食品安全國家標準 水產(chǎn)品中河豚毒素的測定

1、 食品安全國家標準 水產(chǎn)品中河豚毒素的測定1范圍本標準規(guī)定了水產(chǎn)品中河豚毒素的測定方法。本標準第一法適用于鮮河豚魚的肌肉、肝臟、皮膚和性腺組織中河豚毒素（tetrodotoxin，簡寫為TTX）的測定。第二法適用于河豚魚、織紋螺、蝦、牡蠣、花蛤及魷魚中河豚毒素的測定。第三法適用于鮮河豚魚中TTX的測定。第四法適用于河豚魚中肌肉、肝臟、皮膚中河豚毒素的測定。第一法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法2原理試樣經(jīng)1%乙酸甲醇提取，免疫親和柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，外標法定量。3 試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。3.1 甲醇（CH3OH）色譜純。3.2

2、 乙腈（CH3CN）色譜純。3.3 甲酸（HCOOH）色譜純。3.4 乙酸（CH3COOH）優(yōu)級純。3.5 乙酸銨（CH3COONH4）色譜純。3.6 磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）。3.7 磷酸二氫鈉（NaH2PO42H2O）。3.8 氯化鈉（NaCl）。3.9 氫氧化鈉（NaOH）。3.10 1%乙酸-甲醇溶液：量取10 mL乙酸（3.4），用甲醇定容至1000 mL。3.11 2%乙酸-甲醇溶液：量取10 mL乙酸（3.4），用甲醇定容至500 mL。3.12 0.1%甲酸溶液：量取0.1 mL甲酸（3.3），用水稀釋并定容至100 mL。3.13 0.1%甲酸溶液（含5 mmo

3、l/L乙酸銨）：取0.5 mL甲酸（3.3）和0.19 g乙酸銨（3.5），用水溶解并定容至500 mL。3.14 0.1%甲酸-乙腈溶液（1：1，體積比）：取50 mL 0.1%甲酸溶液（3.12）加到50 mL乙腈中，混合均勻。3.15 磷酸鹽緩沖溶液（PBS溶液，0.05 mol/L）：稱取磷酸氫二鈉6.45 g（3.6），磷酸二氫鈉1.09g（3.7），氯化鈉4.25 g（3.8），用超純水溶解并定容至500 mL。3.16 氫氧化鈉溶液（1 mol/L）：準確稱取20 g氫氧化鈉（3.9），用水溶解并定容至500 mL。3.17 河豚毒素標準品（tetrodotoxin，分子式C11

4、H17N3O8）：純度98%。3.18 標準溶液配制3.18.1 河豚毒素儲備液（100 g/mL）：準確稱取河豚毒素10.0 mg（3.17），用少量0.1%甲酸溶液（3.12）溶解后以甲醇（3.1）定容至100 mL，-18以下避光保存。3.18.2 河豚毒素中間液：準確量取河豚毒素標準儲備液（3.18.1）適量，以0.1%甲酸乙腈溶液（3.14）稀釋成1 g/mL的標準中間液，-18以下避光保存。3.18.3 標準曲線工作液：準確量取河豚毒素標準中間液適量（3.18.2），以0.1%甲酸乙腈溶液（3.14）稀釋得到11000 g/L的標準系列工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。3.19 免疫親和柱：含河豚

5、毒素特異性抗體的免疫親和柱，3 mL。28儲存，使用前需回至室溫。3.20 0.2m微孔有機相濾膜。4 儀器和設(shè)備4.1 液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源。4.2 分析天平：感量為0.1 mg和0.01 g。4.3 均質(zhì)機：轉(zhuǎn)速10000 轉(zhuǎn)/分鐘。4.4 渦旋振蕩器。4.5 高速冷凍離心機：轉(zhuǎn)速8000 轉(zhuǎn)/分鐘。4.6 超聲波清洗器。4.7 固相萃取裝置。4.8 氮吹儀。4.9 pH計。5 分析步驟5.1 試樣制備 用蒸餾水清洗魚體表面的污物，濾紙吸干魚體表面的水分后用剪刀將魚體分解成肌肉、肝臟、皮膚和性腺（精巢或卵巢）等部分，各部分組織分別用蒸餾水洗去血污，濾紙吸干表面的水分后

