核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)課件

1、核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識核酸是存在于細(xì)胞中的一類大分子酸性物質(zhì)，包括核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）兩大類。RNA和DNA都是以單核苷酸(nucleotide)為基本單位所組成的多核苷酸長鏈。RNA主要參與遺傳信息的表達，而DNA則是遺傳信息的載體。DNA主要存在于細(xì)胞核中，線粒體、葉綠體、質(zhì)粒中也有少量DNA。RNA主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。在自然界中，人、動物、植物和微生物都含有核酸。核酸占細(xì)胞干重的515。第一節(jié) 概 述核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識2核酸是存在于細(xì)胞中的一類大分子酸性物質(zhì)，包括核

2、糖核酸（rib一、核酸的元素組成 組成核酸的基本元素：C、H、O、N、P； 其中P 的含量比較穩(wěn)定，占9%-10%，通過測定P 的 含量來推算核酸的含量（定磷法）。 DNA平均含磷量為9.9%，RNA為9.4%。 任何核酸都含磷酸，所以核酸呈酸性。二、核酸的基本組成單位-核苷酸 核酸部分水解產(chǎn)生核苷酸，核苷酸進一步水解生成核苷和磷酸。核苷再水解生成堿基(嘌呤堿和嘧啶堿)和戊糖(核糖或脫氧核糖)。核酸的各種水解產(chǎn)物可用層析或電泳等方法分離鑒定。核酸的逐步水解過程可表示如下：核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識3一、核酸的元素組成核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識3核酸核苷酸磷酸核苷堿基戊糖 核糖嘌呤嘧啶核酸完全水解產(chǎn)物:脫氧

3、核糖核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識4核酸核苷酸磷酸核苷堿基戊糖 核糖嘌呤嘧啶核酸完全水解產(chǎn)物:脫 核苷酸是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位，核酸是一類多聚核苷酸。RNA和DNA的基本化學(xué)組成見表。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識5 核苷酸是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位，核酸是一類多聚（一）核糖和脫氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12-D-2-核糖-D-2-脫氧核糖O核糖 + H +糠醛甲基間苯二酚FeCl3綠色產(chǎn)物脫氧核糖 + H+ -羥基-酮戊醛二苯胺藍色產(chǎn)物RNA和DNA定性、定量測定核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識6（一）核糖和脫氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2C（二）嘌呤堿和嘧啶堿NNNNHHHHNNNNHH

4、HH123456789嘌呤NH2腺嘌呤 adenine（A）NNNNHHHHOH2N鳥嘌呤 guanine（G）核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識7（二）嘌呤堿和嘧啶堿NNNNHHHHNNNNHHHH1234NNHHHH嘧啶123456NNHHHHNH2OH胞嘧啶 Cytosine（C）尿嘧啶 uracil（U）NNHHHHOOHHNNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶 thymine（T）核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識8NNHHHH嘧啶123456NNHHHHNH2OH胞嘧啶 CNNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式稀有堿基：除五種基本的堿基外，核酸中還有些含量甚少的堿基，稱為稀有堿基。很多稀有堿基是甲基化

5、堿基。一些稀有堿基的結(jié)構(gòu)式如下：核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識9NNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式稀有堿基：（三）核苷 戊糖和堿基縮合而成的糖苷稱為核苷(nucleoside)。戊糖和堿基之間的連接是戊糖的第一位碳原子(C-1)與嘧啶堿的第一位氮原子(N-1)或嘌呤堿的第九位氮原子(N-9)相連接，戊糖和堿基之間的連接鍵是N-C鍵，故生成的化學(xué)鍵稱為，N-糖苷鍵。應(yīng)用X射線衍射法證明，核苷中的堿基與糖環(huán)平面互相垂直。根據(jù)核苷中所含戊糖不同，將核苷分為核糖核苷和脫氧核糖核苷兩類。OHOH2COHOHOH12345核 糖NNOOHHH尿嘧啶H1尿苷(1,N1-糖苷鍵) 核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識1

6、0（三）核苷 戊糖和堿基縮合而成的糖苷稱為核苷(nu天然核苷：一般為反式構(gòu)象核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識11天然核苷：一般為反式構(gòu)象核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識11修飾核苷（modified nucleoside）： 也稱稀有核苷（minor nucleoside） 修飾核苷包括三種情況:（1）由修飾堿基和糖組成的核苷核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識12修飾核苷（modified nucleoside）： 修飾核OHOH2COHOH12345核 糖NCOONHHH51OH假尿苷（）（2）由非修飾堿基和2-O-甲基 核糖組成的核苷 （3）由堿基與糖連接方式特殊的核苷 核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識13OHOH2COHOH12345核

7、 糖NCOONHRNA中主要的核糖核苷有四種：腺嘌呤核苷(adenosine，A)、鳥嘌呤核苷(guanosine，G)、胞嘧啶核苷(cytidine，C)和尿嘧啶核苷(uridine，U)。其結(jié)構(gòu)式如下： A G C U 腺苷 鳥苷 胞苷 尿苷核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識14RNA中主要的核糖核苷有四種：腺嘌呤核苷(adenosine DNA中主要的脫氧核糖核苷也有四種：腺嘌呤脫氧核苷(deoxyadenosine，dA)、鳥嘌呤脫氧核苷(deoxyguanosine，dG)、胞嘧啶脫氧核苷(deoxycytidine，dC)、胸腺嘧啶脫氧核苷(deoxythymidine，dT) 。其結(jié)構(gòu)式 如下

8、： (A) (G) (C) (T)核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識15 DNA中主要的脫氧核糖核苷也有四種：腺嘌呤(四) 核苷酸 核苷中戊糖的羥基磷酸酯化，就形成核苷酸。即核苷酸是核苷的磷酸酯。根據(jù)核苷酸中的戊糖不同，核苷酸可分為兩大類：核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸。由于核糖中有三個游離的羥基(2、3和5)，因此核糖核苷酸有2-核苷酸、3-核苷酸和5-核苷酸三種。而脫氧核糖只有3和5兩個游離羥基可被酯化，因此只有3-脫氧核苷酸和5-脫氧核苷酸兩種。自然界存在的游離核苷酸為5-核苷酸，一般其代號可略5。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識16(四) 核苷酸 核苷中戊糖的羥基磷酸酯化，就(2-AMP)(3-AMP)(5-AMP

