分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)和產(chǎn)前診斷

1、關(guān)于分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)與產(chǎn)前診斷第1頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四基因診斷的中心問題是認(rèn)識遺傳變異、基因突變及與表型之間的關(guān)系第2頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四一、分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)第3頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in site hybridization, FISH）：用熒光物質(zhì)標(biāo)記特異性DNA探針，與中期細(xì)胞染色體或間期細(xì)胞核雜交，鑒別和確定出生缺陷、腫瘤細(xì)胞染色體異常，分辨率可達(dá)50500 kb. 第4頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四

2、熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in site hybridization, FISH）的特異性DNA探針基因座特異性探針：克隆擴(kuò)增獲得。在基因制圖方面的努力，越來越多的這方面探針可以使用著絲粒重復(fù)序列探針：這些特異性的探針可在中期染色體和間期細(xì)胞核中產(chǎn)生強(qiáng)烈信號，可以鑒別特異性染色體。全染色體涂染探針：通過對來自特異性染色體分檢庫或僅含一條人類染色體的雜種細(xì)胞DNA擴(kuò)增制備。這種DNA序列的混合物與一條染色體上的多個位點(diǎn)同源。因此在中期核內(nèi)，整條染色體得以被涂染。通過使用不同的熒光素，在一個中期染色體涂片上可以鑒別幾條不同的染色體。第5頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)

3、15分，星期四應(yīng)用15號染色體一基因特異性探針（紅色）雜交確定其是否缺失；綠色探針鑒定15號染色體著絲粒。24種不同染色體涂染探針雜交得到的彩色染色體第6頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四染色體技術(shù)的應(yīng)用1inv(14)(p12q24)t(2; 11)(2q34; 11q13)第7頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四細(xì)胞遺傳學(xué)研究中染色體技術(shù)的應(yīng)用FISH技術(shù)檢出t(2; 14)第8頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四染色體技術(shù)的應(yīng)用2inv(9)(p12q13)第9頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四分

4、子細(xì)胞遺傳學(xué)：DMD基因第46號外顯子缺失第10頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四細(xì)胞遺傳學(xué)研究中染色體技術(shù)的應(yīng)用9號染色體涂染探針雜交。箭頭示易位到10號染色體上的來自9號染色體的片段21號染色體涂染探針FISH雜交，顯示21三體第11頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四比較基因組雜交（comparative genomic hybridization, CGH）近年在FISH技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)（1992，Kallioniemi）。其基本原理是用不同熒光物質(zhì)分別標(biāo)記腫瘤細(xì)胞DNA和正常人細(xì)胞DNA，然后與正常人中期細(xì)胞

5、染色體雜交。通過檢測染色體上兩種熒光信號的相對比值，了解腫瘤細(xì)胞DNA拷貝數(shù)的變化，并可在染色體上定位。這一技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤基因組不平衡的檢測。第12頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四比較基因組雜交的原理第13頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四 待測DNA（腫瘤細(xì)胞DNA，test DNA)為綠色 參照DNA(正常細(xì)胞DNA，reference DNA）為紅色 復(fù)染為藍(lán)色人食管鱗癌細(xì)胞株的比較基因組雜交第14頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四中期染色體的DAPI的 復(fù)染圖B. 中期染色體比較基因組雜 交（CGH）：紅色

6、區(qū)域表示 丟失，綠色區(qū)域表示擴(kuò)增。第15頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四CGH的優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)一次染色體原位雜交實(shí)驗(yàn)即可在整條染色體或染色體區(qū)帶水平對待檢基因組DNA序列拷貝數(shù)改變進(jìn)行檢測和定位。無需進(jìn)行染色體培養(yǎng)，對于不易制備良好分裂相的實(shí)體瘤尤為適用。所需染色體DNA可來自各種組織，如新鮮組織、福爾馬林固定的組織、石蠟包埋組織，可在很少量的基礎(chǔ)上檢測，利于做回顧性研究。第16頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四CGH的局限性：難以檢出以下異常：平衡易位，微小突變，基因重排，倍體水平改變。結(jié)果可能受到一些因素影響：正常細(xì)胞存在，腫瘤自身的遺傳異質(zhì)性，

7、系統(tǒng)的波動。靈敏度：限于檢測較大范圍的缺失（10 30MB）第17頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四二、突變分析與分子診斷第18頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四（一）基因突變類型點(diǎn)突變：只有一個或幾個核苷酸的改變，是突變中最多見的形式。穩(wěn)定突變：傳遞中不改變原有的突變。動態(tài)突變：傳遞中不斷改變自己，多見于短重復(fù)序列的突變，在一代代傳遞中重復(fù)次數(shù)發(fā)生明顯變化。 第19頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四點(diǎn)突變的結(jié)果：（1）同義突變（samesense mutation）：堿基替換后，雖然密碼子發(fā)生改變，但編碼氨基酸沒有改變（

