生物制藥醫(yī)學(xué)宣教培訓(xùn)課件

1、生物制藥醫(yī)學(xué)宣教生物制藥醫(yī)學(xué)宣教內(nèi)容第一章緒論第二章 生物藥物概論 第三章 生物制藥工藝學(xué)第四章 基因工程制藥第五章抗體工程制藥第六章 動物細(xì)胞制藥 第七章 植物細(xì)胞制藥第八章 酶工程制藥 第九章 海洋生物制藥 第十章 利用現(xiàn)代生物技術(shù)改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)2生物制藥醫(yī)學(xué)宣教內(nèi)容第一章緒論2生物制藥醫(yī)學(xué)宣教第五章 抗體工程制藥第一節(jié) 概論： 1 抗體概念 2 抗體產(chǎn)生細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ) 3 抗體特性 4 抗體結(jié)構(gòu)及多樣性 5 抗體形成的研究歷史第二節(jié) 抗體工程 1 多克隆抗體 2 單克隆抗體 3 基因工程抗體 4 抗體庫 5 應(yīng)用： 抗體診斷試劑的研究 抗體治療藥物的研究3生物制藥醫(yī)學(xué)宣教第五章 抗體工程制

2、藥第一節(jié) 概論：3生物制藥醫(yī)學(xué)宣教（1）抗體基本概念第一節(jié) 概論抗體機(jī)體在抗原物質(zhì)刺激下，由B細(xì)胞分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。1964年，世界衛(wèi)生組織舉行專門會議，將具有抗體活性以及與抗體相關(guān)的球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白（Ig）。如骨髓瘤蛋白，巨球蛋白血癥、冷球蛋白血癥等患者血清中存在的異常免疫球蛋白以及“正常人”天然存在的免疫球蛋白亞單位等。因而免疫球蛋白是結(jié)構(gòu)及化學(xué)的概念，而抗體是生物學(xué)及功能的概念。所有抗體都是免疫球蛋白，但并非所有免疫球蛋白都是抗體。免疫球蛋白具有免疫功能的血清組分，不一定具有抗體活性要素： B 細(xì)胞 產(chǎn)生， 免疫功能（與抗原結(jié)合）

3、球蛋白4生物制藥醫(yī)學(xué)宣教（1）抗體基本概念第一節(jié) 概論抗體機(jī)體在抗原物質(zhì)刺免疫反應(yīng)（2） 抗體的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)免疫：系指機(jī)體對感染有抵抗能力，而不患疾病或傳染病。 組織和器官免疫系統(tǒng) 細(xì)胞 免疫學(xué)是研究免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，理解其對機(jī)體有益的防衛(wèi)功能和有害的病理作用及其機(jī)制，以發(fā)展有效的免疫學(xué)措施，實(shí)現(xiàn)防病、治病的目的?；钚苑肿?生物制藥醫(yī)學(xué)宣教免疫反應(yīng)（2） 抗體的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)免疫：系指機(jī)體對感染有抵抗免疫分子（抗體，補(bǔ)體，細(xì)胞因子等）免疫細(xì)胞 ：(淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞 及白細(xì)胞、漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞等) 免疫器官：中樞免疫器官和周圍免疫器 官 ；A中樞器官是免疫細(xì)胞發(fā)生和分化的場所(胸腺-T、骨髓成血干

4、細(xì)胞和鳥類法氏囊-B) B周圍免疫器官是免疫細(xì)胞居住和發(fā)生場所:淋巴結(jié)、脾臟、黏膜相關(guān)的淋巴組織-分布于呼吸道、消化道泌尿系統(tǒng)黏膜1免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)與免疫細(xì)胞淋巴結(jié)網(wǎng)淋巴管左右鎖骨下靜脈并入血液循環(huán)6生物制藥醫(yī)學(xué)宣教免疫分子（抗體，補(bǔ)體，細(xì)胞因子等）1免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)與免疫細(xì)ThymusBone MarrowWaldeyer”s ring咽淋巴環(huán) (lymph nodes, tonsils)扁桃腺 Bronchus-associatedLymphoid tissueLymph nodes （淋巴結(jié)）Spleen （脾）Lamina propria粘膜下層 MesentericLymph nod

5、e腸系膜淋巴 結(jié)Peyer”s patchGenitourinalLymphoid tissueLymphnodes皮耶氏節(jié) 生殖器淋巴 組織胸腺骨髓免疫器官和組織的分布7生物制藥醫(yī)學(xué)宣教ThymusBone Waldeyer”s ring咽淋巴環(huán)免疫系統(tǒng)與免疫細(xì)胞2、免疫細(xì)胞：主要包括淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞，單核巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞。免疫細(xì)胞 按表面分子標(biāo)志及功能分：T細(xì)胞、B細(xì)胞、非T非B 淋巴細(xì)胞 T細(xì)胞：據(jù)表面帶有CD4或CD8分子分輔助性T細(xì)胞、殺傷性T細(xì)胞、抑制性T細(xì)胞，參與細(xì)胞免疫。 B細(xì)胞： 轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞、產(chǎn)生抗體，參與體液免疫，B1和B2。 NK（natural kill