9、)Deoxyadenosine 3- monphosphate (3- dAMP)Deoxyadenosine 5- monphosphate (5- dAMP)核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識17(2-AMP)(3-AMP)(5-AMP)Deoxya核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識18核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識18三、核苷酸的性質(zhì) (一) 一般性狀 核者酸為無色粉末或結(jié)晶，易溶于水，不溶于有機溶劑。由于戊糖含有不對稱碳原子，因此核苷酸溶液具有旋光性。 (二) 紫外吸收 由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，因此堿基、核苷和核苷酸在240290nm波段有吸收峰，其最大吸收值在260nm附近，不同的核苷酸有不同的吸收特性。因此，可

10、以用紫外分光光度法對核苷酸作定性和定量測定。 1核苷酸的定量測定 精確稱取核苷酸若干毫克，用0.01mol/L鹽酸定容至一定體積，在波長260nm下測定樣品的吸收度，根據(jù)核苷酸的摩爾吸收系數(shù)可以計算出樣品中核苷酸的百分含量。計算公式為： 核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識19三、核苷酸的性質(zhì) (一) 一般性狀 核者酸為無色式中 A260 所測樣品的吸收度； M 所測核苷酸的分子量； E260所測核苷酸的摩爾吸收系數(shù)； C 所測核苷酸的樣品濃度(mgm1)。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識20式中 A260 所測樣品的吸收度；核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識22核苷酸的定性鑒定 由于不同的核苷酸有其獨特的紫外吸收曲線，因此，選定某兩

11、個波長的吸收值之比，可以用作鑒定不同核苷酸的指標(biāo)。其標(biāo)準(zhǔn)比值見表。由于溶液的pH會影響核苷酸的解離狀態(tài)，因而影響其紫外吸收特性，所以測定時要嚴(yán)格控制溶液的pH值。250/260 280/260 290/2602.07.02.07.02.07.05-CMP0.460.842.100.991.550.305-AMP0.850.800.220.150.030.0035-UMP0.740.730.380.400.030.035-GMP1.221.150.680.680.400.28光密度 比值pH核苷酸核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識212核苷酸的定性鑒定 由于不同的核苷酸有其獨(三) 核苷酸的互變異構(gòu)作用 堿基

12、上帶有酮基的核苷酸能轉(zhuǎn)化為烯醇式。在溶液中，酮式和烯醇式兩種互變異構(gòu)體常同時存在，處于平衡態(tài)。在生物體內(nèi)，核酸結(jié)構(gòu)中的核苷酸主要是酮式。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識22(三) 核苷酸的互變異構(gòu)作用 堿基上帶有酮基的核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識23核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識23(四)核苷酸的兩性解離和等電點 核苷酸中含有磷酸基，使核苷酸具有較強的酸性。在核苷酸中，兩個磷酸基解離常數(shù)分別為pK10.71.6，pK25.96.5。 由于核苷酸含有堿基和磷酸基，因此，核苷酸為兩性電解質(zhì)，它們在不同pH值的溶液中解離程度不同，在一定條件下可形成兼性離子。當(dāng)處在等電點時，腺苷酸、鳥苷酸、胞苷酸主要是兼性離子存在。尿苷酸的堿基堿

13、性極弱，測不出含氮環(huán)的解離曲線。所以不能形成兼性離子。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識24(四)核苷酸的兩性解離和等電點 核苷酸中含有磷胞嘧啶核苷酸的解離: 核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識25胞嘧啶核苷酸的解離: 核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識25可在pH2.05.0之間分離各種核苷酸 pH3.5時各核苷酸所帶電荷 核苷酸 磷酸基電荷 堿基的電荷 凈電荷 AMP-1+0.54-0.46GMP-1+0.05-0.95CMP-1+0.84-0.16UMP-1+0-1核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識26可在pH2.05.0之間分離各種核苷酸 pH3.5時各核苷四、生物體內(nèi)重要的核苷酸衍生物(一) 5-二磷酸核苷類和5-三磷酸核苷類 5-核苷酸

14、又可按其在5位縮合的磷酸基的多少，分為一磷酸核苷（核苷酸）、二磷酸核苷和三磷酸核苷。 OHOH2COHOHOH12345核 糖NNNNHNHH9腺嘌呤胸 苷PO-OO腺苷-5-磷酸AMPOP O-OOADPATPP O-OO核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識27四、生物體內(nèi)重要的核苷酸衍生物(一) 5-二磷酸核苷類和5 各種核苷三磷酸和脫氧核苷三磷酸是體內(nèi)合成RNA和DNA合成的直接原料。在體內(nèi)能量代謝中的作用：ATP能量“貨幣”UTP參加糖的互相轉(zhuǎn)化與合成CTP參加磷脂的合成GTP參加蛋白質(zhì)和嘌呤的合成第二信使cAMP 核苷三磷酸化合物在生物體內(nèi)的能量代謝中起著重要的作用。體內(nèi)物質(zhì)氧化時所產(chǎn)生的能量一般不

15、能直接用于生理活動，但釋放出來的能量可供ADP磷酸化形成ATP。因此體內(nèi)物質(zhì)氧化所放出的能量先儲存于ATP中，當(dāng)體內(nèi)需要能量時，ATP水解釋放出能量以滿足生理活動的需要?？梢?，ATP在生物體內(nèi)化學(xué)能的儲存和利用中起著關(guān)鍵的作用。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識28 各種核苷三磷酸和脫氧核苷三磷酸是體內(nèi)合成R核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識29核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識29 ATP的磷酸酯鍵顯示出高的水解性能，可以從它的特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)來解釋。a靜電效應(yīng)：在生理pH(7.35)條件下，ATP的磷酸根中4個可離解質(zhì)子全部離解，因此共帶有4個負(fù)電荷。這些負(fù)電荷之間靜電排斥作用使磷酸酯鍵處于高勢能狀態(tài)。b共振穩(wěn)定因素：ATP離解成AD

16、P和磷酸或AMP和焦磷酸以后，共振穩(wěn)定性大大增加。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識30 ATP的磷酸酯鍵顯示出高的水解性能，可以從核苷酸的命名及縮寫符號脫氧堿基磷酸基數(shù)目磷酸dAMPGDTTCU核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識31核苷酸的命名及縮寫符號脫氧堿基磷酸基數(shù)目磷酸dAMPGDTT(二) 環(huán)化核苷酸 環(huán)化核苷酸如環(huán)化腺苷酸和環(huán)化鳥苷酸普遍存在于動植物和微生物細(xì)胞中。它們的結(jié)構(gòu)式如下：環(huán)一磷酸腺苷 環(huán)一磷酸鳥苷 環(huán)化核苷酸有重要的生理功能，它們參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生理生化過程而控制生物的生長、分化和細(xì)胞對激素的效應(yīng)。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識32(二) 環(huán)化核苷酸 環(huán)化核苷酸如環(huán)化腺苷酸和第二節(jié) 核酸的結(jié)構(gòu)一、 DNA的結(jié)構(gòu)