8、遺傳密碼的兼并性），亦稱靜止突變。（2）錯義突變（missense mutation）：堿基替換，密碼子發(fā)生改變后，編碼氨基酸亦發(fā)生改變，編碼另一個氨基酸。 （3）無義突變（nonsense mutation）：堿基替換后，使編碼氨基酸的密碼子變成一個終止密碼子。（4）中性突變：包含兩種情況，即“同義突變”和不改變蛋白質(zhì)功能的“錯義突變”第20頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四基因突變形式堿基的插入和缺失堿基的插入和缺失：基因編碼序列中插入或丟失一個或幾個堿基，其結(jié)果是突變點(diǎn)下游堿基序列發(fā)生移碼，編碼氨基酸序列都發(fā)生改變，又稱移碼突變（frameshift mutati

9、on），并可在突變點(diǎn)下游提前出現(xiàn)終止密碼。第21頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四堿基的插入和缺失的結(jié)果：將導(dǎo)致移碼突變（frameshift mutation），并可在突變點(diǎn)下游提前出現(xiàn)終止密碼產(chǎn)生截短型蛋白缺失突變第22頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四基因突變形式框內(nèi)突變（inframe mutation）：3個或是的倍數(shù)的堿基缺失或插入導(dǎo)致的突變，使基因丟失或增加1個或幾個氨基酸。DNA 大片段缺失或復(fù)制（large deletion or duplication)：幾百個bp至幾十個kb的堿基缺失或復(fù)制。 第23頁，共62頁，2022年

10、，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四各種類型病理性突變的比例無義突變和移碼突變： 60稀有的錯義突變： 20DNA大片段缺失或重復(fù): 20另外：可能和疾病風(fēng)險評估有關(guān)的大量的多態(tài)位點(diǎn)微小突變第24頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四（二）目前常用的對已知點(diǎn)突變的分析技術(shù)限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）等位基因特異性（PCR）擴(kuò)增（ASA）等位基因特異性寡核苷酸雜交（ASO）DNA芯片第25頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四1.限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析當(dāng)突變影響到某一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)時，可通過酶切PCR產(chǎn)物，電泳分析:限制性片段長度多態(tài)性（

11、RFLP）第26頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四2.等位基因特異性（PCR）擴(kuò)增（ASA）通過設(shè)計(jì)兩個5端引物，一個與正常DNA互補(bǔ)，一個與突變DNA互補(bǔ)。分別加入這兩種引物及3端引物進(jìn)行兩個平行的PCR，分析結(jié)果。第27頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四3.等位基因特異性寡核苷酸雜交（ASO）設(shè)計(jì)兩段寡核苷酸探針，其中包含發(fā)生突變的位點(diǎn)，一段與野生型鏈互補(bǔ)，一段與突變型鏈互補(bǔ)。雜交分析是否存在突變第28頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四4.基因芯片：SNP位點(diǎn)的檢測第29頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15

12、分，星期四Microarray-based method for genotyping of functional single nucleotide polymorphisms using dual-color fluorescence hybridization. Mutat Res. 2004; 548: 97-105第30頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四（三）目前常用的未知基因突變分析技術(shù)異源雙鏈體形成分析（ Heteroduplex analysis, HA）單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single-strand conformation analysis, SSC

13、P）變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）變性高效液相色譜分析（Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC ）第31頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四體外蛋白截短實(shí)驗(yàn)（Protein truncation test, PTT）定量多重PCR技術(shù)（Quantitative multiplex PCR, QM-PCR）多重探針連接依賴性擴(kuò)增技術(shù)（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifcati

14、on, MLPA) DNA序列分析（DNA sequencing)第32頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四1.異源雙鏈體形成分析（HA）由突變型和野生型DNA鏈形成的異源雙鏈DNA在其錯配處形成一個凸起，電泳時會產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙鏈DNA不同的遷移率，從而使兩者得以分離。技術(shù)路線：PCR產(chǎn)物95C變性5分鐘，37C復(fù)性10分鐘。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（0.2%硝酸銀染色）第33頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四2.變性梯度凝膠電泳（DGGE）利用不同DNA序列開始變性時對變性劑濃度的要求不同，在變性劑濃度梯度凝膠內(nèi)電泳，野生型DNA和突變型DN

15、A序列的差異所導(dǎo)致其變性點(diǎn)不同使兩者的電泳遷移率出現(xiàn)差異第34頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四3.單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）單鏈DNA在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu)。這種二級結(jié)構(gòu)依賴于其堿基的序列。即使只有一個堿基的不同，也會形成不同的二級結(jié)構(gòu)并可引起非變性條件下的電泳遷移率的差異。技術(shù)路線：PCR產(chǎn)物95C變性5分鐘，立即置冰上。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。條件：電泳緩沖液0.5TBE，電壓70v, 4C環(huán)境下電泳過夜（0.2%硝酸銀染色）。第35頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四4.體外蛋白截短試驗(yàn)（PTT）從蛋白質(zhì)水平檢測基因的突變。其原理