6、er）細(xì)胞：無需輔助細(xì)胞或分子的參與，即可直接殺傷病變細(xì)胞。釋放穿孔素和顆粒酶造成靶細(xì)胞死亡，也可通過腫瘤壞死因子殺傷靶細(xì)胞8生物制藥醫(yī)學(xué)宣教免疫系統(tǒng)與免疫細(xì)胞2、免疫細(xì)胞：主要包括淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和肥9生物制藥醫(yī)學(xué)宣教9生物制藥醫(yī)學(xué)宣教B細(xì)胞 骨髓干細(xì)胞 B前體細(xì)胞在骨髓中成熟釋放 成熟B細(xì)胞 釋放于淋巴系統(tǒng) 激活B細(xì)胞 分化成漿細(xì)胞，分泌抗體或記憶B細(xì)胞，形成免疫記憶10生物制藥醫(yī)學(xué)宣教B細(xì)胞 骨髓干細(xì)胞10生物制藥醫(yī)學(xué)宣教T淋巴細(xì)胞 骨髓干細(xì)胞（類囊器官) T前體細(xì)胞進(jìn)入胸腺， 成熟T細(xì)胞 釋放于淋巴系統(tǒng) 激活T細(xì)胞 分化成 殺傷T細(xì)胞， 輔助T細(xì)胞 抑制T細(xì)胞 記憶T細(xì)胞殺傷細(xì)胞分泌細(xì)

7、胞因子，輔助B細(xì)胞激活或殺傷細(xì)胞形成免疫記憶抑制過敏反應(yīng)皮膚T cell 淋巴瘤患者11生物制藥醫(yī)學(xué)宣教T淋巴細(xì)胞 骨髓干細(xì)胞（類囊器官)殺傷細(xì)胞形成免疫記憶抑制Tc細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞掃描電鏡像(體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 人工加色)細(xì)胞殺傷T淋巴細(xì)胞12生物制藥醫(yī)學(xué)宣教Tc細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞掃描電鏡像細(xì)胞殺傷T淋巴細(xì)胞12生物制藥人T淋巴細(xì)胞攻擊母細(xì)胞瘤細(xì)胞13生物制藥醫(yī)學(xué)宣教人T淋巴細(xì)胞攻擊母細(xì)胞瘤細(xì)胞13生物制藥醫(yī)學(xué)宣教T輔助細(xì)胞介導(dǎo)B細(xì)胞的激活14生物制藥醫(yī)學(xué)宣教T輔助細(xì)胞介導(dǎo)B細(xì)胞的激活14生物制藥醫(yī)學(xué)宣教巨噬細(xì)胞的吞噬作用其它免疫細(xì)胞15生物制藥醫(yī)學(xué)宣教巨噬細(xì)胞的吞噬作用其它免疫細(xì)胞15生物制藥醫(yī)學(xué)

8、宣教中性粒細(xì)胞、血小板等16生物制藥醫(yī)學(xué)宣教中性粒細(xì)胞、血小板等16生物制藥醫(yī)學(xué)宣教3、免疫因子：主要包括膜表面免疫因子和體液免疫因子。B和T細(xì)胞表面有各自的特異性膜表面抗原受體BCR和TCR,能識別特異性抗原并與之結(jié)合，啟動特異性免疫。體液免疫因子主要包括抗體、補(bǔ)體和細(xì)胞因子。細(xì)胞因子是免疫細(xì)胞分泌的低分子的多肽，包括白細(xì)胞介素（IL）集落刺激因子（CSF）干擾素（INF）腫瘤壞死因子(TNF)及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF),具有多方面調(diào)節(jié)作用；既有細(xì)胞毒素和抗病毒功能，直接參與免疫應(yīng)答的效應(yīng)過程17生物制藥醫(yī)學(xué)宣教3、免疫因子：主要包括膜表面免疫因子和體液免疫因子。17生物（3）抗體的特性（1）

9、結(jié)合特異性抗原：抗體與其它免疫球蛋白分子最大區(qū)別就在于抗體能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合，在體內(nèi)導(dǎo)致生理或病理效應(yīng)；抗體是靠其分子上的特殊的結(jié)合部位與抗原結(jié)合的。（2）激活補(bǔ)體：抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合后，借助暴露的補(bǔ)體結(jié)合點(diǎn)去激活補(bǔ)體系統(tǒng)、激發(fā)補(bǔ)體的溶菌、溶細(xì)胞等免疫作用。（3）結(jié)合細(xì)胞：不同類別的免疫應(yīng)答。（4）可通過胎盤及粘膜：免疫球蛋白G（IgG）能通過胎盤進(jìn)入胎兒血流中，使胎兒形成自然被動免疫。免疫球蛋白A（IgA）可通過消化道及呼吸道粘膜，是粘膜局部抗感染免疫的主要因素。（5）具有抗原性：抗體分子是一種蛋白質(zhì)，也具有刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的性能。不同的免疫球蛋白分子，各具有不同的抗原性。（6）

10、抗體對理化因子的抵抗力與一般球蛋白相同：不耐熱，6070即被破壞。各種酶及能使蛋白質(zhì)凝固變性的物質(zhì)，均能破壞抗體的作用。抗體可被中性鹽類沉淀。在生產(chǎn)上?？捎昧蛩徜@或硫酸鈉從免疫血清中沉淀出含有抗體的球蛋白，再經(jīng)透析法將其純化。 生物學(xué)活性18生物制藥醫(yī)學(xué)宣教（3）抗體的特性（1）結(jié)合特異性抗原：抗體與其它免疫球蛋白分抗體結(jié)合抗原的活性由B細(xì)胞產(chǎn)生的各種特異抗體與侵入機(jī)體的病毒或外毒素分子結(jié)合，從而阻斷了病毒進(jìn)入細(xì)胞的能力或中和了外毒素分子的毒性作用。19生物制藥醫(yī)學(xué)宣教抗體結(jié)合抗原的活性由B細(xì)胞產(chǎn)生的各種特異抗體與侵入機(jī)體的病毒抗體產(chǎn)生的規(guī)律（1）初次反應(yīng)產(chǎn)生抗體：當(dāng)抗原第一次進(jìn)入機(jī)體時，需經(jīng)