17、 (一) DNA的堿基組成 (二) DNA的一級結(jié)構(gòu)(三)DNA的二級結(jié)構(gòu) (四) DNA的三級結(jié)構(gòu)二、 RNA的結(jié)構(gòu) (一) RNA的類型 (二) RNA的堿基組成(三) RNA的一級結(jié)構(gòu) (四) RNA的構(gòu)象三、核酸中核苷酸順序的測定 (一) RNA的核苷酸順序測定(二) DNA的核苷酸順序測定核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識33第二節(jié) 核酸的結(jié)構(gòu)一、 DNA的結(jié)構(gòu) 一、DNA的結(jié)構(gòu)(一) DNA的堿基組成 DNA由四種主要的堿基(腺嘌呤、 鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)組成。此外，還含有少量稀有堿基。應(yīng)用紙層析和紫外分光光度法對多種生物DNA的堿基組成進行定量測定，總結(jié)出如下規(guī)律：(1)所有DNA中腺嘌

18、呤和胸腺嘧啶的摩爾含量相等，即AT；鳥嘌呤和胞嘧啶(包括5-甲基胞嘧啶)的摩爾含量相等，即GC。因此，嘌呤總數(shù)等于嘧啶總數(shù)，即A+GC+T。 (2)DNA的堿基組成具有種屬特異性，即不同生物的DNA具有自己獨特的堿基組成。 (3)DNA的堿基組成沒有組織特異性，即同生物體的不同器官、不同組織的DNA具有相同的堿基組成。 所有DNA中AT，GC這一規(guī)律的發(fā)現(xiàn)，為DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的建立提供了重要的根據(jù)。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識34一、DNA的結(jié)構(gòu)(一) DNA的堿基組成 DNA由四種(二) DNA的一級結(jié)構(gòu)(Primary structure) DNA的一級結(jié)構(gòu)是指DNA分子中核苷酸排列的順序。由

19、于核苷酸間的差異主要是堿基不同，也稱堿基序列。實驗表明，核酸中一分子核苷酸的3-位羥基與另一分子核苷酸的5-位磷酸基通過脫水可形成3,5-磷酸二酯鍵，從而將兩分子核苷酸連接起來。因此在DNA鏈中，除了第一個和最后一個核苷酸外，所有核苷酸的3，5-羥基都參與磷酸二酯鍵。第一個核苷酸的5-磷酸基不連到別的核苷酸上，而最后一個核苷酸則有一個自由的3-羥基。所以DNA鏈有方向性或極性，它有5端和3端。DNA是由數(shù)量極其龐大的四種脫氧核糖核苷酸，通過3，5-磷酸二酯鍵彼此連接起來的直線形或環(huán)形分子，DNA沒有側(cè)鏈。DNA中有4種類型的核苷酸，有n個核苷酸組成的DNA鏈中可能有的不同序列總數(shù)為4n。下圖表

20、示DNA多核苷酸鏈的一個小片段。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識35(二) DNA的一級結(jié)構(gòu)(Primary structureHO-O OCH2 TO=PO-35OHHO-O OCH2 GO=PO-35OHO OCH2OHH AO=POO-35351PPPOHATGd-pGpTpAOHd-pG-T-Ad-pGTA核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識36HO-O OCH2 TO=PO-35OHHO-O 核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識37核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識37寫出二核苷酸d-ApTp的結(jié)構(gòu)核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識38寫出二核苷酸d-ApTp的結(jié)構(gòu)核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識38(三)DNA的二級結(jié)構(gòu) 1953年，J. Watson和F. Cr

21、ick 在前人研究工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)DNA結(jié)晶的X-衍射圖譜和分子模型，提出了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，并對模型的生物學(xué)意義作出了科學(xué)的解釋和預(yù)測。 DNA二級結(jié)構(gòu)的WatsonCrick模型 B-型DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點： (1)DNA分子由兩條脫氧多核苷酸鏈構(gòu)成，兩條鏈都是右手螺旋，這兩條鏈反向平行(即一條為5-3，另一條為3-5)，圍繞同一個中心軸構(gòu)成雙螺旋結(jié)構(gòu)，鏈之間的螺旋形成一條大溝和一條小溝。 (2)磷酸基和脫氧核糖在外側(cè)，彼此之間通過磷酸二酯鍵相連接，形成DNA的骨架。堿基連接在糖環(huán)的內(nèi)側(cè)。糖環(huán)平面與堿基平面相互垂直。(3)雙螺旋的直徑為2nm。順軸方向，每隔0.34nm

22、有一個核苷酸，兩個相鄰核苷酸之間的夾角為36。每一圈雙螺旋有10對核苷酸，每圈高度為34nm。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識39(三)DNA的二級結(jié)構(gòu)核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識39(4)兩條鏈由堿基間的氫鍵相連，而且堿基間形成氫鍵有一定規(guī)律：腺嘌呤與胸腺嘧啶成對，鳥嘌呤與胞嘧啶成對。A和T間形成兩個氫鍵，G和C間形成三個氫鍵。這種堿基之間互相配對稱為堿基互補。 (5)沿螺旋軸方向觀察，配對的堿基并不充滿雙螺旋的全部空間。由于堿基對的方向性，使得堿基對占據(jù)的空間不對稱，因此在雙螺旋的表面形成大溝和小溝。雙螺旋表面的溝對DNA和蛋白質(zhì)相互識別是很重要的。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識40(4)兩條鏈由堿基間的氫鍵相連，而且

23、堿基間形成氫鍵有一定規(guī)律B型DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模式圖核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識41B型DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模式圖核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識41堿基配對及氫鍵形成核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識42堿基配對及氫鍵形成核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識42DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素： DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)是很穩(wěn)定的。主要有三種作用力使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)維持穩(wěn)定。一種作用力是互補堿基之間的氫鍵，但氫鍵并不是DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要作用力，因為氫鍵的能量很小。DNA分子中堿基的堆集可以使堿基締合，這種力稱為堿基堆集力，是使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要作用力。堿基堆集力是由于雜環(huán)堿基的電子之間相互作用所引起的。DNA分子中堿基層層堆集，在DNA分子內(nèi)部

