細胞系的建立及鑒定課件

1、 細胞系的建立及鑒定 2012.2.28細胞系：有限細胞系，人的正常組織多數(shù)可以建立有限細胞系。如間充質(zhì)來源的成纖維細胞，牙髓細胞、牙髓干細胞、牙周膜細胞等無限細胞系，永生化細胞系，腫瘤細胞系細胞系/細胞的鑒定細胞系的建立：1.組織塊方法2.單層細胞法 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng) 大量擴增細胞后用于實驗研究 使用前對細胞的組織特異性進行鑒定成骨細胞：沒有唯一的特異性標志物 需數(shù)個指標聯(lián)合證實表面標志：表達ALP。 Gomarri 法合成型膠原、型膠原、骨鈣素、骨粘蛋白、骨橋蛋白等骨基質(zhì)蛋白。組織功能： 體外形成礦化結(jié)節(jié)。 von Kossa染色法體內(nèi)成骨。免疫缺陷鼠皮下移植。破骨細胞：唯一特異性標志物

2、破骨細胞含有豐富的酸性磷酸酶和抗酒石酸磷酸酶（tartrat resisitant acid phosphatase,TRAP），TRAP染色陽性是破骨細胞的重要標識。另外破骨細胞表面有降鈣素（calcitonin）受體，也可以作為標志物。形態(tài)學(xué)：多核細胞牙周膜干細胞：干細胞表面標記物:多潛能功能組織細胞分化及功能鑒定 分化為脂肪細胞： 油紅O 染色陽性腫瘤細胞系的生物學(xué)鑒定 腫瘤細胞系建立后,要對其生物學(xué)性狀進行鑒定,以便日后的研究有可比較的科學(xué)依據(jù)腫瘤細胞的生物學(xué)特征干系細胞：每個腫瘤內(nèi)都含有一個或幾個具有相對穩(wěn)定特性的自我保持的（Selfmaintaining）細胞系。腫瘤的生長就是這些

3、細胞系的增殖；非干系細胞：除了干系瘤細胞，腫瘤還具有失去自我保持能力的細胞的后代，可稱為“腫瘤的非干系細胞”。動物腫瘤移植實驗證實，腫瘤結(jié)節(jié)在新宿主身上多次傳代之后仍具有原來腫瘤的主要特征，包括形態(tài)、生化、抗原及細胞遺傳的標志。所有惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)的細胞都具有與親代原發(fā)病損類似的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)。 培養(yǎng)中的腫瘤細胞特性 1致瘤性： 培養(yǎng)的腫瘤細胞移植到敏感動物后，可獲得形成腫瘤的能力。證明細胞在體外能經(jīng)過類似于體內(nèi)腫瘤發(fā)生過程中出現(xiàn)的變化。 動物接種形成的腫瘤應(yīng)進行組織學(xué)、染色體及其它生物學(xué)標志的檢查并與原接種細胞進行比較。 致瘤性的判斷移植瘤是判斷細胞性質(zhì)的關(guān)鍵步驟。首先，移植瘤的組織

4、形態(tài)應(yīng)與原腫瘤組織一致。但有例外，細胞群體的性質(zhì)可以與植入前不同，因為在植入的細胞中，只有特殊變異的細胞具有致瘤性，這些變種可能原來就存在于植入群體內(nèi)，也可能是植入后產(chǎn)生的。在這種情況下可以確認接種的致瘤性。 （2）植入部位 ，例如，將瘤細胞接種到小鼠軀干接近頭部位置的皮下，生瘤的陽性率及生長的速度比植到尾部高24倍。（3）植入部位微環(huán)境的潛在因素，某些細胞只有在植入部位找到最佳的微環(huán)境時才形成腫瘤。生瘤性與細胞其它性質(zhì)的關(guān)系細胞在基質(zhì)上鋪展的面積與生瘤性有關(guān)。微絲束的結(jié)構(gòu)破壞。許多生瘤細胞系均有大量的微絲束變化，它與形態(tài)轉(zhuǎn)化有關(guān)。停泊依賴性與生瘤性聯(lián)系最密切。 在動物體內(nèi)不形成腫瘤的細胞系，

5、在半固體培養(yǎng)基內(nèi)形成集落的能力也低；與之相反，而大多數(shù)能在動物體內(nèi)生瘤的細胞系，形成集落的效率也高。喪失生長抑制性當(dāng)培養(yǎng)細胞所需任何一種關(guān)鍵性營養(yǎng)物質(zhì)或生長因子降到閾值以下時,正常細胞的生長即受到抑制,如異亮氨酸,磷酸鹽,上皮生長因子等。轉(zhuǎn)化的細胞對一些生長因子需求降低,或失去了對激素和生長因子的需求，在營養(yǎng)不足的情況下可繼續(xù)生長,它們甚至可以殺死一些自身的細胞,以便在不可能生存的環(huán)境下繼續(xù)生長?；蛘哂捎谀承┺D(zhuǎn)化產(chǎn)生了生長因子類似物,為自身提供了生長因子。 密度依賴性抑制 正常貼壁性細胞的增殖率,隨著每單位基質(zhì)面積內(nèi)的細胞群體的局部密度增加而下降。這一現(xiàn)象稱為密度依賴性抑制(density d

6、ependent inhibition) ?；蛏L接觸抑制(contact inhibition of growth),但二者并不等同。當(dāng)一個對密度依賴性抑制敏感的培養(yǎng)細胞達到某種密度，即所謂飽和密度時便停止生長。此時細胞停止增殖，但并不死亡。這種抑制可以由于液體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)耗盡,生長抑制物質(zhì)的累積所引起。惡性轉(zhuǎn)化細胞對密度依賴性抑制的敏感性在腫瘤演化的過程中自動丟失。 3獲得永生性 正常細胞原代培養(yǎng)物經(jīng)過數(shù)次傳代就逐漸停止增殖。在腫瘤性演化過程中，細胞可能獲得生長無限代數(shù)的能力。永生性是腫瘤演化的一個特征。 成纖維及上皮細胞的原代培養(yǎng)經(jīng)過初期的適應(yīng)培養(yǎng)條件之后，便進入較穩(wěn)定的生長時期，

7、生長速度逐漸下降，進入退化期即衰老期。細胞系的壽命差別很大，取決于培養(yǎng)細胞來自的動物種屬。 腫瘤細胞系的一般生物學(xué)性狀: 培養(yǎng)細胞的形態(tài)和/或超微結(jié)構(gòu)細胞生長及增殖能力的檢測: 細胞生長曲線； 細胞分裂指數(shù)； 細胞倍增時間； 細胞周期,DNA合成； 遺傳性狀檢測： 染色體分析:倍體性、染色體眾數(shù)、核型分析； 同工酶； 集落形成能力； 腫瘤細胞系的特征：特殊標記、癌基因、抑癌基因的表達、病毒感染等； 以上各項指標中異種體內(nèi)移植致瘤性最為主要,如果一個細胞系接種到免疫缺陷動物體內(nèi)的適當(dāng)部位后不能生瘤,則不能證明其具有腫瘤細胞的特征。 細胞懸液的制備要求：5個濃度的細胞懸液分別是： 10000個；8000個；6000個；4000 個；2000個/100ul/孔 每個濃度3個復(fù)孔1.細胞懸液的計數(shù) 得到1X105個/ml2.確定各實驗濃度所需的細胞懸液總量 要求：100ul/孔X（3孔+2孔）500ul3.計算各濃度細胞懸液所需的細胞數(shù) 104/孔/100ulX5孔5X