11、一定的潛伏期才能產(chǎn)生抗體，且抗體產(chǎn)生的量也不多，在體內(nèi)維持的時間也較短。（2）再次反應(yīng)產(chǎn)生抗體：當(dāng)相同抗原第二次進(jìn)入機(jī)體后，開始時，由于原有抗體中的一部分與再次進(jìn)入的抗原結(jié)合，可使原有抗體量略為降低。隨后，抗體效價迅速大量增加，可比初次反應(yīng)產(chǎn)生的多幾倍到幾十倍，在體內(nèi)留存的時間亦較長。（3）回憶反應(yīng)產(chǎn)生抗體：由抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體，經(jīng)過一定時間后可逐漸消失。此時若再次接觸抗原，可使已消失的抗體快速上升。若再次刺激機(jī)體的抗原與初次相同，則稱為特異性回憶反應(yīng)；若與初次反應(yīng)不同，則稱為非特異性回憶反應(yīng)。非特異性回憶反應(yīng)引起的抗體的上升是暫時性的，短時間內(nèi)即很快下降。 20生物制藥醫(yī)學(xué)宣教抗體產(chǎn)生的

12、規(guī)律（1）初次反應(yīng)產(chǎn)生抗體：當(dāng)抗原第一次進(jìn)入機(jī)體時（4）抗體的基本結(jié)構(gòu)和多樣性21生物制藥醫(yī)學(xué)宣教（4）抗體的基本結(jié)構(gòu)和多樣性21生物制藥醫(yī)學(xué)宣教基因多樣性決定抗體多樣性免疫球蛋白反應(yīng)的特異性和分子的多樣性是受基因支配；一條肽鏈的C區(qū)和V區(qū)分別由C基因和V基因編碼。任何一個B細(xì)胞都有3個獨(dú)立的Ig基因簇： 1個H鏈基因簇： 2個L鏈基因簇：和 共同構(gòu)成Ig的結(jié)構(gòu)基因在B細(xì)胞分化成熟過程中進(jìn)行基因重排，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄與翻譯，形成抗體。 LH22生物制藥醫(yī)學(xué)宣教基因多樣性決定抗體多樣性免疫球蛋白反應(yīng)的特異性和分子的多樣(5）抗體的分類（1）按作用對象，可將其分為抗毒素、抗菌抗體、抗病素抗體和親細(xì)胞抗體（

13、能與細(xì)胞結(jié)合的免疫球蛋白，如1型變態(tài)反應(yīng)中的lgE反應(yīng)素抗體，能吸附在靶細(xì)胞膜上）。（2）按理化性質(zhì)和生物學(xué)功能，可將其分為IgG、IgA、IgM、IgE、IgD五類。23生物制藥醫(yī)學(xué)宣教(5）抗體的分類（1）按作用對象，可將其分為抗毒素、抗菌抗體抗體的分類5大類：IgG-是成人血清中的主要成分( 75% ), 新生兒具有的唯一一種抗體。IgA-在血清中只有15%, 但從整個人體中是量最大的抗體（ 66mg/kg/day），46個月的嬰兒就可以開始合成這種抗體。IgM-在血清中只有10%, 是最原始的也是最大一類（ b（5聚體), 免疫系統(tǒng)啟動時最早出現(xiàn)的抗體，也是B細(xì)胞上的受體IgD-20-

14、30ug/ml, 3d, 是B細(xì)胞上的主要受體IgE-0.1-0.4ug/ml, 3d, 是引起超敏反應(yīng)的主要原因。hypersensitivity (allergic過敏)Immunoglobulins-Ig (glycoprotein按理化性質(zhì)和生物學(xué)功能24生物制藥醫(yī)學(xué)宣教抗體的分類5大類：Immunoglobulins-(5）抗體的分類（3）按與抗原結(jié)合后是否出現(xiàn)可見反應(yīng)，可將其分為：在介質(zhì)參與下出現(xiàn)可見結(jié)合反應(yīng)的完全抗體，即通常所說的抗體。不出現(xiàn)可見反應(yīng)，但能阻抑抗原與其相應(yīng)的完全抗體結(jié)合的不完全抗體。（4）按抗體的來源，可將其分為天然抗體和免疫抗體。25生物制藥醫(yī)學(xué)宣教(5）抗體的

15、分類25生物制藥醫(yī)學(xué)宣教抗體體內(nèi)生成的理論 抗原刺激前，機(jī)體具有抗體初級庫抗原刺激后，抗體生成的細(xì)胞群體被選擇，并發(fā)生克隆性增殖。在抗原的反復(fù)刺激下，抗體的V區(qū)發(fā)生高頻率突變，產(chǎn)生高親和力抗體的細(xì)胞被選擇，抗體進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換，最終抗體成熟。類別轉(zhuǎn)換(僅在C區(qū)發(fā)生DNA水平上的改變，導(dǎo)致抗體的類別發(fā)生改變，C區(qū)決定五種基本類別，26生物制藥醫(yī)學(xué)宣教抗體體內(nèi)生成的理論 抗原刺激前，機(jī)體具有抗體初級庫類別轉(zhuǎn)換(第二節(jié) 抗體工程研究大致可分為3個階段：多克隆抗體階段：以1890年發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素為代表（Bering等），其特點(diǎn)是用抗原免疫動物來獲得多克隆抗體。單克隆抗體階段：以1975年 創(chuàng)建雜交瘤技術(shù)制