24、形成一個疏水核心。疏水核心內(nèi)幾乎沒有游離的水分子，這有利于互補堿基間形成氫鍵。第三種使DNA分子穩(wěn)定的力是磷酸基的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子的正電荷之間形成的離子鍵。它可以減少DNA分子雙鏈間的靜電斥力，因而對DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)也有一定的穩(wěn)定作用。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識43DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素：核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識43DNA雙螺旋的種類: 目前已知DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)可分為A、B、C、D及Z型等數(shù)種，除Z型為左手雙螺旋外，其余均為右手雙螺旋。 外形堿基距離直徑nm螺旋方向螺距nm堿基數(shù)目螺旋表面A型短粗0.232.55右手2.4611大小溝B型適中0.342.00右手3.4010.4大小溝Z-DNA

25、細(xì)長0.381.84左手4.5612小溝深核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識44DNA雙螺旋的種類: 目前已知DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)可分為A、B、核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識45核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識45(四) DNA的三級結(jié)構(gòu) DNA的二級結(jié)構(gòu)指雙螺旋結(jié)構(gòu)。雙螺旋鏈的扭曲或再次螺旋就構(gòu)成了DNA的三級結(jié)構(gòu)。超螺旋是DNA三級結(jié)構(gòu)的一種形式。超螺旋螺旋核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識46(四) DNA的三級結(jié)構(gòu) DNA的二級結(jié)構(gòu)指 大部分原核生物的DNA是共價封閉的環(huán)狀雙螺旋，這種雙螺旋還可以再次螺旋化形成超螺旋(superhelix 或supercoil) 。當(dāng)引進的張力與原先右手螺旋的方向相同時，超螺旋的方向是左手的，稱為正超螺旋

26、（變緊）(positive supercoil)；引進張力與原先右手螺旋方向相反時，超螺旋的方向是右手的，稱為負(fù)超螺旋（變松）(negative supercoil)。正超螺旋是旋緊雙螺旋后形成的，負(fù)超螺旋是放松雙螺旋后形成的。 DNA超螺旋結(jié)構(gòu)形成的重要意義: 使DNA形成高度致密狀態(tài)從而得以裝入核中； 推動DNA結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化以滿足功能上的需要。如負(fù)超螺旋分子所受張力會引起互補鏈分開導(dǎo)致局部變性，利于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識47 大部分原核生物的DNA是共價封閉的環(huán)狀雙螺旋松弛環(huán)形115201052315101520251510152023右手旋轉(zhuǎn)擰松兩匝后的線形DNA解鏈環(huán)形1510

27、152023負(fù)超螺旋12148231613核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識48松弛環(huán)形11520105231510152025151015部分解鏈超螺旋松弛型核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識49部分解鏈超螺旋松弛型核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識49絕大多數(shù)原核生物的DNA都是共價封閉的環(huán)狀雙螺旋。如果再進一步盤繞則形成麻花狀的超螺旋結(jié)構(gòu)。 原核生物DNA的高級結(jié)構(gòu)：核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識50絕大多數(shù)原核生物的DNA都是共價封閉的環(huán)狀雙螺旋。如果再進一DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝：生物體內(nèi)的核酸通常都與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，以核蛋白（nucleoprotein）的形式存在。DNA分子十分巨大，與蛋白質(zhì)結(jié)合后被組裝到有限的空間中。

28、在真核生物中，雙螺旋的DNA分子圍繞一蛋白質(zhì)八聚體進行盤繞，從而形成特殊的串珠狀結(jié)構(gòu)，稱為核小體(nucleosome)。核小體結(jié)構(gòu)屬于DNA的高級結(jié)構(gòu)。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識51DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝：生物體內(nèi)的核酸通常都與蛋白質(zhì)DNA的功能DNA的基本功能是作為遺傳信息的載體，為生物遺傳信息復(fù)制以及基因信息的轉(zhuǎn)錄提供模板。DNA分子中具有特定生物學(xué)功能的片段稱為基因(gene)。一個生物體的全部DNA序列稱為基因組(genome)?；蚪M的大小與生物的復(fù)雜性有關(guān)，如病毒SV40的基因組大小為5.1103bp，大腸桿菌為5.7106bp，人為3.2109bp。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識52D

29、NA的功能DNA的基本功能是作為遺傳信息的載體，為生物遺傳二、RNA的結(jié)構(gòu) (一) RNA的類型 根據(jù)結(jié)構(gòu)、功能不同，動物、植物和微生物細(xì)胞的RNA主要有三類：核蛋白體RNA(rRNA)，轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)，信使RNA(mRNA)。 1核蛋白體RNA ( rRNA) 核蛋白體RNA是細(xì)胞中主要的一類RNA，rRNA占細(xì)胞中全部RNA的80左右，是一類代謝穩(wěn)定、分子量最大的RNA，存在于核蛋白體內(nèi)。核蛋白體(ribosome)又稱為核糖體或核糖核蛋白體。它是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成的場所。核蛋白體由兩個亞基組成，一個稱為大亞基，另一個稱為小亞基，兩個亞基都含有rRNA和蛋白質(zhì)，但其種類和數(shù)量卻不

30、相同。 核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識53二、RNA的結(jié)構(gòu) (一) RNA的類型 核酸化學(xué)主2轉(zhuǎn)運RNA(tRNA) 轉(zhuǎn)運RNA是細(xì)胞中一類最小的RNA，tRNA一般由7393個核苷酸構(gòu)成，分子量2300028000 ，但含有稀有堿基最多的RNA，其稀有堿基的含量可多達20%。 tRNA約占細(xì)胞中RNA總量的15。在蛋白質(zhì)生物合成中tRNA起攜帶氨基酸的作用。細(xì)胞內(nèi)tRNA的種類很多，每一種氨基酸都有與其相對應(yīng)的一種或幾種tRNA。 3信使RNA mRNA在細(xì)胞中含量很少，占RNA總量的35。mRNA在代謝上很不穩(wěn)定，它是合成蛋白質(zhì)的模板，每種多肽鏈都由一種特定的mRNA負(fù)責(zé)編碼。因此，細(xì)胞內(nèi)mRNA的

31、種類很多。mRNA的分子量極不均一，其沉降系數(shù)在425S間，mRNA的平均分子量約500000。 核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識542轉(zhuǎn)運RNA(tRNA) 轉(zhuǎn)運RNA是 除上述三類RNA以外，細(xì)胞內(nèi)還有一些其他類型的RNA，如細(xì)胞核內(nèi)的不均一核RNA(HnRNA)、小分子核RNA(LnRNA)和染色質(zhì)RNA(ChRNA)等。核蛋白體RNA信使RNA轉(zhuǎn)運RNA核內(nèi)不均一RNA核內(nèi)小RNA胞漿小RNA 細(xì)胞核和胞液線粒體功能rRNAmRNA mtrRNAtRNAmtmRNAmttRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核蛋白體組分蛋白質(zhì)合成模板轉(zhuǎn)運氨基酸成熟mRNA的前體參與hn