6、將各組織剪碎，充分均質(zhì)（4.3），裝入清潔容器內(nèi)，并標明標記。5.2 試樣提取 稱取5.00 g（精確到0.01 g）（4.2）勻漿試樣于50 mL具塞離心管中，加入11 mL 1%乙酸-甲醇溶液（3.10），渦旋振蕩2 min（4.4），50水浴超聲提取15 min（4.6），以8000 r/min離心5 min（4.5），轉(zhuǎn)移上清液于25 mL比色管中。在殘渣中再加入11 mL 1%乙酸-甲醇溶液（3.10），重復(fù)以上步驟，上清液并入25 mL比色管中，用1%乙酸-甲醇溶液（3.10）定容至25 mL。移取約10 mL提取液至另一50 mL具塞離心管中，-20下冷凍30 min，再以800

7、0 r/min離心5 min（4.5），準確移取5 mL上清液，加入20 mL PBS溶液（3.15）進行稀釋，用1 mol/L氫氧化鈉溶液（3.16）調(diào)節(jié)稀釋后的溶液pH在78范圍內(nèi)（4.9），待上樣。5.3 試樣凈化 將免疫親和柱中封存的PBS溶液以自然流速放出，移入樣品溶液，保持樣品溶液以1滴/s的流速過柱，再用10 mL超純水淋洗，抽干，用5 mL 2%乙酸-甲醇溶液（3.11）洗脫于玻璃離心管中，洗脫液于45氮氣吹干（4.8），加入1.00 mL 0.1%甲酸-乙腈溶液（3.14）溶解殘渣，超聲1 min（4.6），過0.2 m濾膜（3.20）后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（4.1）分析。

8、5.4 儀器參考條件5.4.1 液相色譜參考條件：a）色譜柱：TSK-gel Amide-80，150 mm 2 mm （i.d.），5 m，或相當者。b）流速：0.3 mL/min。c）柱溫：40。d）進樣量：10 L。e）流動相：A為0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L乙酸銨）（3.13），B為乙腈（3.2），梯度洗脫程序見表1。表1 流動相梯度洗脫程序時間 （min）A （%）B （ %）0.010902.010902.190106.090106.18.0101090905.4.2 質(zhì)譜參考條件a）離子源：電噴霧源（ESI）。b）掃描模式：正離子掃描。c）噴霧電壓：4800 V。d）鞘氣

9、流量：12L/min。e）輔助氣流量：2L/min。f）離子傳輸管溫度：350。g）源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離電壓：10v。h）掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）。i）Q1半峰寬：0.7Da。j）Q3半峰寬：0.7Da。k）碰撞氣壓力：氬氣，1.5mTorr。l）選擇反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量見表2。表2 選擇反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量目標化合物母離子（m/z）子離子（m/z）碰撞能量（CE/ev）河豚毒素（TTX）320162*3930225*代表定量離子5.5 標準曲線的制作將標準系列工作液（3.18.3）分別注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，測定相應(yīng)的峰面積，以標準工作液的濃度為橫坐標，以峰面

10、積為縱坐標，繪制標準曲線。5.6 試樣溶液的測定將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，得到峰面積，根據(jù)標準曲線得到待測液中河豚毒素的濃度，平行測定次數(shù)不少于兩次。5.6.1 定性測定在同樣測試條件下，試樣溶液中與標準溶液中河豚毒素的保留時間之比，偏差在2.5%以內(nèi)，且檢測到的離子的相對豐度，應(yīng)當與濃度相近的標準工作液中離子的相對豐度一致，其豐度比偏差應(yīng)符合表3要求。表3 定性測定時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度50%20%至50%10%至20%10%允許的相對偏差20%25%30%50%5.6.2 定量測定取試樣溶液和相應(yīng)的標準溶液等體積進樣測定，采用標準曲線進行外標法定量。標準溶液及

11、試樣溶液中河豚毒素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。河豚毒素標準溶液總離子流圖參見附錄A。6 空白實驗 除不加試樣外，均按上述測定步驟進行。7 分析結(jié)果的表述試樣中河豚毒素的含量按公式（1）計算，計算結(jié)果需扣除空白值： （1）式中：X樣品中河豚毒素含量，單位為微克每千克（g/kg）；c由標準曲線方程計算得到的樣品凈化溶液濃度，單位為微克每升（g/L）；V試樣最終定容體積，單位為毫升（mL）；m試樣質(zhì)量，單位為克（g）；f稀釋因子，按照5.2步驟進行樣品前處理時為5。以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測XX果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。8 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕

12、對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。9 其他方法檢出限為1 g/kg，定量限為3 g/kg。第二法 液相色譜-熒光檢測法10.原理試樣中含有的河豚毒素采用酸性水溶液提取，提取液經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液復(fù)溶，經(jīng)調(diào)pH至6.07.0后，過免疫親和固相萃取小柱凈化，液相色譜-柱后衍生熒光法測定，保留時間定性，峰面積外標法定量。11.試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。11.1 甲醇（CH3OH）：色譜純。11.2 甲酸（CHOOH）：色譜純。11.3 乙腈（CH3CN）：色譜純。11.4 乙酸（CH3COOH）：色譜純。11.5 乙酸銨（CH3COONH4）：

13、色譜純。11.6 十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）。11.7 二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO42H2O）。11.8 氯化鈉（NaCl）。11.9 氫氧化鈉（NaOH）。11.10 庚烷磺酸鈉（C7H15NaO3S）。11.11 碳酸鈉（Na2CO3）。11.12 1 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取40 g（精確到0.01 g）氫氧化鈉（11.9），加水溶解稀釋至1000 mL。11.13 磷酸鹽緩沖液（ PBS）：分別稱取6.45 g十二水合磷酸氫二鈉（11.6），1.09 g二水合磷酸二氫鈉（11.7），4.25 g氯化鈉（11.8），用水溶解并定容至500 mL。11.14 1

14、 %乙酸水溶液：移取10 mL乙酸（11.4），用水稀釋至1 L。11.15 2 %乙酸甲醇溶液：移取20 mL乙酸（11.4），用甲醇（11.1）稀釋至1 L。11.16 乙酸銨緩沖液：稱取4.6g乙酸銨（11.5）和2.02 g庚烷磺酸鈉（11.10），加入約700 mL水溶解，用乙酸（11.4）調(diào)節(jié)pH值為5.0，用水稀釋至1 L。11.17 4 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取160 g氫氧化鈉（11.9），用水溶解并稀釋至1 L。11.18 4%碳酸鈉溶液：稱取碳酸鈉（11.11）40g，用水溶解并稀釋至1L。11.19 河豚毒素標準品（tetrodotoxin，分子式C11H17N3O

15、8）：純度98%。11.20 標準溶液配制11.20.1 標準貯備液（100 mg/L）：準確稱取河豚毒素10.0 mg（11.19），用少量水溶解后以甲醇（11.1）定容至100 mL，該標準貯備液置于4 冰箱中可保存一個月。 11.20.2 標準工作液：根據(jù)需要取適量標準貯備液（11.20.1），以1%乙酸水溶液（11.14）稀釋成適當濃度的標準工作液。標準工作液臨用現(xiàn)配。11.20.3 基質(zhì)匹配標準工作液：以空白基質(zhì)溶液配制適當濃度的標準工作液。基質(zhì)匹配標準工作液要現(xiàn)配現(xiàn)用。11.21 免疫親和柱：含河豚毒素特異性抗體的免疫親和柱，3mL，2-8存放。使用前免疫親和柱需回至室溫（2225

16、 ），每次上樣前都要將親和柱內(nèi)上次液體完全排干。11.22 0.2m微孔有機相濾膜。12 儀器和設(shè)備12.1 液相色譜儀：配有熒光檢測器與柱后衍生裝置。12.2 分析天平：感量0.1 mg和0.01 g。12.3 組織搗碎機。12.4 旋渦振蕩器。12.5 超聲波發(fā)生器。12.6 固相萃取裝置。12.7 離心機：轉(zhuǎn)速不低于4 500 r/min。12.8 氮吹儀。12.9 pH計。13分析步驟注：制樣操作過程中必須防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。由于河豚毒素為劇毒物質(zhì)，對于可能含有河豚毒素的產(chǎn)品，應(yīng)避免直接接觸或誤食，相關(guān)的器皿和器具可以采用4%碳酸鈉溶液（11.18）浸泡加熱去毒處理