16、備單克隆抗體為代表（Milstein和khler ）。基因工程抗體階段：以1984年以基因工程方法制備抗體為代表，制造基因工程抗體（Morrison) 1989年Winter等首次構(gòu)建了抗體基因庫，從而使抗體的研究從細(xì)胞水平進(jìn)入到分子水平，并推動了第3代抗體基因工程抗體技術(shù)的發(fā)展。 27生物制藥醫(yī)學(xué)宣教第二節(jié) 抗體工程研究大致可分為3個階段：基因工程抗體階段： 抗體工程抗體工程-是指利用單克隆抗體技術(shù)和基因工程技術(shù)進(jìn)行天然抗體的生產(chǎn)和抗體的改造，以用于治療難治療疾病。如惡性腫瘤、病毒性感染、傳染性疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，自身免疫系統(tǒng)疾病等，另外新型研制的抗體往往可作為診斷試劑。28生物制藥醫(yī)學(xué)宣教

17、 抗體工程抗體工程-是指利用單克隆抗體技術(shù)和基因工 抗體工程流程包括一、免疫動物的選擇：選擇動物時應(yīng)考慮如下因素：1.抗原與免疫動物種屬差異越遠(yuǎn)越好。2.動物必須適齡、健壯、無感染。3.動物體內(nèi)有與抗原相類似的物質(zhì)或其它原因而使該抗原對該動物免疫原性極差，則該動物不能選用。例如：IgE 綿羊，胰島素-家兔，酶類-山羊等。（1） 多克隆抗體免疫動物獲得抗血清的途徑一直是獲得抗體的經(jīng)典傳統(tǒng)方法由多種抗原決定簇刺激機(jī)體，相應(yīng)地就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體，機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體就是多克隆抗體；除了抗原決定簇的多樣性以外，同樣一類抗原決定簇，也可刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG、I

18、gM、IgA、IgE和IgD等五類抗體。 29生物制藥醫(yī)學(xué)宣教 抗體工程流程包括（1） 多克隆抗體免疫動物獲得抗血清的途徑二、免疫方法1.免疫的劑量：應(yīng)考慮抗原性的強(qiáng)弱、分子量的大小、動物的狀態(tài)和免疫時間。一般大:0.51mg/只，小:0.10.6mg/只。2.免疫途徑：皮內(nèi)或皮下免疫采用多點(diǎn)注射(810點(diǎn))。皮內(nèi)注射易引起細(xì)胞反應(yīng)，對提高抗體效價有利，但皮內(nèi)注射較困難(因佐劑加入后粘度大)；半抗原宜皮內(nèi)多點(diǎn)注射。用明礬作佐劑時，一般用于肌肉注射(因皮下注射易引起肉芽腫和膿腫)；腹腔和靜脈注射多用于顆粒性抗原和加強(qiáng)免疫。 對寶貴抗原，可采用淋巴結(jié)內(nèi)直接注射抗原。30生物制藥醫(yī)學(xué)宣教二、免疫方法

19、30生物制藥醫(yī)學(xué)宣教3.免疫時間： 首次和二次免疫之間要間隔約20 天，二次以后每次間隔710天。第一次免疫后，機(jī)體處于識別階段，若很快第二次注入抗原，極易造成免疫耐受。第二次以后，若間隔時間過長，則刺激變?nèi)?，造成抗體效價不高。三、動物采血法： 1.頸動脈采血法 2.心臟采血法（常用于小動物） 3.靜脈多次采血法31生物制藥醫(yī)學(xué)宣教3.免疫時間：31生物制藥醫(yī)學(xué)宣教四 抗血清的純化、鑒定和保存1.抗血清的純化: 親和層析、吸附法純化特異性抗體。 用40%、35%、33%的硫酸銨鹽析三次(或20%的硫酸鈉)粗提-球蛋白，但仍含5%的其它蛋白。 經(jīng)離子層析、親和層析純化Ig或酶解法制備Fab或Fc

20、片段。2.抗血清的鑒定：雙擴(kuò)（特異性、效價） 電泳（純度）。3.抗血清的保存：過濾除菌后。 A 4液態(tài)保存36m. B 20-40 保存23年，但避免反復(fù)凍融。 C 冰凍干燥，45年。32生物制藥醫(yī)學(xué)宣教四 抗血清的純化、鑒定和保存1.抗血清的純化:32生物制藥醫(yī)多克隆抗體缺點(diǎn)1 純度低： 用來免疫動物的抗原可能含有多種抗原決定簇，因而進(jìn)入機(jī)體后會產(chǎn)生多種抗體2 獲得的抗體是非人源抗體33生物制藥醫(yī)學(xué)宣教多克隆抗體缺點(diǎn)1 純度低： 33生物制藥醫(yī)學(xué)宣教2 單克隆抗體技術(shù)一、單克隆抗體-(monoclonal antibody,McAb)單克隆是指由一個細(xì)胞經(jīng)無性繁殖而形成的遺傳性狀完全相同的細(xì)

21、胞群。一個B細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的只識別一種抗原決定簇的抗體分子。二、雜交瘤技術(shù)-用人工方法使抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞的一種技術(shù)。即將含有特異免疫信息的淋巴細(xì)胞與具有無限增殖能力的腫瘤細(xì)胞，在誘導(dǎo)物（PEG）的作用下，使其融合產(chǎn)生一個新的具有特異活性細(xì)胞及其產(chǎn)物的技術(shù)。34生物制藥醫(yī)學(xué)宣教2 單克隆抗體技術(shù)一、單克隆抗體-(monoclona雜交瘤技術(shù)的原理：動物細(xì)胞的融合技術(shù) 利用聚乙二醇(PEG)作為細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)胞(能分泌某種抗體的B細(xì)胞)與具有在體外不斷繁殖能力的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融為一體，在HAT培養(yǎng)基的選擇作用下，只讓融合成功的雜交瘤細(xì)胞生長，經(jīng)過反復(fù)的單個細(xì)胞