32、RNA的剪接、轉(zhuǎn)運rRNA的加工、修飾蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號識別體的組分核仁小RNA核蛋白體RNA信使RNA轉(zhuǎn)運RNA核內(nèi)不均一RNA核內(nèi)小RNA胞漿小RNA 細(xì)胞核和胞液線粒體功能rRNAmRNA mtrRNAtRNAmtmRNAmttRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核蛋白體組分蛋白質(zhì)合成模板轉(zhuǎn)運氨基酸成熟mRNA的前體參與hnRNA的剪接、轉(zhuǎn)運rRNA的加工、修飾蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號識別體的組分核仁小RNARNA的種類、分布與功能核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識55 除上述三類RNA以外，細(xì)胞內(nèi)還有一些其他類型的(二) RNA的堿基組成 RNA中含有腺嘌呤、

33、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶四種基本堿基。此外，目前已發(fā)現(xiàn)RNA中有60多種稀有堿基。(三) RNA的一級結(jié)構(gòu) RNA分子由許多核苷酸構(gòu)成，實驗證明，核苷酸之間也是通過磷酸二酯鍵連接，一個核苷酸C5的磷酸基與相鄰的核苷酸的C3的羥基結(jié)合成3，5-磷酸二酯鍵。下圖所示為RNA分子中多核苷酸鏈的一小片段。 RNA分子的一級結(jié)構(gòu)就是指多核苷酸鏈中核苷酸的排列順序。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識56(二) RNA的堿基組成 RNA中含有腺嘌圖 RNA分子中多核苷酸鏈的小片段pApGpCp核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識57圖 RNA分子中多核苷酸鏈的小片段pApGpCp核酸化學(xué)主(四) RNA的構(gòu)象 根據(jù)RNA的某些理化性質(zhì)和X

34、射線衍射分析證明大多數(shù)天然RNA分子是單鏈。多核苷酸鏈可以發(fā)生自身回折，使可以配對的一些堿基相遇，堿基按一定規(guī)律，A與U之間形成氫鍵，G與C之間也可以形成氫鍵連接起來，構(gòu)成雙螺旋區(qū)；不能配對的堿基則形成環(huán)狀突起，這種構(gòu)象就是RNA的二級結(jié)構(gòu)。RNA中的雙螺旋結(jié)構(gòu)為A-DNA類型的結(jié)構(gòu)。每一段螺旋區(qū)至少需要有46對堿基才能保持穩(wěn)定。不同的RNA分子，雙螺旋區(qū)所占比例不同，如rRNA中雙螺旋區(qū)占40左右，tRNA中占50左右，煙草花葉病毒RNA中占60左右。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識58(四) RNA的構(gòu)象 根據(jù)RNA的某些理化性質(zhì)核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識59核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識591. tRNA的二級結(jié)構(gòu)

35、tRNA的二級結(jié)構(gòu)由于局部雙螺旋的形成而呈現(xiàn)“三葉草”形，故稱為“三葉草”結(jié)構(gòu)。tRNA的“三葉草”形結(jié)構(gòu)包括： 1.四臂四環(huán)；2.氨基酸臂； 3.D環(huán)上有二氫尿嘧啶（ DHU臂） ； 4.反密碼環(huán)上的反密碼子與mRNA相互作用(反密碼臂)； 5.可變環(huán)上的核苷酸數(shù)目可以變動(可變臂)和6. TC臂五部分。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識601. tRNA的二級結(jié)構(gòu)tRNA的二級結(jié)構(gòu)由于局部雙螺旋的形攜帶氨基酸辨認(rèn)并結(jié)合氨基酰tRNA合成酶識別mRNA上的密碼識別并結(jié)合核蛋白體氨基酸臂DHU臂反密碼臂可變臂TC臂核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識61攜帶氨基酸辨認(rèn)并結(jié)合氨基酰tRNA合成酶識別mRNA上的密碼（1）氨基

36、酸臂或氨基酸莖，由3-端和5-端堿基組成7對互補堿基對的雙螺旋區(qū)，富含鳥嘌呤，末端為CpCpA-OH，接受活化的氨基酸。（2）二氫尿嘧啶環(huán)，由812個核苷酸組成，含有二氫尿嘧啶。由34對堿基組成的雙螺旋區(qū)與tRNA其余部分相連，這個雙螺旋區(qū)叫二氫尿嘧啶臂（莖）。（3）反密碼子環(huán)，由 7個核苷酸組成，環(huán)中部由 3個堿基組成反密碼子，反密碼子在蛋白質(zhì)（肽）合成中能與rnRNA上的密碼子配對。次黃嘌呤常出現(xiàn)于此環(huán)中。5對堿基組成的雙螺旋區(qū)叫反密碼子臂（莖），反密碼子環(huán)由此莖與tRNA分子的其他部分相連。（4）額外環(huán)，又叫可變環(huán)（或叉），由318個核苷酸組成，是tRNA分類的重要指標(biāo)。（5）假尿嘧啶核

37、苷-胸腺嘧啶核糖核苷環(huán)，即TC環(huán)，由7個核苷酸組成。有5對堿基組成的雙螺旋區(qū)叫TC臂，由此臂與tRNA的其它部分連接。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識62（1）氨基酸臂或氨基酸莖，由3-端和5-端堿基組成7對互2. tRNA的三級結(jié)構(gòu)： tRNA的三級結(jié)構(gòu)的形狀像一個倒寫的L字母。它是在二級結(jié)構(gòu)三葉草形的基礎(chǔ)上進一步扭曲、折疊而成的。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識632. tRNA的三級結(jié)構(gòu)： tRNA的三級結(jié)構(gòu)3. rRNA的結(jié)構(gòu)在原核生物中，rRNA有三種：5S，16S，23S。其中，16S的rRNA參與構(gòu)成核蛋白體的小亞基，而5S和23S的rRNA參與構(gòu)成核蛋白體大亞基。在真核生物中，rRNA有四種：5S，5

38、.8S，18S，28S。其中，18S的rRNA參與構(gòu)成核蛋白體小亞基，其余的rRNA參與構(gòu)成核蛋白體大亞基。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識643. rRNA的結(jié)構(gòu)在原核生物中，rRNA有三種：5S，165sRNA的二級結(jié)構(gòu)核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識655sRNA的二級結(jié)構(gòu)核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識654. mRNA的結(jié)構(gòu)與功能mRNA可形成局部雙螺旋結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)。（1）原核細(xì)胞mRNA是多順反子，即可以編碼多條多肽鏈；真核細(xì)胞的mRNA為單順反子。（2）絕大多數(shù)真核細(xì)胞的mRNA的3-末端具有一段多聚腺苷酸（poly(A)），而且不同真核細(xì)胞的mRNA的3-末端的poly(A)長短不同。而原核細(xì)胞的mRNA一般沒

