蛋白酶活性測定方法

1、水產(chǎn)動(dòng)物酶活性測定方法_、分析樣品的采取與處理每箱隨機(jī)各取3尾異育銀鯽，稱重，于冰盤上解剖，取出腸道和肝胰臟，測定腸道長度， 剔除脂肪組織，用4C冷卻的去離子水沖洗；然后用濾紙輕輕吸去水分，放入-26C冰箱中 迅速冷卻保存，供測酶活性用。二、酶液的制備將肝胰臟及腸組織緩慢解凍后，腸道勻分三等份，從前、中、后腸分別取有代表性食 靡0.5g,放入離心塑料管中，加4ml, 4C冷卻去離子水稀釋，4C下離心20niin（13, 000g）, 上清液標(biāo)號分裝，并與4C冰箱中冷卻保存，24Hr待測。將肝胰臟及腸道組織用4C去離子水清除腸道內(nèi)容物后，用濾紙吸去表面水，取樣各 l.Ogo按樣品重量加10倍的4

2、C冷卻去離子水在冰浴下勻漿（稀釋勻漿液勻漿4nun.800ipm 勻漿玻璃管外設(shè)冰浴）。勻漿液在4C下離心20分鐘（13, 000g）,上清液標(biāo)號分裝，并于4C 冰箱冷卻保存，24Hr內(nèi)測定完畢。酶粉及飼料：取2. 0克酶粉，先用10倍PH7.0緩沖液溶解，并放在40C水浴中恒溫30分鐘，過濾 留置濾液待測。測定前再稀釋10倍，20倍，100倍即可。取2.0克飼料，加PH7.0緩沖液20ml溶解，并放在40C水浴中恒溫30分鐘，過濾留置 濾液待測。三、酶活性測定蛋白酶測定：前、中、后腸，肝胰臟。方法：福林一酚試劑法1.1原理：蛋白酶從變性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA）的氨基酸（如酪

3、氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等），這些氨基酸可用福林試劑使之發(fā)色（藍(lán)色反應(yīng)），用 分光光度計(jì)測定。1.2蛋白酶活性單位：1克食靡或組織在30C, PH在7.0的條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1微克酪氨 酸的酶量為1個(gè)酶活力單位。13試劑福林試劑（己配）0.4M碳酸鈉溶液：取無水碳酸鈉（NsCCh） 42.4g用水溶解和定容至1, OOOnil,存放與具膠塞的試劑瓶中。0.1M三氯醋酸（TCA）：用小燒杯稱取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容為1, OOOnil cL酪氨酸。緩沖液：磷酸二氫鈣一氫氧化鈉緩沖液。 TOC o 1-5 h z A： 0.2mobL KH2PO4 (nil):50;B： 0.

4、2mobL NaOH(nil)29.63C：水(ml)120.37PH (20C )：7.0酪蛋白溶液：精確稱取酪素2.000g,先用少量0.5N氫氧化鈉浸潤后，加入少量緩沖液，在沸水浴中加熱，經(jīng)常但不要?jiǎng)×业臄嚢枋怪耆芙?，冷卻 后移入1001111容量瓶中，并用相應(yīng)的緩沖液定容到刻度。若定容時(shí)泡沫過 多，可加入12滴乙醇消泡。酪蛋白溶液可在4C保存一周，變質(zhì)后不能使 用。1.4標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸曲線的繪制將精確稱取L酪氨酸（先在105C干燥23Hr） lOOmg小心地溶于60ml O.lmoVL HCL中制得酪氨酸溶液。酪氨酸必須完全干燥并且是色譜級 另L 一定要酪氨酸完全溶解，并且用去離子水稀