22、培養(yǎng)(克隆化)，最終獲得既能產(chǎn)生所需抗體、又能不斷繁殖的雜交瘤細(xì)胞純系，將這種細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，在其后產(chǎn)生的腹水中含有高效價的單克隆抗體。親本細(xì)胞：免疫小鼠的脾細(xì)胞（B細(xì)胞）提供抗體同系列小鼠的骨髓瘤細(xì)胞 提供單克隆繁殖體系35生物制藥醫(yī)學(xué)宣教雜交瘤技術(shù)的原理：動物細(xì)胞的融合技術(shù)35生物制藥醫(yī)學(xué)宣教36生物制藥醫(yī)學(xué)宣教36生物制藥醫(yī)學(xué)宣教37生物制藥醫(yī)學(xué)宣教37生物制藥醫(yī)學(xué)宣教HAT培養(yǎng)基是在常用的細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)添加了3種特殊成分：次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸腺嘧啶(T)。1.脾細(xì)胞：在體外57天內(nèi)死亡，所以在HAT培養(yǎng)基中最終死亡。2.骨髓瘤細(xì)胞：一般細(xì)胞合成DNA有兩條途徑

23、：一條是主要途徑，即由糖、氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，此途徑可被氨基蝶呤(A)所阻止。 另一條是替代途徑：在次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)存在下，由次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)同時催化合成DNA 小鼠骨髓瘤細(xì)胞為HGPRT缺乏的缺陷型細(xì)胞，在HAT中，正常合成DNA的途徑被氨基蝶呤(A)阻斷，又因HGPRT缺乏而不能用替代途徑，最終只能死亡。3.雜交瘤細(xì)胞：合成DNA的途徑阻斷，但可利用原脾細(xì)胞的HGPRT完成替代途徑的作用，存活。篩選雜交瘤細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基：38生物制藥醫(yī)學(xué)宣教篩選雜交瘤細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基：38生物制藥醫(yī)學(xué)宣教HAT選擇培養(yǎng)基選

24、擇雜交瘤細(xì)胞原理示意圖HAT培養(yǎng)基是在常用的細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)添加了3種特殊成分：次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸腺嘧啶(T)。腫瘤細(xì)胞缺少HGRRT脾細(xì)胞：在體外57天內(nèi)死亡只有雜交瘤細(xì)胞在這種條件下可以永久存活39生物制藥醫(yī)學(xué)宣教HAT選擇培養(yǎng)基選擇雜交瘤細(xì)胞原理示意圖HAT培養(yǎng)基是在常用單克隆抗體McAb特點(diǎn)1、McAb以其純度高、單一特異性，與一個抗原決定簇反應(yīng)2、可重復(fù)性，能提供完全一樣的抗體制劑3、一經(jīng)制出可大量的供應(yīng)；4、生產(chǎn)單克隆抗體，不一定需要純的抗原；5、靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)，能查出混合物中存在的用常規(guī)方法查不出的少量成分。逐步取代了多克隆抗體試劑，減少了血清學(xué)上的交叉反應(yīng)，提高血清

25、學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷特異性和敏感性，McAb高度的生化均一性和生物活性單一性。40生物制藥醫(yī)學(xué)宣教單克隆抗體McAb特點(diǎn)1、McAb以其純度高、單一特異性，與 主要臨床應(yīng)用1 病原微生物抗原的檢測。2 腫瘤抗原的檢測。3 免疫細(xì)胞 及其亞群的檢測。4 激素測定。5 細(xì)胞因子的測定。目前在美國單克隆抗體類藥物已占FDA所批生物藥的3/4。 美國已上市16種單克隆抗體藥物 2002年銷售額 29億美元 2005年 90億美元 我國的單克隆抗體藥物市場還處于起步階段用作藥物： 41生物制藥醫(yī)學(xué)宣教 主要臨床應(yīng)用目前在美國單克隆抗體類藥物1 單克隆抗體具有導(dǎo)向治療作用McAb具有高度的特異性，能準(zhǔn)確識別靶器官上

26、的特異性抗原決定簇。將治療藥物等細(xì)胞毒素制劑與腫瘤抗原McAb相結(jié)合，利用McAb的導(dǎo)向作用，將藥物或毒素攜帶至靶器官，直接殺傷靶細(xì)胞，稱為“免疫導(dǎo)彈”。藥物分子McAb靶細(xì)胞，如腫瘤42生物制藥醫(yī)學(xué)宣教1 單克隆抗體具有導(dǎo)向治療作用McAb具有高度的特異性，能存在問題以單克隆抗體作為載體的藥物可對腫瘤進(jìn)行定向治療。其障礙有： 單克隆抗體均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA），加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)的半衰期只有56小時，難以維持有效藥物作用靶組織時間。 完整的抗體分子（即Ig）的相對分子質(zhì)量過大，難以穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療濃度改造：降低單克隆抗體的免疫原性；降低

27、單克隆抗體的相對分子質(zhì)量基因工程抗體43生物制藥醫(yī)學(xué)宣教存在問題以單克隆抗體作為載體的藥物可對腫瘤進(jìn)行定向治療?；? 基因工程抗體概念：利用基因工程技術(shù)，將特定的抗體的編碼基因克隆到適當(dāng)載體上，轉(zhuǎn)移到合適表達(dá)細(xì)胞中，進(jìn)行大量表達(dá)，從而獲得的抗體稱為基因工程抗體基因工程抗體主要分兩大類，即大分子抗體和小分子抗體。前者目的是使鼠單抗人源化（含有部分來自于人的抗體基因）；而后者則是使抗體具有更好的通透性，易于到達(dá)靶部位。V區(qū)C區(qū)人的IG鼠的IG嵌和體導(dǎo)入表達(dá)細(xì)胞大量表達(dá)產(chǎn)物提取和分析骨髓瘤細(xì)胞中80年代，開始研究抗體生產(chǎn)的人源化嵌合抗體.用人抗體的C區(qū)替代鼠抗體的C區(qū)，并可延長其在體內(nèi)的半衰期及改