39、有poly(A)。（3）真核細(xì)胞mRNA 5-末端有一個特殊的5-“帽子”結(jié)構(gòu)?！懊弊印苯Y(jié)構(gòu)和3-末端的poly(A)都有抗核酸外切酶的作用。原核生物mRNA一般沒有“帽于”結(jié)構(gòu)。（4）真核細(xì)胞5-“帽子”結(jié)構(gòu)的下游和3-poly(A)的上游分別為5-端不編碼區(qū)和3-端不編碼區(qū)，二者之間是其編碼區(qū)。已知5-端不編碼區(qū)和“帽子”結(jié)構(gòu)是與核糖體結(jié)合的區(qū)域，與蛋白質(zhì)合成的起始有關(guān)。至于3-端不編碼的功能，目前仍不清楚。原核細(xì)胞由于沒有“帽子”結(jié)構(gòu)，不編碼區(qū)位于mRNA的兩端。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識664. mRNA的結(jié)構(gòu)與功能mRNA可形成局部雙螺旋結(jié)構(gòu)的二級原核與真核細(xì)胞的mRNA在結(jié)構(gòu)上的差異順反

40、子順反子順反子插入順序插入順序先導(dǎo)區(qū)末端順序53 原核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識67原核與真核細(xì)胞的mRNA在結(jié)構(gòu)上的差異順反子順反子順反子插入AAAAAAA-OH5 “帽子”PolyA 3 順反子m7G-5ppp-N-3 p 真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點原核與真核細(xì)胞的mRNA在結(jié)構(gòu)上的差異核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識68AAAAAAA-OH5 “帽子”PolyA 3 順反子m真核生物mRNA 5-端帽子結(jié)構(gòu)55m7GTP核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識69真核生物mRNA 5-端帽子結(jié)構(gòu)55m7GTP核酸化學(xué)mRNA分子中帶有遺傳密碼，其功能是為蛋白質(zhì)的合成提供模板(templet)。mRNA分

41、子中每三個相鄰的核苷酸組成一組，在蛋白質(zhì)翻譯合成時代表一個特定的氨基酸，這種核苷酸三聯(lián)體稱為遺傳密碼（coden)。某些小分子RNA具有催化特定RNA降解的活性，這種具有催化作用的小RNA被稱為核酶(ribozyme)。核酶通常具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，如錘頭結(jié)構(gòu)。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識70mRNA分子中帶有遺傳密碼，其功能是為蛋白質(zhì)的合成提供模板(三、核酸中核苷酸順序的測定(一) RNA的核苷酸順序測定 RNA一級結(jié)構(gòu)的研究借鑒了蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的研究方法，即片段重疊法。片段重迭法的一般步驟是：(1)對RNA分子進行末端測定，分析兩個末端堿基；(2)用特異核酸工具酶將RNA分子降解成小片段；(3)分離

42、酶解產(chǎn)生的各小片段；(4)分析各小片段核苷酸的含量、組成和排列順序；(5)把兩種以上不同特異酶水解的結(jié)果，運用重迭法的原理拼合成整個RNA分子的核苷酸排列順序。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識71三、核酸中核苷酸順序的測定(一) RNA的核苷酸順序測定核1. 末端分析 目前一般用同位素標(biāo)記法來測定5末端和3末端核苷酸。如用-32P-ATP，以多核苷酸激酶催化，使RNA分子或片段的5-OH標(biāo)記32P，然后經(jīng)酶解或堿水解，鑒定帶有放射性的核苷酸或核苷二磷酸即為5末端。 2酶解產(chǎn)物的分離 現(xiàn)采用的分離方法有尿素柱層析法、雙向電泳法等。(1)尿素柱層析法 在7mol/L尿素存在下，進行DEAE-纖維素或DEAE-

43、葡聚糖凝膠柱層析，用含7molL尿素的0.1mol/L三乙胺乙酸鹽緩沖液線性梯度洗脫，即可把RNA的酶解產(chǎn)物寡核苷酸混合物分開。中性尿素柱層析法可以按鏈長把10個核苷酸殘基以下的寡核苷酸分開。酸性尿素柱層析則可以把相同鏈長、不同組成的各種寡核苷酸分開。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識721. 末端分析 目前一般用同位素標(biāo)記法來測定(2)雙向電泳法 Sanger建立雙向電泳法分離放射性32P標(biāo)記的RNA酶解產(chǎn)物，該法簡便易行，已廣泛用于RNA一級結(jié)構(gòu)的測定，特別是小分子RNA的測定。此法能分離的最長片段為612個核苷酸。 (3) 凝膠電泳法 聚丙烯酰胺凝膠電泳用于RNA部分酶解產(chǎn)物(大片段)的分離。該法可按

44、鏈長將各核甘酸片段分開。根據(jù)產(chǎn)物長度不同，可選用不同濃度比例的丙烯酰胺。如果條件選得適宜，對于200個核苷酸以下的片段甚至相差一個核苷酸也能分開。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識73(2)雙向電泳法 Sanger建立雙向電泳法分3.核苷酸順序測定方法 用上述方法將RNA酶解產(chǎn)物分離后，須對每個片段作核苷酸順序測定，常用以下幾種方法。 (1) 自末端按序降解法 含有鄰位羥基的寡核苷酸片段可被過碘酸氧化成雙醛化合物。與苯胺反應(yīng)除去末端核苷酸殘基，從而鑒定游離出來的堿基，即3末端堿基。 從理論上講，過碘酸氧化法可以從RNA的3末端開始逐個測定到RNA的5末端，但實際上由于每次反應(yīng)不可能達到100完全多次循環(huán)的誤

45、差就越來越大。目前文獻報道最多是29次循環(huán)。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識743.核苷酸順序測定方法 用上述方法將RNA酶解核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識75核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識75苯 胺+N1核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識76苯 胺+N1核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識76(2) 核酸外切酶部分降解法 生物體內(nèi)存在著多種核酸水解酶(nuclease)。這些酶可以水解多聚核苷酸的磷酸二酯鍵。核酸水解酶一般可分為RNA水解酶(RNases)和DNA水解酶(DNases)。核酸水解酶還可以根據(jù)其水解核酸方式分為兩類：核酸外切酶：能夠從多聚核苷酸鏈的一端(3-端或5-端) 開始，逐步將核 酸水解下來。 核苷酸內(nèi)切酶：能夠水解多聚核苷酸鏈中某

