步受到阻礙都有可能導致葉片失綠，造成黃葉甚至是白化葉片的出現(xiàn)。如水稻嘌呤合成途徑中的關鍵酶VAL1，通過參與調(diào)控葉片中葉綠體發(fā)育和葉綠素代謝過程影響葉綠素的合成，該基因突變后導致水稻葉色白化8。水稻RA1基因編碼甘氨酰-tRNA合成酶（GlyRS），該基因通過參與水稻早期葉綠體的發(fā)育影響葉綠素的合成，其突變體ra1在幼苗期呈現(xiàn)白化葉片9。類胡蘿卜素（C

9、arotenoids）含量的變化是影響葉色呈現(xiàn)的另一重要因素。目前植物中類胡蘿卜素生物合成途徑已較為清晰，八氫番茄紅素合成酶（PSY）是類胡蘿卜素生物合成途徑的第一個限速酶10-11。在銀杏黃葉突變體中，類胡蘿卜素生物合成途徑中的關鍵基因PSY、Z-ISO、ZDS和LCYE等的表達量均上調(diào)12。黃酮類化合物（Flavonoids）可以產(chǎn)生豐富的色彩，是彩葉植物呈色的主要影響因素?；ㄇ嗨兀ˋnthocyanin）是植物類黃酮化合物中重要的一類，主要分為6大類：天竺葵素（Pelargonidin）、矢車菊素（Cyanidin）、芍藥花素（Peonidin）、飛燕草素（Delphinidin）、矮牽

10、牛素（Petunidin）和錦葵素（Malyidin）。呈現(xiàn)不同色彩的花色苷大多由這6類花青素衍生而來13-14。目前花青素生物合成途徑作為苯丙烷類代謝途徑的一個重要分支已被完整解析。PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、F3H、DFR和ANS基因均為花青素合成途徑中的關鍵基因，研究者已在多種植物，如海棠、康乃馨、葡萄、小蒼蘭和煙草中發(fā)現(xiàn)這些關鍵基因表達差異影響了花青素的含量15-19。本研究以江蘇省農(nóng)業(yè)科學院自主選育的雞爪槭新品種金陵丹楓和金陵黃楓為試驗材料，通過分析這2個品種4月至7月葉片中葉綠素、類胡蘿卜素、花青素和黃酮的含量及花青素和黃酮生物合成途徑中一些關鍵基因的表達量，初步解析雞

11、爪槭金陵丹楓和金陵黃楓葉片呈色機制，以期為品種改良提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1試驗材料供試雞爪槭品種金陵丹楓和金陵黃楓種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院槭樹良種基地。于2022年4月8日開始取樣，每隔15d取第3張和第4張完全展開葉用于拍照、色素提取和基因表達量分析。取樣重復3次，取樣后將樣品立即放入液氮中，于-80冰箱保存?zhèn)溆谩?.2葉綠素和類胡蘿卜素提取及測量取金陵丹楓和金陵黃楓7個不同時期的新鮮葉片，分別稱量0.1g，剪碎放入10ml丙酮-0.1mol/LNH4OH提取液（丙酮、NH4OH體積比為91）中浸提24h。使用全波長酶標儀（MDSpectraMax190）分別在663nm、645nm和

12、440nm下測量提取液的吸光度，以空白提取液作為對照。根據(jù)以下公式分別計算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量。計算公式如下：Ca=12.72A663-2.59A645，Cb=22.88A645-4.67A663，Cc=4.695A440-0.268（Ca+Cb），式中，Ca為葉綠素a含量，Cb為葉綠素b含量，Cc為類胡蘿卜素含量，A為吸光度。1.3花青素和黃酮提取及測量取金陵丹楓和金陵黃楓7個不同時期葉片，分別稱量0.2g，用液氮研磨后將粉末轉移至10ml提取液甲醇蒸餾水甲酸三氟乙酸=702721（體積比）中，超聲波30min，4黑暗浸提24h，其間每6h振蕩1次。使用高效液相色譜儀（Agi

13、lent1290）分離黃酮類化合物，檢測參數(shù)為C18色譜柱（Waters，1.8m，2.1mm75.0mm），進樣體積1l。使用A（0.1%甲酸）和B（色譜甲醇）作為流動相，梯度洗脫條件為07min，90%10%A，10%90%B;710min，10%90%A，90%10%B，流速0.3ml/min。再使用三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（SCIEXQTRAP6500+LC-MS/MS）進行檢測及定量，根據(jù)標準品建立的標準曲線計算葉片中花青素和黃酮含量。1.4花青素和黃酮合成途徑關鍵基因表達分析取金陵丹楓和金陵黃楓7個不同時期葉片，利用Trizol（TaKaRa）提取法提取葉片總RNA，并使用RNase