28、善藥物的動力學(xué)。屬第一代人源化抗體（HAb）44生物制藥醫(yī)學(xué)宣教3 基因工程抗體概念：基因工程抗體主要分兩大類，即大分子抗體1、獲取目的基因 一般都是提取雜交瘤細(xì)胞系的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）獲取抗體某一特定基因區(qū)段，如重鏈和輕鏈可變區(qū)（VH和VL）基因。2、與合適載體連接在一起 根據(jù)將要表達(dá)的細(xì)胞來選擇合適的表達(dá)載體，這些載體必須高效表達(dá)，對細(xì)胞本身無害，又帶有選擇標(biāo)記。 3、基因工程抗體的表達(dá) 導(dǎo)入表達(dá)細(xì)胞，篩選陽性克隆后，按其目的不同，可選用原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物和動物等不同表達(dá)方式進(jìn)行表達(dá)。基因工程抗體技術(shù)的步驟45生物制藥醫(yī)學(xué)宣教1、獲取目的基因基因工程抗體技術(shù)的

29、步驟45生物制藥醫(yī)學(xué)宣教A、原核細(xì)胞表達(dá) 融合表達(dá)抗體末端附加一段其它肽段（如膜蛋白），作為標(biāo)簽，有利于對抗體文庫進(jìn)行淘篩，且有利于對克隆和抗體活性進(jìn)行鑒定。（產(chǎn)物定位于細(xì)胞膜上） 分泌型表達(dá)利用琥珀終止密碼（TGA）的終止作用，在無琥珀抑制基因的菌株中進(jìn)行表達(dá)，形成可溶性抗體。46生物制藥醫(yī)學(xué)宣教46生物制藥醫(yī)學(xué)宣教B 真核細(xì)胞表達(dá) 用于表達(dá)基因工程抗體的真核細(xì)胞有酵母、昆蟲細(xì)胞、中國倉鼠卵細(xì)胞和真菌等，而且這些細(xì)胞的表達(dá)都是分泌型表達(dá)。真核細(xì)胞表達(dá)抗體的方式在病毒病的防治和基因治療上有重要價值。C 轉(zhuǎn)基因植物表達(dá) 即將人的Ig基因組轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)，讓植物產(chǎn)生人源化抗體D 轉(zhuǎn)基因動物表達(dá) 即

30、將人的Ig基因組轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)，讓動物產(chǎn)生人源化抗體。47生物制藥醫(yī)學(xué)宣教B 真核細(xì)胞表達(dá)47生物制藥醫(yī)學(xué)宣教4 抗體庫技術(shù)1， 1989年英國劍橋Winter小組與Scripps研究所Lerner小組采用PCR克隆到全部抗體基因或?qū)g的重鏈和輕鏈的基因片段隨機(jī)配對克隆入適當(dāng)?shù)娜斯ぽd體，并重組于原核表達(dá)細(xì)胞中。以標(biāo)記抗原即可篩選到相應(yīng)抗體， 當(dāng)時成為組合抗體庫技術(shù)抗體庫技術(shù)是抗體工程研究領(lǐng)域的一次新飛躍。之前，基因工程抗體技術(shù)只能對已有的單抗進(jìn)行改造，而抗體庫技術(shù)的誕生卻可以不通過動物免疫和細(xì)胞融合便可以從抗體庫中篩選得到全新的人源化的抗體，并通過細(xì)菌發(fā)酵或轉(zhuǎn)基因動植物生產(chǎn)出來?？贵w庫技術(shù)的

31、發(fā)展使得抗體工程技術(shù)進(jìn)入了一個全新的時期。48生物制藥醫(yī)學(xué)宣教4 抗體庫技術(shù)1， 1989年英國劍橋Winter小組與Sc噬菌體抗體-90年代初，抗體基因與單鏈?zhǔn)删w的外殼蛋白融合并表達(dá)于噬菌體表面，以固相化的抗原吸附相對應(yīng)的噬菌體抗體，經(jīng)過多次吸附洗脫擴(kuò)增，即可得到所需要抗體，稱噬菌體抗體。5、噬菌體抗體庫技術(shù)將抗體全套可變區(qū)基因組裝到噬菌體載體,并表達(dá)于噬菌體表面,所得到的多樣性噬菌體抗體的集合，稱為噬菌體抗體庫。利用噬菌體抗體庫，篩選并富集特異性抗體的過程，稱為噬菌體抗體庫技術(shù)。49生物制藥醫(yī)學(xué)宣教5、噬菌體抗體庫技術(shù)將抗體全套可變區(qū)基因組裝到噬菌體載體,并 噬菌體抗體庫技術(shù)的特點(diǎn)基因型

32、和表型相統(tǒng)一 選擇能力和擴(kuò)增能力相結(jié)合50生物制藥醫(yī)學(xué)宣教50生物制藥醫(yī)學(xué)宣教51生物制藥醫(yī)學(xué)宣教51生物制藥醫(yī)學(xué)宣教噬菌體抗體庫的構(gòu)建52生物制藥醫(yī)學(xué)宣教噬菌體抗體庫的構(gòu)建52生物制藥醫(yī)學(xué)宣教篩選流程+噬菌體抗體庫 抗原再循環(huán)放大結(jié)合與洗滌洗脫53生物制藥醫(yī)學(xué)宣教篩選流程+噬菌體抗體庫 抗原再循環(huán)放大二、噬菌體抗體庫技術(shù)的特點(diǎn)基因工程抗體的延伸1、模擬天然全套抗體庫 抗體文庫可以達(dá)到或超過1011庫容，建庫的外源基因來自人體外周血、骨髓、骨髓細(xì)胞或脾臟的淋巴細(xì)胞提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA擴(kuò)增，這是人體多克隆細(xì)胞的總mRNA。使用的通用引物采自多個人體，具有人的種屬普遍性?？贵w的VH和