46、種核苷酸形成的磷酸酯鍵。 如用蛇毒磷酸二酯酶(VPDase)等外切酶進行部分降解，即以限制酶量、降低溫度和控制作用時間來使RNA片段部分降解。由于條件不同而產(chǎn)生一系列不同長度的寡核苷酸片段的混合物，用凝膠電泳法將這些混合物分離后即可知其排列順序。現(xiàn)將下列八核苷酸用VPDase不完全水解，可得8種組分的混合物：核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識77(2) 核酸外切酶部分降解法 生物體內(nèi)存在著 pAGCUGACU pAGCUGAC pAGCUGA pAGCUGACU pAGCUG pAGC pAG pA 將上述各片段的混合物分離后測定每一片段的3末端，即可排出該片段的全部核苷酸順序。部分水解VPDase核酸化學(xué)

47、主題醫(yī)學(xué)知識78 (二) DNA的核苷酸順序測定 按制備DNA片段的方法不同，可以把測定DNA的核苷酸順序的方法分為酶法和化學(xué)法。1. MaxamGilbert堿基順序分析法 1975年，Maxam A和GilbertW發(fā)展了一種核酸堿基順序快速分析方法。這種方法的基本原理是應(yīng)用有機化學(xué)方法，選擇性地切斷某種特定核苷酸(A，G，C，T)所形成的磷酸酯鍵。所以此法又稱為化學(xué)降解法。 (1)嘌呤堿殘基的選擇性水解： 核酸中的嘌呤堿基和嘧啶堿基可以與硫酸二甲酯作用，但反應(yīng)條件及甲基化產(chǎn)物的性質(zhì)不同。在溫和的條件下，用硫酸二甲酯處理DNA，分別得到兩種嘌呤堿基的甲基化產(chǎn)物：N-3-甲基腺嘌呤核苷和N-

48、7-甲基鳥嘌吟核苷。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識79(二) DNA的核苷酸順序測定 按制備DNA片核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識80核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識80 不同堿基的甲基化產(chǎn)物對于水解去嘌呤堿基反應(yīng)敏感程度有明顯差別。脫去了嘌呤堿基的核糖磷酸酯鍵，在0.1 molLNaOH堿性條件下可以被水解切斷。在此條件下，其余的磷酸酯鍵不受影響。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識81 不同堿基的甲基化產(chǎn)物對于水解去嘌呤堿基反應(yīng)敏核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識82核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識82(2)嘧啶堿殘基的選擇性水解： DNA鏈用肼處理，其中的嘧啶堿殘基被脫去，生成核糖腙衍生物，再在哌啶存在下水解，核糖腙3位的磷酸酯鍵則被水解斷裂。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)

49、知識83(2)嘧啶堿殘基的選擇性水解： DNA核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識84核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識84 根據(jù)上面反應(yīng)原理，可以在不同反應(yīng)條件下，選擇性地切斷分別由四種不同的核苷酸形成的磷酸酯鍵。 注意：不論嘌呤堿基或嘧啶堿基，在選擇性水解后，在水解位點上的含氮堿基都消失了。 例如一個多聚核苷酸鏈5-ATTGACTTAGCC，在一定條件下，在G處切斷，則有以下幾種情況可能發(fā)生： 由此可見，一共可以得到6種不同的多聚核苷酸片斷(包括一條原來的DNA鏈)。它們可以用凝膠電泳方法分離，多聚核苷酸片斷的長度與它在凝膠電泳中移動的速率成反比。如下圖。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識85 根據(jù)上面反應(yīng)原理，可以在不同反應(yīng)條件下

50、，選擇 (a)用染色法檢測得到全部的DNA片斷電泳圖譜， (b)用放射性同位素標(biāo)記法檢測到的DNA片斷電泳圖譜(*)核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識86 (a)用染色法檢測得到全部的DNA片斷電泳圖譜， 2Sanger堿基順序分析法 1976年，Sanger F發(fā)展了一種新的核酸堿基順序分析法。Sanger法的基本原理是將待測定的DNA單鏈作為DNA復(fù)制的模板，在DNA聚合酶(一種催化DNA合成的酶)催化下，在有四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)和四種脫二氧核苷三磷酸(ddNTP)參與下，合成出各種長度的DNA片斷，再進行凝膠電泳和放射性顯影，從圖譜上直接讀出待測DNA的互補堿基順序。由于此法的關(guān)鍵是利用脫二

51、氧核苷三磷酸終止DNA鏈的增長而實現(xiàn)的，所以又稱為鏈終止法。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識872Sanger堿基順序分析法 1976年CCGGTAGCAATT35模板引物GG53GGCGGCCGGCCATCCddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAddATPAGGCCATCGGGCCATCGTTGGddGTPGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTTddTTPCCATCGTTGA53核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識88CCGGTAGCAATT35模板引物GG5核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識89核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識89第三節(jié) 核酸的理化性質(zhì)一、核酸分子的大小 二、核酸的溶解度與粘度三、核酸的酸堿性質(zhì) 四、核酸的紫

52、外吸收五、核酸的變性、復(fù)性和雜交核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識90第三節(jié) 核酸的理化性質(zhì)一、核酸分子的大小 二、核酸的一、核酸分子的大小 過去用苯酚和中性鹽法所制得的DNA樣品往往是部分降解了的產(chǎn)物。所以用它測得的DNA分子量(106107)往往偏低?，F(xiàn)在采用電子顯微鏡照像和放射自顯影等技術(shù)測定DNA的分子量。RNA的分子量大約從幾百到幾百萬。二、核酸的溶解度與粘度 RNA和DNA都是極性比合物，部微溶于水，而不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機溶劑。它們的鈉鹽比自由酸易于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達4。高分子溶液比普通溶液粘度要大得多，不規(guī)則線團分子比球形分子的粘度大，而線形分子的粘度更大。RNA的粘度比D

53、NA粘度小。當(dāng)DNA溶液加熱，或在其他因素作用下；發(fā)生螺旋線團轉(zhuǎn)變時，粘度降低。所以可用粘度作為DNA變性的指標(biāo)。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識91一、核酸分子的大小 過去用苯酚和中性鹽法所制得三、核酸的酸堿性質(zhì) 可以把核酸看成是多元酸，多聚核苷酸鏈中含有兩類可離解的基團。多聚核苷酸鏈的離解性質(zhì)與多肽鏈情況相似，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點。由于磷酸是一個中等強度的酸，而含氮堿基堿性很弱，因此核酸的等電點都在低pH值范圍內(nèi)。DNA的等電點為4-4.5，RNA的等電點為2-2.5。DNA和RNA等電點相差較大這一特點，在DNA和RNA分離中具有重要意義。 DNA和RNA等電點相差較大的原因，很容易從它們的