17、。13.1 樣品的提取稱取2.00 g（精確到0.01 g）（12.2）勻漿樣品置于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL （精確到0.01 mL）1%乙酸水溶液（11.14），漩渦振蕩2 min，60 水浴超聲提取30 min，4 500 r/min離心5 min。移取5 mL（精確到0.01 mL）上清液至另一個50 mL 離心管中，加入20 mL PBS溶液（11.13）稀釋，用1 mol/L的 NaOH（11.12）調(diào)至pH 78（12.9），待凈化。13.2 樣品的凈化取出免疫親和柱，待回至室溫，去掉親和柱堵頭，放出柱內(nèi)保存液后，上10 mL（精確到0.01 mL）樣品液。上樣結(jié)束

18、后，用10 mL 水淋洗親和柱，擠干柱內(nèi)殘留液，并棄去以上全部流出液，最后用4 mL 含有2%乙酸的甲醇溶液（11.15）洗脫，收集的洗脫液于50 氮氣吹干（12.8），用1 mL（精確到0.01 mL）1%乙酸水溶液（11.14）溶解并定容，經(jīng)0.22m 濾膜（11.6）后供液相色譜-熒光法分析（12.1）。13.3 儀器參考條件13.3.1液相色譜條件色譜柱：Purospher Star PR-18e C18柱，4.6250 mm，粒徑5 m或相當?shù)纳V柱。流動相：乙腈-乙酸銨緩沖液（3.2.5）=（5+95，v/v）。流速：1.0 mL/min。柱溫：30 。激發(fā)波長：385nm，發(fā)射波

19、長：505nm。進樣量：40L。13.3.2 柱后衍生條件a）衍生溶液：4 mol/L氫氧化鈉（3.2.6）。b）衍生溶液流速：0.5 mL/min。 c）衍生管溫度：110 。13.4 標準曲線的制作將標準系列工作液分別注入液相色譜中，測定相應(yīng)的峰面積，以標準工作液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。13.5 試樣溶液的測定待測樣液中河豚毒素的響應(yīng)值應(yīng)在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi)，否則應(yīng)適當稀釋或濃縮。標準工作液與待測樣液等體積進樣。根據(jù)標準溶液色譜峰的保留時間和峰面積，對試樣溶液的色譜峰根據(jù)保留時間進行定性（待測樣品中化合物色譜峰的保留時間與標準溶液相比變化范圍應(yīng)在2.5 %之內(nèi)），外

20、標法定量。平行測定次數(shù)不少于兩次。河豚毒素標準溶液液相色譜圖參見附錄B。14空白實驗除不加試樣外，均按上述測定步驟進行。15分析結(jié)果的表述用數(shù)據(jù)處理軟件中的外標法，或繪制標準曲線，按式（1）計算試樣中河豚毒素含量：（1）式中：X試樣中河豚毒素含量的數(shù)值，單位為微克每千克（g/kg）； C由標準曲線而得的樣液中河豚毒素含量的數(shù)值，單位為微克每升（g/L）；C0由標準曲線而得的空白實驗中河豚毒素含量的數(shù)值，單位為微克每升（g/L）；V樣品最終定容體積，單位為毫升（mL）；f稀釋因子，按照13.1-13.2步驟進行樣品前處理時為5；m最終樣液代表的試樣量，單位為克（g）。注：計算結(jié)果應(yīng)扣除空白值。1

21、6精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。17其他本標準方法的檢出限為0.05 mg/kg，定量限為0.15 mg/kg。第三法 酶聯(lián)免疫吸附法18.原理樣品中的河豚毒素經(jīng)提取、脫脂后與定量的特異性抗體反應(yīng)，多余的游離抗體則與酶標板內(nèi)的包被抗原結(jié)合，然后加入酶標二抗與酶標板上的抗體結(jié)合，加入底物后顯色，與標準曲線比較來測定TTX含量。19.試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。19.1 抗河豚毒素單克隆抗體：雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)并經(jīng)純化的抗TTX單克隆抗體。19.2 牛血清白蛋白（BSA）。19.3 人工抗原：牛