16、是堿基缺失和插入導(dǎo)致的移碼突變、堿基替換出現(xiàn)的無義突變均可使基因提前出現(xiàn)終止密碼，從而截短mRNA翻譯的蛋白質(zhì)。技術(shù)路線：血細(xì)胞RNAcDNART-PCR體外蛋白質(zhì)合成電泳分析截短了的蛋白質(zhì)相應(yīng)基因片段的序列分析第36頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四上游引物5端均連接T7啟動子序列GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGG 35S甲硫氨酸，T7 體外轉(zhuǎn)錄/翻譯體系（兔網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物），30孵育90 min，完成體外蛋白質(zhì)合成。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 第37頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四5.變性高效液相

17、色譜分析（DHPLC）1995年Oefner and Underhill 首次報道DHPLC技術(shù)。其原理是在接近DNA融解溫度條件下進(jìn)行離子對反相高效液相色譜分析。DHPLC分析突變的原理：在DNA部分變性的條件下，變異型和野生型DNA可形成同源雙鏈和異源雙鏈根據(jù)其在層析柱上保留的時間可以分辨出變異性型DNA.第38頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四用離子對反相高效液相色譜檢測DNA變異是基于同時存在同源雙鏈和異源雙鏈。異源雙鏈的檢出取決于高效液相色譜的溫度。而色譜溫度的選定與野生型DNA融解溫度（Tm）有關(guān)。DHPLC與其它突變分析技術(shù)的比較: 對單個核苷酸變異的檢出

18、率: SSCP技術(shù), 約75%； DHPLC, 90%.第39頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四DHPLC的優(yōu)點(diǎn)：靈敏，準(zhǔn)確；分析速度快，單個樣本的分析時間僅需幾分鐘；容易實(shí)現(xiàn)自動化操作；適用于較大樣本中基因突變的篩選。第40頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四DHPLC分析：（野生型）第41頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四DHPLC分析: 突變型（單個堿基改變）第42頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四DHPLC分析: 突變型（單個堿基改變）第43頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，

19、星期四6.定量多重PCR技術(shù)（Quantitative multiplex PCR，Q-M-PCR）目前各實(shí)驗(yàn)室普遍采用的突變基因分析技術(shù)對基因微小突變的檢測具有較高的敏感性，如對單個堿基改變的檢出率可達(dá)90%以上。但對于較大的DNA缺失或DNA重復(fù)產(chǎn)生的突變，如以外顯子為單位的DNA缺失，SSCP、DHPLC等均難以將其檢出。有資料表明大片段DNA缺失可占基因突變的三分之一第44頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四定量多重PCR技術(shù)要點(diǎn)：涉及至少2個基因的多個外顯子在一個反應(yīng)管內(nèi)同時進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中一個外顯子作為參照外顯子，其余作為檢測外顯子；控制PCR循環(huán)數(shù)，使P

20、CR產(chǎn)物的增加處于對數(shù)增長曲線內(nèi)；PCR產(chǎn)物于DNA測序儀電泳，其結(jié)果經(jīng)GeneScan軟件處理；第45頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四以檢測外顯子PCR產(chǎn)物與參照外顯子PCR產(chǎn)物的比值計(jì)算模版DNA相對拷貝數(shù)，確定是否存在檢測外顯子的雜合性缺失；檢出的缺失經(jīng)其它方法（長片段PCR或缺失斷裂點(diǎn)測序）確認(rèn)。第46頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四7. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifcation MLPADenatured genomic DNA is hybridized with a mixt

21、ure of more than 40 probes.Each MLPA probe consists of two oligonucleotides, one synthetic and one M13-derived.The two part of hybridized probes are ligated.All probe ligation products are amplified by PCR using only one primer pair.Electrophoresis of PCR products on DNA Sequencer in GeneScan model.

22、第47頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四三、遺傳性疾病的診斷第48頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四遺傳性疾病的診斷：（一）臨癥診斷（二）癥狀出現(xiàn)前的診斷（三）產(chǎn)前診斷第49頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四（一）臨癥診斷根據(jù)就診患者的臨床表現(xiàn)作出（初步）判斷：疾病診斷，遺傳方式（1）癥狀、體征（2）系譜分析部分遺傳性疾病的診斷主要依賴于癥狀、體征對于同時存在散發(fā)病例和遺傳性病例的復(fù)雜性疾病，如腫瘤，建立相應(yīng)的臨床可疑病例的判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)不同的遺傳性疾病，選擇適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)室技術(shù)分析確診： 生化技術(shù)、細(xì)胞技術(shù)、分子技術(shù)多用于對先

23、證者的診斷第50頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四Pedigree of a family第51頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四遺傳性疾病基因診斷程序臨床診斷和確定分析對象確定分析的目標(biāo)基因以檢測目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)確定分析的技術(shù)構(gòu)成和分析過程：基因微小變異篩查：SSCP, DGGE, DHPLC, PTT, DNA測序分析基因大片段變異（缺失或重復(fù)）的分析檢出變異的性質(zhì)評估和患者家族的遺傳咨詢。 第52頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四DHPLC突變分析第53頁，共62頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四體外蛋白截短試驗(yàn)（PTT） HNPCC遺傳性突變第54頁，共62頁，2022年，5月2