微生物的分子生物學(xué)檢測(cè)方法課件

1、微生物的分子生物學(xué)檢測(cè)方法123目錄PCR核酸技術(shù)核酸分子技術(shù)結(jié)語PCR核酸技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)( PCR)技術(shù)自1985年發(fā)明以來,各種各樣以PCR 為基礎(chǔ)的DNA序列的擴(kuò)增和檢測(cè)方法得到了迅猛發(fā)展。各種衍生技術(shù)如反轉(zhuǎn)錄PCR ( RTR) 、多重PCR 、巢式PCR、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCRSSCP)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA 技術(shù)(RAPD)和重復(fù)序列PCR技術(shù)(Rep - PCR)、熒光定量PCR等。其中定量PCR 既可以用于臨床感染性疾病的診斷,又可用于監(jiān)測(cè)其療效，PCR及其衍生的技術(shù)近年來在病原微生物分型研究上得到了廣泛應(yīng)用。簡(jiǎn)介隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性D

2、NA 技術(shù)重復(fù)序列PCR技術(shù)免疫PCR優(yōu)點(diǎn)添加標(biāo)題隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA 技術(shù)RAPD是目前最簡(jiǎn)單的DNA分型方法, 分辨力高于RFLP, 但低于RepPCR，RAPD技術(shù)的使用范圍也非常廣,分辨結(jié)果也有較好的實(shí)驗(yàn)室再現(xiàn)性，在疾病暴發(fā)流行時(shí),PAPD仍是一種分析相關(guān)菌株和排除不相關(guān)菌株的良好技術(shù)。缺點(diǎn)由于其對(duì)引物和DNA濃度、DNA模板質(zhì)量、凝膠電泳和DNA聚合酶類型的變化高度敏感, 故RAPD的重復(fù)性不夠理想。雖然RAPD的分型結(jié)果在不同實(shí)驗(yàn)室間變化較大,分辨力不如PFGE技術(shù)。隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA技術(shù)（RAPD）是一種典型PCR衍生技術(shù), 在低復(fù)性溫度下用短任意序列引物(1015m er

3、s) 擴(kuò)增有密切同源性的基因組DNA序列, 模板上任意引物雜交點(diǎn)的數(shù)目和位置因種的不同株而異, 理論上特定株形成特定圖譜。反應(yīng)出不同菌株基因組的DNA特點(diǎn),從而對(duì)他們進(jìn)行分型優(yōu)點(diǎn)添加標(biāo)題重復(fù)序列PCR技術(shù)已成功地用于分型的細(xì)菌重復(fù)DNA序列有腸道菌重復(fù)基因間共有(ERIC) 序列、重復(fù)基因外回紋序列(REP)和BOX序列的分析，與其他分類技術(shù)相比,這種技術(shù)有更高的分辨力缺點(diǎn)Rep-PCR分辨力稍低重復(fù)序列PCR技術(shù)（RepPCR）是利用細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列為引物靶序列,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過對(duì)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果的比較,分析菌株間基因組存在的差異具有一定互補(bǔ)序列的核苷酸單鏈在液相或固相

4、中按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則締合成異質(zhì)雙鏈的過程叫核酸分子雜交。具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強(qiáng)度等）可按堿基互補(bǔ)原成雙鏈。雜交的雙方是待測(cè)核酸序列及探針（probe）,待測(cè)核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA。核酸分子雜交技術(shù)特點(diǎn)應(yīng)用（1）靈敏度高、特異性強(qiáng)；（2）用于 DNADNA和RNARNA的定性、定量檢測(cè)。（1）檢測(cè)特異 DNADNA序列（2）特異基因克隆的篩選；（3）核酸序列的初略分析；（4）PCR技術(shù)的分子基礎(chǔ)。0204010305Northern印跡雜交：基本原理與Southern印跡雜交相同，不同的是它檢測(cè)mRNA

5、而不是DNA，因此可分析和了解基因的表達(dá)狀態(tài)。Southern印跡雜交：根據(jù)基因探針與待測(cè)DNA限制酶酶解片段雜交的帶譜，可以直接確定宿主基因的缺陷所在或病原體的存在狀態(tài)原位雜交：直接在組織切片或細(xì)胞涂片上進(jìn)行雜交反應(yīng)。該技術(shù)可檢出細(xì)胞中單拷貝mRNA，估算病毒在宿主細(xì)胞中復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的程度，對(duì)于病毒感染（特別是具有長(zhǎng)潛伏期的病毒感染）和其它退行性疾病的診斷很有用。斑點(diǎn)雜交將待測(cè)DNA或細(xì)胞裂解物變性后直接點(diǎn)在硝酸纖維素膜上（無需限制酶酶解），與探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。核酸打點(diǎn)雜交：它是將一定量的病毒核酸(DNA或RNA)打點(diǎn)在固相支持膜上,然后與放射性或非放射性標(biāo)記的(DNA或RNA)探針進(jìn)行雜交,雜交后通過放 射自顯影或顯色反應(yīng)檢測(cè)雜交信號(hào)。 長(zhǎng)期以來,人們?cè)噲D找到一種既簡(jiǎn)便又快速、又有足夠分辨力的技術(shù)來鑒別和區(qū)分各種病原微生物，各種新方法和新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，但每一種方法都有其局限性，為了彌補(bǔ)各自的不足，使用一種以上的技術(shù)即采用多種方法聯(lián)合使用的策略,一種技術(shù)的缺點(diǎn)會(huì)被其他技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)所代替。選擇檢測(cè)方法應(yīng)考慮到自身所擁有的條件,檢測(cè)所要求達(dá)到的靈敏度,而提高靈敏度和去除假陽性是檢測(cè)方法發(fā)展的趨勢(shì)。近年來,隨著計(jì)算機(jī)