14、-freeDNaseI（TaKaRa）去除基因組DNA。利用反轉錄酶M-MLV（TaKaRa）將RNA反轉錄獲得cNDA備用。利用熒光定量PCR（Real-timePCR）技術對花青素和黃酮合成途徑中的關鍵基因進行表達分析，使用ApActin基因（MN026864）20作為內(nèi)參基因。反應體系為：10lSYBRPremixExTaqTM（TaKaRa），各0.4l上游和下游引物（10mol/L），5lcDNA模板（1ng/l），0.4lReferenceDye（ROX），用ddH2O補至20l。使用Real-Time熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems7500，Carlsbad，

15、USA）進行相對實時熒光定量PCR。PCR反應程序：9530s;955s，6035s，40個循環(huán);9515s，6060s，95，15s，6015s20。采用2-Ct法計算各個基因的相對表達量，每個反應設3個生物學重復。利用Primer5.0軟件設計花青素和黃酮合成途徑中關鍵基因的特異性引物，引物序列見表1。2結果與分析2.1金陵丹楓和金陵黃楓4月至7月葉片表型分析于2022年4月8日開始每隔15d對金陵丹楓和金陵黃楓進行采樣觀察，發(fā)現(xiàn)金陵丹楓在4月8日至23日葉片呈亮紅色，而后亮紅色逐漸變淺，直至7月7日逐漸成為淡橙黃色。而金陵黃楓4月8日至23日新葉呈黃色，葉緣呈淺珊瑚色，而后葉片逐漸成為金

16、黃色，6月22日至7月7日葉片開始轉綠（圖1）。2.2金陵丹楓和金陵黃楓葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量分析分析金陵丹楓和金陵黃楓7個時期葉片中的葉綠素和類胡蘿卜素含量，發(fā)現(xiàn)金陵丹楓在4月8日至6月7日葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量均高于金陵黃楓，但隨著金陵黃楓葉片自6月22日開始轉綠，其葉綠素含量開始高于金陵丹楓葉片（圖2a圖2c）。金陵丹楓葉片中的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜含量則一直呈現(xiàn)下降趨勢（圖2a圖2d）。金陵黃楓金黃色成熟葉片（5月8日至7月7日）中的類胡蘿卜素含量也低于具有淺珊瑚色葉緣的金陵丹楓葉片（4月8日至4月23日）（圖2d）。2.3金陵丹楓和金陵黃楓葉片黃酮類物質(zhì)

17、含量分析采用超高效液質(zhì)聯(lián)用法對金陵丹楓和金陵黃楓7個時期葉片中的飛燕草素、矢車菊素和矢車菊半乳糖苷含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)金陵丹楓7個時期葉片中飛燕草素、矢車菊素和矢車菊半乳糖苷含量均遠高于金陵黃楓。其中飛燕草素在5月23日的金陵丹楓葉片中含量是金陵黃楓的9.9倍，矢車菊素在7月7日的金陵丹楓葉片中含量是金陵黃楓的11.5倍，矢車菊半乳糖苷在5月8日的金陵丹楓葉片中含量是金陵黃楓的7.3倍。隨著金陵丹楓葉片紅色逐漸褪去，金陵黃楓葉片完全變成金黃色，這3種花青素的含量逐漸降低（圖3）。在金陵黃楓葉片轉成綠時，這3種花青素含量均降至最低。采用超高效液質(zhì)聯(lián)用法對金陵丹楓和金陵黃楓7個時期葉片中的蕓香苷和槲

18、皮素含量進行檢測。結果顯示，金陵丹楓7個時期葉片中的蕓香苷和槲皮素含量均高于金陵黃楓。其中蕓香苷在5月8日的金陵丹楓葉片中含量是金陵黃楓的2.9倍，而槲皮素在4月23日的金陵丹楓葉片中含量是金陵黃楓的2.3倍。蕓香苷和槲皮素在金陵丹楓和金陵黃楓葉片中的含量均在4月至7月間呈逐漸降低的趨勢（圖4）。2.4花青素和黃酮生物合成途徑關鍵基因表達分析利用熒光定量PCR技術對金陵丹楓和金陵黃楓7個時期葉片中花青素和黃酮生物合成途徑關鍵基因進行表達分析，發(fā)現(xiàn)花青素和黃酮生物合成途徑關鍵基因ApPAL、ApCHS、ApCHI、ApF3H、ApF3H、ApDFR和ApANS在金陵丹楓中的相對表達量均高于金陵黃