33、VL基因的隨機(jī)重組也增加了抗體的多樣性。能模擬天然全套抗體庫。 2、避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù) 由于抗體庫的大容量和極高的篩選效率，使得可以調(diào)出任意抗體基因。因而能免除了人工免疫動物（多克隆抗體)和細(xì)胞融合技術(shù)（單克隆抗體)。54生物制藥醫(yī)學(xué)宣教二、噬菌體抗體庫技術(shù)的特點(diǎn)基因工程抗體的延伸54生物制藥醫(yī)3、可獲得高親和力的人源化抗體 在噬菌體抗體庫技術(shù)中VH和VL基因的隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過程，所用的抗體基因又都來自人體，因此，所產(chǎn)生的抗體必然都是高親和力的人源化抗體。 基因工程抗體及抗體庫的優(yōu)點(diǎn)：（1）通過基因工程技術(shù)改造，可以降低抗體的免疫原性，使抗體人源化，消除排斥（HAM

34、A）反應(yīng)；（2）基因工程抗體的分子質(zhì)量較小，更利于穿透血管壁，進(jìn)入病灶的核心部位，從而改善其體內(nèi)藥代動力學(xué)性質(zhì)；（3）利用抗體庫技術(shù)，不需用抗原免疫動物便可以獲得針對任何一種抗原決定簇的抗體，甚至制備出用單克隆抗體技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)的新型抗體：（4）可以采用原核、真核表達(dá)系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)基因動植物生產(chǎn)出大量的基因工程抗體，降低了生產(chǎn)成本。55生物制藥醫(yī)學(xué)宣教3、可獲得高親和力的人源化抗體基因工程抗體及抗體庫的優(yōu)點(diǎn)：5小鼠抗體嵌合抗體重構(gòu)抗體人源抗體抗體人源化56生物制藥醫(yī)學(xué)宣教小鼠抗體嵌合抗體重構(gòu)抗體人源抗體抗體人源化56生物制藥醫(yī)學(xué)宣5 抗體應(yīng)用抗原抗體特異性結(jié)合，在體內(nèi)或體外均可呈現(xiàn)某種反應(yīng)。(1)

35、體內(nèi)用作治療藥物，可表現(xiàn)為溶菌、殺菌、促進(jìn)吞噬或中和毒素等作用。(2) 體外作為診斷試劑，由于抗原性狀和反應(yīng)條件不同，可發(fā)生凝集或沉淀等可見反應(yīng)，故可用已知抗體來鑒定抗原，做病原學(xué)的診斷和血型測定，稱為血清學(xué)鑒定，即作為診斷試劑。57生物制藥醫(yī)學(xué)宣教5 抗體應(yīng)用抗原抗體特異性結(jié)合，在體內(nèi)或體外均可呈現(xiàn)某種反 從20世紀(jì)40年代開始，現(xiàn)代免疫學(xué)有了迅速地發(fā)展，逐漸形成了3大類抗體診斷藥物， 血清學(xué)鑒定用的抗體制劑、 免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體制劑 體內(nèi)導(dǎo)向診斷藥物。其中體外試驗(yàn)用的，習(xí)慣上稱為試劑，體內(nèi)導(dǎo)向診斷用的，則稱為藥物。（一） 抗體診斷試劑58生物制藥醫(yī)學(xué)宣教 從20世紀(jì)40年代開始，現(xiàn)代免疫

36、學(xué)有了迅速地發(fā)展，逐漸形血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑 血清學(xué)鑒定是指用已知抗體來鑒定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的診斷和血型鑒定。常用的方法是凝集反應(yīng)。用于 病原菌診斷 癌胚抗原測定 妊娠免疫診斷 不完全血型抗體檢查等。59生物制藥醫(yī)學(xué)宣教血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑59生物制藥醫(yī)學(xué)宣教乙型肝炎病毒表面抗原的反向被動血凝診斷試劑原理是，紅細(xì)胞經(jīng)甲醛處理后，在酸性條件下能吸附蛋白質(zhì)，當(dāng)純化的抗HBs血清吸附其上時便具有抗體活性，若待測樣品中存在有HBsAg時，則發(fā)生特異性結(jié)合而使血細(xì)胞發(fā)生凝集。病原微生物抗體紅細(xì)胞觀察：紅細(xì)胞凝集60生物制藥醫(yī)學(xué)宣教乙型肝炎病毒表面抗原的反向被動血凝診斷試劑病原微

37、生物抗體紅細(xì)生物制藥醫(yī)學(xué)宣教培訓(xùn)課件ABO血型檢測重要的是ABO血型系統(tǒng)。按人紅細(xì)胞表面帶有的A或B種凝集原，可將血型分為A、B、AB和O型4種，血清中含有的凝集素類型見下表。輸血時，輸入的紅細(xì)胞凝集原可與受血者血液中的凝集素發(fā)生凝集反應(yīng)，所以必須預(yù)先驗(yàn)血型A型血紅細(xì)胞上含有凝集原B凝集原A凝集原B型血A和B凝集原AB型血無凝集原O型血血清中B凝集素A凝集素?zé)o凝集素A和B凝集素輸血凝集反應(yīng)A B AB O A B AB O A B AB O 萬能輸血者萬能受血者A B AB O 輸血凝集原受血凝集素輸血凝集原輸血凝集原輸血凝集原受血凝集素受血凝集素受血凝集素62生物制藥醫(yī)學(xué)宣教ABO血型檢測重