5、釋至1L ,該溶液含酪 氨酸100微克/毫升。根據(jù)下面的規(guī)定，從上述儲備溶液制備含酪氨酸10、20、30、40、50、 70、80微克/亳升。移取上述溶液21111,加入一系列試管中，加5ml 0.4M Na2CO3然后加稀釋 的福林試劑1ml至各試管，立即混合均勻，并在30C恒溫水浴中顯色 20nun,以721型（或72型）分光光度計(jì)在波長680nm處測定光密度（O。 D值）。計(jì)算K值；以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，酪氨酸溶度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 微克數(shù)，確定K值。1.5操作步驟將酪蛋白溶液放入30C恒溫水浴中預(yù)熱5mm,取lull酶液注入試管中, 按以下程序操作。酶液lull在30C恒溫水浴中預(yù)熱

6、12111U1+2%酪蛋白1ml加入時(shí)立即記時(shí)，精確反應(yīng)lOmin+ 0.4MTCA 2nil立即搖勻，終止反應(yīng)。將各管劇烈混合并在30C保持30mm,以完全沉淀反應(yīng)后過量的酪蛋白。 從水浴中取出靜止10mm過濾（11cm的whatinan43#濾紙） +濾液lull0.4M Na2CO3 5nil稀釋福林試劑lull搖勻，30C恒溫水浴顯色20分鐘測定OD值用720型分光光度計(jì)測定（波長6801U11）試驗(yàn)。空白試驗(yàn)：酶液1ml，先向其中加入三氯醋酸，然后加酪蛋白溶液。其余步驟同試驗(yàn)。1.6計(jì)算公式（公式1）活力單位=4/10 XKXODX ivm其中：4反應(yīng)總體枳為4ml10反應(yīng)的時(shí)間為l

7、OniuiK比色計(jì)常數(shù)n酶液稀釋倍數(shù)m樣品的質(zhì)量（g）（公式2）活力單位=A X 4 X wlO/m其中：A酶活力測定的光密度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得響應(yīng)的酪蛋白的微克數(shù)。4反應(yīng)的總體枳反應(yīng)10分鐘酶稀釋倍數(shù)m樣品的質(zhì)量（g）2碘一淀粉比色法測定淀粉酶2. 1原理淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麥芽糖及糊精，在底物濃度己知并且過量的情況 下，加入碘液與未水解的淀粉生成藍(lán)色復(fù)合物，根據(jù)藍(lán)色的深淺可推算出水解的淀粉量，從 而計(jì)算AMS的活力。2試劑0.4mg/inl底物緩沖液：60mlX2瓶，4C冰箱保存。O.lmol/L碘儲備液：7mlX2瓶，4C避光保存。O.Olmotr碘應(yīng)用液的配制：將儲備液：蒸循

8、水=1： 9稀釋，4C避光保存。2. 3操作測定管（U管）空白管（0）管底物緩沖液（1111）30 C預(yù)溫5分鐘1.01.0酶液（ml）0.02混勻，30C水浴，準(zhǔn)確反應(yīng)7.5分鐘碘應(yīng)用液（ml）1.01.0蒸餡水6.06.02混勻在660mn波長，1cm光徑，蒸循水調(diào)零測光密度。2. 4活性單位：1克食靡或組織中AMS,在30C與底物作用1mm,水解Img淀粉為1個(gè)單位。2- 5計(jì)算公式（空白管吸光度一測定管吸光度）X0.4Xlniui X 4 XFAMS u/dl= 空白管吸光度X1.0X 7.5min X 0.02 X M注：0.4底物緩沖液濃度1.0活性單位定義水解Img淀粉量4酶液稀釋了4倍0.02酶液F測定時(shí)稀釋的倍數(shù)W-樣品重量（g）3脂肪酶活性測定加5mL0.025 mol/LpH 7.5磷酸緩沖液和4mL聚乙烯醇橄欖油乳化液于100 mL錐形瓶中，置反應(yīng)溫度(375 水浴中預(yù)熱510mm,然后加入勻漿粗酶液 ImL,準(zhǔn)確反應(yīng)30mm后，立即加入