54、結(jié)構(gòu)特點來理解。RNA鏈中，核糖2-OH的氫原子能與磷酸酯中的羥基氧原子形成氫鍵，促進了磷酸酯羥基中氫原子的離解。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識92三、核酸的酸堿性質(zhì) 可以把核酸看成是多元酸，多酸或堿水解：多聚核苷酸鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下能被酸或堿水解成核苷酸。但是DNA和RNA對酸或堿的穩(wěn)定性有很大的差別。例如，在室溫條件下，用01 moLL NaOH溶液即可將RNA完全水解，得到2-或3-磷酸核苷的混合物。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識93酸或堿水解：多聚核苷酸鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下能被酸或堿水解成核苷酸四、核酸的紫外吸收 核酸分子中的嘧啶和嘌呤環(huán)的共軛體系強烈吸收260-290nm波段的紫外光，一般在260nm左右有最

55、大吸收峰。蛋白質(zhì)在280nm左右有最大吸收峰。紫外吸收光譜與分子中可解離基團的解離狀態(tài)、pH、光波波長等因素有關(guān)。利用核酸的紫外吸收特性，可以對核酸進行定量測定。上式中：A為吸收度，l為比色杯內(nèi)徑的厚度(cm) ， E(P)為摩爾磷吸收系數(shù)。 核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識94四、核酸的紫外吸收 核酸分子中的嘧啶和嘌呤 這樣，只要測定核酸溶液的磷含量和紫外吸收值，就可計算它的E(P)值。核酸在變性時，E(P)值顯著升高，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。在一定條件下，變性核酸可復(fù)性，此時E(P)值又回復(fù)至原來水平，這種現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)。所以E(P)值可作為核酸復(fù)性的指標(biāo)。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識95 這樣，只要測定核酸溶

56、液的磷含量和紫外吸收值，就五、核酸的變性、復(fù)性和雜交 (一) 變性 核酸分子具有一定的空間結(jié)構(gòu)，維持這種空間結(jié)構(gòu)的作用力主要是氫鍵和堿基堆積力。有些理化因素會破壞氫鍵和堿基堆積力，使核酸分子的空間結(jié)構(gòu)改變，從而引起核酸理化性質(zhì)和生物學(xué)功能改變，這種現(xiàn)象稱為核酸的變性。核酸變性時，其雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，但并不涉及核苷酸間共價鍵的斷裂。因此變性作用并不引起孩酸分子量降低。多核苷酸鏈的磷酸二酯鍵的斷裂叫降解。伴隨核酸的降解，核酸分子量降低。 多種因素可引起核酸變性，如加熱、過高過低的pH、有機溶劑、酰胺和尿素等。加熱引起DNA的變性稱為熱變性。隨著DNA空間結(jié)構(gòu)的改變，引起一系列性質(zhì)變化，如粘度降低，某

57、些顏色反應(yīng)增強，尤其是260nm紫外吸收增加，DNA變性后失去生物活性。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識96五、核酸的變性、復(fù)性和雜交 (一) 變性 核酸分子核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識97核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識97 DNA熱變性的過程不是一種“漸變”，而是一種“躍變”過程，就像固體的結(jié)晶物質(zhì)在其融點時突然融化一樣。通常把E(P)值達到最高值的12時的溫度稱為“熔點”或熔解溫度，用符號Tm表示。DNA的Tm值一般在7085C之間。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識98 DNA熱變性的過程不是一種“漸變”，而是一種“影響Tm的因素：（1）G-C的相對含量越多，Tm值就越高。 （G+C）% =（Tm 69.3） 2.44（2）介質(zhì)離

58、子強度低，Tm低。（3）高pH下堿基廣泛去質(zhì)子而喪失形成氫鍵的能力。（4）變性劑如甲酰胺、尿素、甲醛等破壞氫鍵，妨礙堿基堆積，使Tm下降。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識99影響Tm的因素：（1）G-C的相對含量越多，Tm值就越高。（(二) 復(fù)性將熱變性后的DNA溶液緩慢冷卻，在低于變性溫度約2530的條件下保溫一段時間（退火annealing），則變性的兩條單鏈DNA可以重新互補而形成原來的雙螺旋結(jié)構(gòu)并恢復(fù)原有的性質(zhì)。將變性DNA經(jīng)退火處理，使其重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程，稱為DNA的復(fù)性。(三)核酸的雜交 在DNA復(fù)性過程中,雙鏈分子的再形成既可以發(fā)生在序列完全互補的核酸分子之間,也可以發(fā)生在堿基序列部

59、分互補的不同的DNA之間或DNA與RNA之間 ,這種現(xiàn)象稱為分子雜交。利用這一原理，在核酸研究中可引入特制的“探針”。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識100(二) 復(fù)性將熱變性后的DNA溶液緩慢冷卻，在低于變性溫度約 在核酸雜交分析過程中，常將已知順序的核酸片段用放射性同位素或生物素進行標(biāo)記。這種帶有一定標(biāo)記的已知順序的核酸片段稱為探針（probe）。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識101 在核酸雜交分析過程中，常將已知順序的核酸片段分子雜交的“探針”變性（加熱）雜交（緩慢冷卻）復(fù)性（緩慢冷卻）探針核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識102分子雜交的“探針”變性（加熱）雜交（緩慢冷卻）復(fù)性（緩慢冷卻DNA-RNA雜交示意圖核酸化學(xué)主

60、題醫(yī)學(xué)知識103DNA-RNA雜交示意圖核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識103利用核酸的分子雜交，可以確定或?qū)ふ也煌锓N中具有同源順序的DNA或RNA片段。常用的核酸分子雜交技術(shù)有：原位雜交、斑點雜交、Southern雜交及Northern雜交等。原位雜交技術(shù)：直接用探針與菌落或組織細(xì)胞中的核酸雜交，未改變核酸所在的位置。斑點雜交：將核酸直接點在膜上，再與核酸雜交。Southern印跡法：將電泳分離后的DNA片段從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再進行雜交。Northern印跡法：將電泳分離后的RNA吸印到纖維素膜上再進行分子雜交。核酸化學(xué)主題醫(yī)學(xué)知識104利用核酸的分子雜交，可以確定或?qū)ふ也煌锓N中具有同源順