38、要的是ABO血型系統(tǒng)。按人紅細(xì)胞表面帶有的A二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑 給抗體標(biāo)記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應(yīng)放大，使常規(guī)方法不能觀察的反應(yīng)得以顯現(xiàn)，因而大幅度提高抗原抗體反應(yīng)的敏感性，用于對微量抗原物質(zhì)進(jìn)行定性或定量檢測。 結(jié)合顯微鏡或電子顯微鏡技術(shù)，還能對抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的定位測定。除用于臨床診斷之外，還能為探討發(fā)病機(jī)制提供有力的研究手段。免疫標(biāo)記技術(shù)有3種基本類型： 免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù)。標(biāo)記分子抗體抗原放射性核素?zé)晒馑豀RP，酶信號放大63生物制藥醫(yī)學(xué)宣教二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑標(biāo)記分子抗體抗原放射性核素信號1、熒光抗體診斷試劑 熒

39、光抗體是用熒光色素，如異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、藻紅素（PE）等標(biāo)記抗體球蛋白，即成為熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質(zhì)的組織切片或細(xì)胞，熒光抗體就與抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達(dá)到診斷或定位的目的。標(biāo)記分子抗體抗原只需標(biāo)記二抗，可檢測多種抗原標(biāo)記后只可檢測一種抗原64生物制藥醫(yī)學(xué)宣教1、熒光抗體診斷試劑標(biāo)記分子抗體抗原只需標(biāo)記二抗，可檢測多種2、免疫酶抗體診斷試劑 免疫酶技術(shù)是用酶標(biāo)記抗體來檢測抗原的方法，本法分為免疫酶染色（組化法）和酶免疫測定（EIA）兩種類型。（1）免疫酶染色法：當(dāng)加入酶的底物時，底物在酶的催化作用下發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。該

40、物質(zhì)不需特殊儀器，在光學(xué)顯微鏡下即能觀察。（2）免疫酶測定法：用酶標(biāo)記已知抗體或抗免疫球蛋白（抗抗體），與待查配體抗原混合反應(yīng)形成抗原抗體結(jié)合物后，加入酶的底物進(jìn)行顯色，根據(jù)呈色程度使用分光光度計測知待測物質(zhì)的含量65生物制藥醫(yī)學(xué)宣教2、免疫酶抗體診斷試劑65生物制藥醫(yī)學(xué)宣教 近年來發(fā)展起來的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是酶免疫測定在方法上的一個重大改進(jìn)，其特點(diǎn)是利用抗原或抗體等蛋白質(zhì)容易吸附于聚苯乙烯塑料等表面的性質(zhì)，使抗原抗體反應(yīng)在塑料管壁表面上進(jìn)行，從而大大簡化了抗原抗體結(jié)合物的分離手續(xù)。本法用途廣泛，敏感性高，既可定性檢測微量抗原，也可定量測定微生物成分、激素等微量抗原物質(zhì)。（ELISA）enzy

41、me linked immunosorbent assay 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)66生物制藥醫(yī)學(xué)宣教 近年來發(fā)展起來的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是酶免疫測定在方固相抗體待測標(biāo)本含抗原酶標(biāo)抗體EE酶催化的底物 無色E酶催化形成的產(chǎn)物 帶色的洗去多余標(biāo)本洗去多余酶標(biāo)抗體 雙抗體夾心法測定抗原洗去多余抗體酶免疫檢測儀測量產(chǎn)物顏色的光密度，就可定量測定抗原67生物制藥醫(yī)學(xué)宣教固相抗體待測標(biāo)本酶標(biāo)抗體EE酶催化的底物E酶催化形成的三、導(dǎo)向診斷藥物 腫瘤放射免疫顯像為導(dǎo)向治療的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。1、是將抗腫瘤單克隆抗體（Ab）與二乙基三胺五乙酸（DTPA）在體外偶聯(lián)成AbDTPA，再注人體內(nèi)后，就能與腫瘤組織相結(jié)合。由

42、于抗體分子量較大，這一過程需3天才能完成。2、3天后注入半衰期短的放射性核素In113M（半衰期100 min）。由于原先注人的DTPA是重金屬離子絡(luò)合劑，所以In113M就可以結(jié)合到DTPA分子上，從而使腫瘤組織顯像。這一過程在2h之內(nèi)即可完成。68生物制藥醫(yī)學(xué)宣教三、導(dǎo)向診斷藥物1、是將抗腫瘤單克隆抗體（Ab）與二乙基三胺DTPAAb注入人體DTPAAb腫瘤組織放射性核素In113M（DTPAAb腫瘤組織腫瘤組織顯像放射性核素69生物制藥醫(yī)學(xué)宣教DTPAAb注入人體DTPAAb腫瘤組織放射性核素In111、導(dǎo)向診斷藥物的優(yōu)點(diǎn)有以下幾個： 在體內(nèi)有確切定位腫瘤的作用，準(zhǔn)確性可達(dá)90以上，靈敏度幾乎達(dá)100。在體內(nèi)可檢出0.5cm大小的病灶，并可檢出肺、腦等部位的轉(zhuǎn)移灶。小分子抗體容易到達(dá)腫瘤部位，可明顯提高T（腫瘤組織）/NT（非腫瘤組織）值。抗體在腫瘤部位，可保留69日。能觀察抗體在血中的半衰期和可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。70生物制藥醫(yī)學(xué)宣教1、導(dǎo)向診斷藥物的優(yōu)點(diǎn)有以下幾個：70生物制藥醫(yī)學(xué)宣教2 抗體治療藥物 以抗體為載體的導(dǎo)向治