22、血清白蛋白-甲醛-河豚毒素連接物（BSA-HCHO-TTX），-20保存。19.4 河豚毒素C11H17O8N2 ：純度大于等于98%。19.5 辣根過氧化物酶標記羊抗鼠抗體：使用前稀釋至工作濃度。19.6 乙酸（CH3COOH）。19.7 氫氧化鈉（NaOH）。19.8 乙酸鈉（CH3COONa）。19.9 乙醚（C4H10O）。19.10 N，N-二甲基甲酰胺（C3H7NO）。19.11 3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），（C16H20N2）。19.12 碳酸鈉（Na2CO3）。19.13 碳酸氫鈉（NaHCO3）。19.14 磷酸二氫鉀（KH2PO4）。19.15 磷酸氫二鈉（Na

23、2HPO4.12H2O）。19.16 氯化鈉（NaCl）。19.17 氯化鉀（KCl）。19.18 過氧化氫（H2O2）。19.19 吐溫-20（Tween-20）。19.20 檸檬酸（C6H8O7.H2O）。19.21 98%濃硫酸（H2SO4）。19.22 0.2mol/L （pH4.0）乙酸鹽緩沖液的制備。19.22.10.2mol/L乙酸鈉：16.4g乙酸鈉（19.8）加純水溶解并定容至1000mL。19.22.20.2mol/L乙酸：11.4g乙酸（19.6）加純水溶解并定容至1000 mL。19.22.3 0.2mol/L乙酸鹽緩沖液（pH4.0）：取0.2mol/L乙酸鈉（19.

24、22.1）2.0mL和0.2mol/L乙酸8.0mL（19.22.2）混合。19.23 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH7.4）：分別稱取KH2PO4 （19.14）0.2g、Na2HPO4.12H2O （19.15）2.9g、NaCl （19.16）8.0g、KCl（19.17） 0.2g，加純水溶解并定容至1000mL。19.24 TTX標準溶液配制：19.24.1 TTX標準儲備溶液配制（1.0 g/L）將河豚毒素標準品（19.4）溶于0.2mol/L乙酸鹽緩沖液中（19.22），配成濃度為1.0g/L的標準儲備液，密封后4保存?zhèn)溆谩?9.24.2TTX標準工作溶液的制備:

25、將TTX標準儲備液（19.24.1）用0.01mol/L PBS（19.23）配制成濃度分別為5000.0g/L、2500.0g/L、1000.0g/L、500.0g/L、250.0g/L、100.0g/L、50.0g/L、25.0g/L、10.0g/L、5.0g/L、1.0g/L、0.5g/L的TTX標準工作溶液，工作溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。19.25包被緩沖液（0.05mol/L碳酸鹽緩沖液）的制備（pH9.6）:分別稱取Na2CO3 1.59g（19.12）、NaHCO3 2.93g（19.13），加純水溶解并定容至1000mL。19.26 封閉液的制備:2.0g BSA（19.2）加0.01mo

26、l/L PBS（19.23）溶解并定容至1000mL。 19.27 洗液的制備:999.5mL 0.01mol/L PBS（19.23）溶液中加入0.5mL的吐溫-20（19.19）。19.28 抗體稀釋液的制備:1.0g BSA （19.2）加0.01mol/L PBS（19.23）溶解并定容至1000mL。19.29底物緩沖液的制備:19.29.10.1mol/L 檸檬酸溶液：21.01g檸檬酸（19.20）加純水溶解并定容至1000mL。19.29.20.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液：71.6g 磷酸氫二鈉（19.15）加純水溶解并定容至1000mL。19.29.3底物緩沖液：將0.1m

27、ol/L檸檬酸溶液（19.29.1）、0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液（19.29.2）和純水按照24.3:25.7:50的比例現(xiàn)用現(xiàn)配。19.30 底物溶液的制備:19.30.1 TMB儲存液：200mg TMB（19.11）溶于20mL N，N-二甲基甲酰胺（19.10）中而成，4避光保存。19.30.2 底物溶液：將75L TMB儲存液（19.30.1）、10mL底物緩沖液（19.29.3）和10L H2O2（19.18）混合而成。19.31終止液:2mol/L的硫酸溶液：取891.5mL98%的濃硫酸（19.21），緩緩加至盛有108.5mL純水的容量瓶中混勻。19.32 0.1%乙酸