19、楓。4月至7月間，金陵丹楓葉片亮紅色逐漸變淡，金陵黃楓葉片完全變成金黃色，這些關鍵基因的相對表達量也大致呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢（圖5）。3討論葉色是雞爪槭重要的觀賞性狀之一。葉片呈色表達是內(nèi)外環(huán)境因子（如光照、溫度、植物激素和糖類等）和植物自身遺傳因子共同作用的結果21-22。而色素的種類、含量及其分布均是直接影響葉色呈現(xiàn)的重要因素。葉綠素、類胡蘿卜素和黃酮類化合物是影響植物呈色的重要色素，它們共同作用，使雞爪槭葉片呈現(xiàn)多種顏色模式22-23。金陵丹楓和金陵黃楓均是江蘇省農(nóng)業(yè)科學院自主選育的雞爪槭新品種。金陵丹楓是從金陵黃楓組培苗中選育出的新品種24-25，兩者的遺傳背景極為相似。金陵丹楓的亮紅色

20、葉片和金陵黃楓的金黃色葉片為研究雞爪槭春季彩葉呈現(xiàn)提供了試驗材料。葉綠素是植物進行光合作用的重要物質(zhì)，也是植物呈現(xiàn)綠色的主要因素26。彩色葉片中的葉綠素含量往往低于綠色葉片。如雞爪槭黃葉突變體金陵黃楓中的葉綠素含量遠低于普通雞爪槭1，23;銀杏和美洲黑楊的黃葉突變體中的葉綠素含量也比正常植株明顯降低，且葉綠素合成途徑相關基因表達量下調(diào)，葉綠素降解途徑相關基因表達量上調(diào)12，22。本研究發(fā)現(xiàn)，金陵黃楓的突變株金陵丹楓亮紅色葉片的葉綠素含量高于金陵黃楓的金黃色葉片，提示金陵丹楓的高葉綠素含量可能也在其紅色呈現(xiàn)中起著一定作用。類胡蘿卜素不僅是一類光合和保護色素，其含量的提高也往往導致葉片呈現(xiàn)黃色27

21、。比如，櫟樹和銀杏黃葉突變體中類胡蘿卜素含量升高，類胡蘿卜素合成途徑相關基因表達量上調(diào)12，28;大花蕙蘭花葉突變體中類胡蘿卜素含量顯著降低，轉錄組分析發(fā)現(xiàn)多個類胡蘿卜素生物合成相關基因表達量下調(diào)29。本研究結果卻顯示，6月22日前的金陵丹楓紅色葉片中的類胡蘿卜素含量也高于金陵黃楓，這提示類胡蘿卜素確實在金陵丹楓葉片紅色呈現(xiàn)中起著一定作用?；ㄇ嗨匾约捌渌S酮類物質(zhì)含量的變化是影響植物器官呈色的決定性因素之一30-32。紫薯較紅薯塊根中積累了大量的花青素，其花青素代謝途徑中的一系列基因被上調(diào)表達33。文心蘭花瓣中同時具有紅色和黃色2種顏色，其中紅色花瓣中含有錦葵色素半乳糖、芍藥素葡萄糖苷、飛燕草

22、素葡萄糖苷和矢車菊素葡萄糖苷這4種花色苷，而黃色花瓣中則未檢測到這4種花色苷，進一步研究發(fā)現(xiàn)花青素代謝途徑中的2個關鍵基因CHI和DRF在黃色花瓣中表達量下調(diào)是導致兩種顏色形成的主要原因34。本研究發(fā)現(xiàn)，金陵丹楓葉片中的花青素（飛燕草素、矢車菊素和矢車菊半乳糖苷）和蕓香苷、槲皮素等黃酮類物質(zhì)含量遠高于金陵黃楓，同時其花青素等黃酮類物質(zhì)生物合成關鍵酶的編碼基因（ApPAL、ApCHS、ApCHI、ApF3H、ApF3H、ApDFR和ApANS）表達量上調(diào)。這提示花青素等黃酮類物質(zhì)含量的不同是導致金陵丹楓和金陵黃楓葉片呈現(xiàn)不同顏色的重要原因?；ㄇ嗨睾忘S酮含量除了受上述生物合成途徑基因的調(diào)控外，轉錄

23、水平的調(diào)控也同樣起作用，已知影響花青素和黃酮的轉錄因子主要有MYB、bHLH、WD403類35-37。金陵丹楓和金陵黃楓葉片呈色不同是否受到上述轉錄因子的調(diào)控還需進一步研究。參考文獻：1LISS，LIQZ，RongLP，etal.GeneexpressingandsRNAsequencingshowthatgenedifferentiationassociateswithayellowAcerpalmatummutantleafindifferentlightconditionsJ.BiomedResearchInternational，2022，2022：1-10.2KIMJH，LEEBC，

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