熒光PCR原理和污染處理課件

1、 熒光定量PCR檢測原理 和污染的處理 主講人：衛(wèi)明 主講單位：深圳匹基生物股份有限公司深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部第一部分熒光PCR技術(shù)的原理、特點和定量方法熒光標(biāo)記信號的產(chǎn)生熒光標(biāo)記基團在某波長的激發(fā)光刺激下，產(chǎn)生一個更長波長的發(fā)射光深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部FRET某熒光標(biāo)記基團在激發(fā)光刺激下生成某波長的發(fā)射光，當(dāng)另一屏蔽基團與其距離合適時，原發(fā)射光將會被屏蔽基團所吸收，并轉(zhuǎn)化為其他波長的發(fā)射光或熱能，稱之為FRET。深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部TaqMan熒光探針的原理PCR擴增體系中加入一個特異性的寡核苷酸熒光探針，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，

2、報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的53外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部陽性標(biāo)本擴增曲線 陰性標(biāo)本擴增曲線典型的熒光PCR擴增曲線深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部 熒光閾值（threshold ）：熒光本底 設(shè)定PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的默認設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準偏差的10倍Ct值C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每

3、個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如下圖所示）。與結(jié)果分析相關(guān)的兩個重要名詞：熒光閾值與Ct值深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部PCR熒光試劑標(biāo)準品擴增曲線（儀器：Bio-rad iCycler）1x108 拷貝/ml1x107 拷貝/ml1x106 拷貝/ml1x105 拷貝/ml1x104 拷貝/ml深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部定量原理和方法原理：每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準品可作出標(biāo)準曲線最后通過標(biāo)準曲線對未知模板進行定量分析。外標(biāo)法：將幾個已知拷貝數(shù)的純化的目的基因標(biāo)準品進行FQ-PCR 擴增，繪制熒光定量標(biāo)準曲線。內(nèi)

4、標(biāo)法：將已知濃度的內(nèi)標(biāo)基因加到各標(biāo)本中，與標(biāo)本一起經(jīng)歷核酸提取、加樣、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增及信號檢測的全過程，比較內(nèi)標(biāo)最后的實測值與已知值，以檢驗標(biāo)本中是否存在抑制PCR的因素，也可對樣品的拷貝數(shù)加以校正。 深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部熒光PCR定量的原理-外標(biāo)法深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部第二部分 PCR污染及預(yù)防對策 污染原因 標(biāo)本間交叉污染 PCR試劑的污染 PCR擴增產(chǎn)物污染氣溶膠污染實驗室中克隆質(zhì)粒的污染 深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部規(guī)范化的管理和標(biāo)準操作程序（SOP）儀器設(shè)備的維護保養(yǎng)程序儀器設(shè)備的校準程序儀器設(shè)備的操作程序臨床標(biāo)本的處理程序臨床標(biāo)本的保存程序核酸產(chǎn)物分析檢測程

5、序等深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部PCR防污染措施1.實驗環(huán)境的控制PCR應(yīng)實行嚴格的分區(qū)操作：前準備區(qū)；樣本處理區(qū)，其中DNA和RNA的處理也應(yīng)該分開；擴增區(qū)。各區(qū)專區(qū)使用，并盡量使用一次性消耗品，高壓消毒，實驗器械和臺面均應(yīng)進行定期消毒等。2避免PCR后處理熒光PCR不同于其他的PCR方法，無須對PCR擴增產(chǎn)物進行任何的檢測，實際就是對PCR污染的有力預(yù)防。3dUTP防污染系統(tǒng)反應(yīng)體系中常規(guī)的dNTPS中的dTTP替換為dUTP，在擴增過程中dU取代dT的位置摻入到PCR產(chǎn)物中，在尿嘧啶糖基酶（UNG）的作用下，發(fā)生U的糖苷鍵的水解，經(jīng)高溫處理后DNA鏈斷裂成碎片，從而無法成為下一輪的PC

6、R的模板。深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部污染的監(jiān)測 對照試驗 試劑空白對照陽性對照 陰性對照 重復(fù)性試驗深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部防止污染的方法 合理的分區(qū)吸樣槍 預(yù)混和分裝PCR試劑 防止操作人員污染 設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?選擇質(zhì)量好的試劑和耗材深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部PCR假陰性的原因分析 樣品前處理或保存方面的問題：抗凝劑使用不當(dāng)（如肝素可顯著抑制PCR反應(yīng)）溶血樣品反復(fù)凍融等。樣品處理過程中模板的降解或丟失操作不規(guī)范存在核酸酶（特別是RNase）的污染等。PCR試劑方面的問題試劑質(zhì)量本身不過關(guān)試劑已過期深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部試劑運輸或保存不當(dāng)，多次凍融等導(dǎo)致引物或/和探針的降解，酶活性減低或喪失。存在PCR抑制物：血紅素、有機試劑等。PCR反應(yīng)體系方面的問題：加樣不準確、錯加、漏加某種試劑等。深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部解決的對策嚴格按照操作規(guī)程進行樣品的保存、處理及模板的制備規(guī)范操作設(shè)立對照的原則防止核酸酶(RNase和DNase)的污染建立健全的實驗室管理體系和完整實驗記錄深圳匹基生物股份公司技術(shù)支持部出現(xiàn)污染的對策根據(jù)實驗結(jié)果先判斷污染的原因1.如果只是陰性對照出現(xiàn)污染，而標(biāo)本中仍有陰性，則考