28、溶液:1mL乙酸（19.6）加到999mL純水中。19.33 1mol/L NaOH溶液:40g 氫氧化鈉（19.7）加純水溶解并定容至1000mL。20.儀器20.1 組織勻漿器。20.2 溫控磁力攪拌器。20.3 高速離心機。20.4 全波長光柵酶標儀或配有450nm濾光片的酶標儀。20.5 可拆卸96孔酶標微孔板。20.6 恒溫培養(yǎng)箱。20.7 微量加樣器及配套吸頭（100L、200L和1000L）。20.8 分析天平。20.9 架盤藥物天平。20.10 125mL分液漏斗。20.11 100mL量筒。20.12 100mL燒杯。20.13 剪刀。20.14 漏斗。20.15 10mL吸

29、管。20.16 100mL磨口具塞錐形瓶。20.17 容量瓶（50mL、100mL）。20.18 pH試紙。20.19 研缽。21 分析步驟21.1樣品采集及運輸現(xiàn)場采集樣品后立即4冷藏，并于當天運至實驗室進行檢驗。如果路途遙遠，可于當天進行冷凍，并應(yīng)保存在冷凍狀態(tài)中運輸至檢驗實驗室。21.2 取樣對冷藏樣品或冷凍后解凍的樣品，用蒸餾水清洗魚體表面的污物，濾紙吸干魚體表面的水分后用剪刀（20.13）將魚體分解成肌肉、肝臟、腸道、皮膚、卵巢（雄性為精囊）等部分，各部分組織分別用蒸餾水洗去血污，濾紙吸干表面的水分后稱重（20.8）。21.3 樣品提取21.3.1將待測河豚組織用剪刀（20.13）剪

30、碎，加入5倍體積0.1%的乙酸溶液（19.32）（即1g組織中加入0.1%乙酸5mL），用組織勻漿器（20.1）磨成糊狀。21.3.2取相當于5g河豚組織的勻漿糊（25 mL）于燒杯（20.12）中，置溫控磁力攪拌器（20.2）上邊加熱邊攪拌，達到100時持續(xù)10min后取下，冷卻至室溫后，8 000r/min離心15min（20.3），快速過濾于125mL分液漏斗（20.10）中。21.3.3濾紙殘渣用20mL0.1%乙酸（19.32）分次洗凈，洗液合并于原燒杯中，置溫控磁力攪拌器（20.2）上邊加熱邊攪拌，達到100時持續(xù)3min后取下，8 000r/min離心（20.3）15min過濾，

31、濾液合并于21.3.2分液漏斗中。21.3.4 在21.3.2分液漏斗的清液中加入等體積乙醚（19.9）振搖脫脂，靜置分層后，放出水層至另一分液漏斗（20.10）中并以等體積乙醚（19.9）再重復(fù)脫脂一次，將水層放入100mL錐形瓶中，減壓濃縮去除其中殘存的乙醚后，將提取液移入50mL容量瓶（20.17）中。21.3.5 將21.3.4的提取液用1mol/L NaOH溶液（19.33）調(diào)pH至6.57.0（20.18），并用PBS（19.23）定容至50mL，立即用于檢測（每毫升提取液相當于0.1g河豚組織樣品）。21.3.6 當天不能檢測的提取液經(jīng)減壓濃縮去除其中殘存的乙醚后不用NaOH調(diào)p

32、H值（19.33），密封后-20冷凍保存，在檢測前調(diào)節(jié)pH并定容至50mL，立即檢測。21.4測定21.4.1包被酶標微孔板用BSA-HCHO-TTX人工抗原（19.3）包被酶標板，120L/孔，4靜置12小時。21.4.2抗體抗原反應(yīng)將純化TTX單克隆抗體（19.1）稀釋至工作濃度后分別：a）與等體積不同濃度的河豚毒素標準溶液（19.24.2）在2mL試管內(nèi)混合后，4靜置12小時或37溫育2小時備用。此液用于制作TTX標準抑制曲線。b）與等體積樣品提取液（21.3.5）在2mL試管內(nèi)混合后，4靜置12小時或37溫育2小時備用。此液用于測定樣品中TTX含量。21.4.3封閉已包被的酶標板（21

33、.4.1）用PBS-T（19.27）洗3次（每次浸泡3min）后，加封閉液（19.26）封閉，200L/孔，置37溫育（20.6）2小時。21.4.4測定封閉后的酶標板用PBS-T（19.27）洗33min后，加抗原抗體反應(yīng)液（21.4.2）（在酶標板的適當孔位加抗體稀釋液作為陰性對照），100L/孔，37溫育（20.6）2小時，酶標板用PBS-T（19.27）洗33min后，加入已稀釋至工作濃度的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體（19.5），100L/孔，37溫育（20.6）1小時，酶標板用PBS-T（19.27）洗53min后，加新配置的底物溶液（19.30.2），100L/孔，37溫育（2

34、0.6）12min后，每孔加入50L 2mol/L的H2SO4（19.31）終止顯色反應(yīng)，在波長450nm處測定吸光度值（20.4）。22 空白實驗 除不加試樣外，均按上述測定步驟進行。23 分析結(jié)果的表述樣品中TTX的含量按式（1）計算： CVDX= （1） MX: 樣品中TTX的含量，單位為微克每千克（g/kg）；C：酶標板上測得的TTX的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL），根據(jù)標準曲線按照數(shù)值插入法求得；V：樣品提取液的體積，單位為毫升（mL）； D：樣品提取液的稀釋倍數(shù)；M：樣品質(zhì)量，單位為克（g）。24 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20

35、%。25 其他方法檢出限為3 g/kg，定量限為10 g/kg。第四法 小鼠生物法26.原理根據(jù)河豚毒素易溶于酸性溶液原理，試樣制備后經(jīng)兩次0.5%乙酸溶液煮沸提取，20 000 g離心收集上清液，將兩次上清液合并并定容至25 mL，用于小鼠生物試驗，根據(jù)小鼠注射提取液后的死亡時間，查出鼠單位，并按小鼠體重校正鼠單位，計算確定河豚毒素含量。27.試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的三級水。27.1 乙酸（CH3COOH）。27.2 氫氧化鈉（NaOH）。27.3 0.5 %乙酸溶液：將5 mL乙酸（27.1）用水稀釋至于1 L。27.4 1mol/L氫

36、氧化鈉溶液：40g 氫氧化鈉（27.2）加純水溶解并定容至1000mL。27.5 小白鼠：28日齡，體重19 g21 g 的無特定病原體級（SPF）XX系雄性健康小鼠。28.儀器和設(shè)備28.1 均質(zhì)器。28.2 電子天平：感量0.1 g 。28.3 離心機：離心力20 000 g。28.4 秒表。28.5 電爐。28.6 剪刀。28.7 鑷子。28.8 手術(shù)刀。28.9 容量瓶（25mL）。29.分析步驟29.1 試樣制備 29.1.1 冷凍樣品裝于密封塑料袋內(nèi)于流水下急速解凍，蒸餾水洗凈后用濾紙吸干，分解成肌肉組織、肝臟、皮膚等部分（28.8），分別稱量后將各組織剪碎（28.6），充分均質(zhì)（

37、28.1）。29.1.2 對于肌肉組織，準確稱取樣品10.0 g（28.2）于50 mL離心管中，加入0.5%乙酸溶液（27.2）11 mL，充分混勻，沸水浴中煮沸10 min（28.5），不斷攪拌以防止組織結(jié)塊。29.1.3 冷卻至室溫，20 000 g高速離心（28.3）20 min，移取上清液于50 mL離心管中。29.1.4 向沉淀中加入0.5 % 乙酸溶液（27.2）11 mL，充分混勻，沸水浴中煮沸5 min（28.5），不斷攪拌以防止組織結(jié)塊。29.1.5 冷卻至室溫，20 000 g高速離心（28.3）20 min，取上清液，將兩次離心上清液合并混勻，用0.5%乙酸（27.2）

38、定容至25 mL（28.9）。此提取液1 mL相當于原臟器或者組織的0.4 g。29.1.6 肝臟和皮膚的處理方法為：用0.5 % 乙酸（27.2）處理后，不需煮沸直接20 000 g高速離心（28.3）20 min，取上清，將兩次離心上清液合并混勻，用0.5 % 乙酸（27.2）定容至25 mL（28.9）。另外，因肝臟中含有大量水分，在加入乙酸提取時，應(yīng)盡量減少乙酸溶液體積（8 mL為宜），以防止TTX提取液稀釋倍數(shù)過大。注1：制備樣品時，如果樣品完全解凍，取樣時，組織中的毒素有可能會轉(zhuǎn)移到其他組織中。因此，對于冷凍原料，要在半解凍的情況下進行取樣操作。制備樣品若不能及時檢驗，應(yīng)置于4 冰

39、箱保存，在24 h內(nèi)檢驗。注2：作為樣品的臟器或者組織不足10 g 的情況下，按照以上方法進行提取操作，適量減少抽出液。注3：提取液里不含有離心分離液表面上被分離出來的油狀物、類似明膠樣的物質(zhì)或者脂質(zhì)類。29.2 試樣溶液的測定29.2.1 選取19.0 g21.0 g 的無特定病原體級（SPF）XX系雄性健康小鼠6只（27.3），稱取并記錄質(zhì)量。隨機分為實驗組和空白對照組兩組，每組3只。29.2.2 對每只試驗小鼠腹腔注射1 mL提取液（29.1.5或29.1.6）或空白對照液（27.2）。注射過程中若有一滴以上提取液溢出，須將該只小鼠丟棄，并重新注射一只小鼠。29.2.3 記錄注射完畢時間

40、（28.4），仔細觀察并記錄小鼠停止呼吸時的死亡時間（到小鼠呼出最后一口氣止）（28.4）。29.2.4 若注射樣品原液后，小鼠死亡時間小于7 min，則按附錄C計算出樣品原液1 mL中所含的毒量，以這個值為基準，配制出使小鼠在7 min13 min死亡所需的稀釋液濃度，再注射至少3只小鼠以確定樣品的毒力。稀釋時使用0.5 % 乙酸（27.2）。29.2.5 若注射樣品原液后，小鼠的死亡時間大于13 min，則直接根據(jù)中間致死時間確定樣品的毒力。29.2.6 小鼠中毒死亡癥狀：被注射了河豚毒素的小鼠初期安靜，呼吸困難，急促，腹部收縮加快，反應(yīng)遲鈍，繼而出現(xiàn)突然疾走，急跑急跳，四處亂竄，東倒西歪

41、，翻轉(zhuǎn)亂跳等掙扎動作，數(shù)十秒后，小鼠后腿劇烈抽搐，23次后爬臥不動，腹部呼吸逐漸微弱減慢，最后死亡。以停止呼吸作為判斷死亡的標準。30.分析結(jié)果的表述30.1 毒力的計算根據(jù)試驗中所得的小鼠致死時間，算出中間致死時間，然后按附錄C計算出毒量（若中間致死時間剛好處于表A.1中給出的兩時間中間時，則取兩時間中較大的時間值；若介于表A.1中給出的兩時間中但不正好處于中間時，則取更接近于中間致死時間的值）。若小鼠體重不正好為20.0 g，則按附錄D進行小鼠單位（MU）的誤差補正，通過補正后的小鼠單位（MU）中間值表示出稀釋液的毒量。1MU的定義為使體重20.0 g的無特定病原體級（SPF）XX系雄性小

42、鼠30 min死亡的毒量。相當于0.18g TTX。用得出的MU值乘以稀釋倍數(shù)計算出1g原樣品相對應(yīng)的MU。每克樣品中河豚毒素的含量按式（1）計算：X=MEDW （1）式中：X每克樣品中TTX的含量，單位為MU；M 每毫升注射液的鼠單位數(shù)，MU/mL；E 提取系數(shù)，本方法提取系數(shù)為3.11；D 稀釋倍數(shù)；W 重量校正系數(shù)。示例：從10.0 g臟器提取25 mL樣品原液對3只小鼠進行試驗，若中間致死時間是5 min 15 s，小鼠體重為19.5 g，樣品原液的毒力約為3.58 MU/mL。按附錄C可以推測，稀釋2倍后死亡時間約為10 min。配制2倍稀釋液進行試驗，若得出中間致死時間為10 min，則稀釋液的毒力即為1.80 MU/mL。因為稀釋倍數(shù)是2，提取系數(shù)為3.11，重量校正系數(shù)為0.98，所以毒力計算如下：原樣品1 g 的毒力 = 1.803.1120.98 = 1