放射免疫分析全面版課件

1、1放射免疫分析第1頁/共119頁1放射免疫分析第1頁/共119頁第1講 放射免疫分析 的概念和產(chǎn)生放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)是最早的一種標(biāo)記免疫分析，通過放射性示蹤物觀察抗原與抗體的結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物測定微量物質(zhì)。第2頁/共119頁第1講 放射免疫分析 的概念和產(chǎn)生1952年I.A. Mirsky提出老年性糖尿病可能不是因?yàn)橐葝u素分泌不足引起的，而是由于肝胰島素酶降解胰島素的速度加快引起的。第3頁/共119頁1952年I.A. Mirsky提出老年性糖尿病可能不是因?yàn)闉榱蓑?yàn)證這種觀點(diǎn)，S.A. Berson和R.S. Yalow等人(1956)給非糖尿病和糖尿病受試者靜

2、脈注射131I標(biāo)記胰島素以研究其代謝，他們比較了接受胰島素治療的病人和從未接受過胰島素的受試者的血漿，發(fā)現(xiàn)前者胰島素的消失速度比后者慢得多，提出外源胰島素的注射使病人體內(nèi)產(chǎn)生了抗體，與抗體的結(jié)合導(dǎo)致胰島素消失速度降低。 第4頁/共119頁為了驗(yàn)證這種觀點(diǎn)，S.A. Berson和R.S. YaloR.S. YalowS.A. Berson第5頁/共119頁R.S. YalowS.A. Berson第5頁/共119頁由于胰島素抗體的濃度太低，用以往的免疫學(xué)技術(shù)不能測定，因此Berson和Yalow等人采用放射性標(biāo)記法測定濃度極低的抗原-抗體復(fù)合物。電泳結(jié)果表明在接受胰島素治療的病人的血漿中，胰島

3、素與一種球蛋白結(jié)合，證明胰島素抗體確實(shí)存在。第6頁/共119頁由于胰島素抗體的濃度太低，用以往的免疫學(xué)技術(shù)不能測定，因此B值得一提的是，在20世紀(jì)50年代中期，免疫學(xué)家還不能接受“胰島素抗體”這一概念。Berson和Yalow等人的論文被Science退稿，剛開始投Journal of Clinical Investigation(JCI)也是退稿，后來向JCI的編輯作出妥協(xié)，從標(biāo)題中刪去“胰島素抗體”字樣，論文才得以在JCI上發(fā)表。第7頁/共119頁值得一提的是，在20世紀(jì)50年代中期，免疫學(xué)家還不能接受“胰Berson和Yalow等人的工作引發(fā)了免疫學(xué)上的一場革命?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為一些小分子量

4、的多肽如后葉加壓素和后葉催產(chǎn)素也可以是抗原。第8頁/共119頁Berson和Yalow等人的工作引發(fā)了免疫學(xué)上的一場革命。在方法上，Berson和Yalow等人提出：當(dāng)抗體已定量時(shí)，標(biāo)記胰島素和抗體的結(jié)合與非標(biāo)記胰島素的濃度成函數(shù)關(guān)系，這就為血漿胰島素的放射免疫分析提供了基礎(chǔ)。第9頁/共119頁在方法上，Berson和Yalow等人提出：當(dāng)抗體已定量時(shí)，在隨后的幾年中，他們又做了一些研究工作，包括胰島素與其抗體反應(yīng)的定量和可得抗血清的物種特異性等，這些必要的工作使放射免疫分析由理論轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)踐，于1959年首次完成人血漿(不進(jìn)行抽提)胰島素的測定。第10頁/共119頁在隨后的幾年中，他們又做了一

5、些研究工作，包括胰島素與其抗體反RIA具有技術(shù)簡易、價(jià)格便宜、特異性強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷。到20世紀(jì)60年代晚期，RIA已成為一項(xiàng)重要的分析技術(shù)。第11頁/共119頁RIA具有技術(shù)簡易、價(jià)格便宜、特異性強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛據(jù)估計(jì)，在1975年的一年之中，全美進(jìn)行RIA的臨床實(shí)驗(yàn)室有4000個(gè)以上。Yalow因此榮獲1977年Nobel生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)(遺憾的是，Berson于1972年因心臟病逝世，未能共享殊榮)。第12頁/共119頁據(jù)估計(jì)，在1975年的一年之中，全美進(jìn)行RIA的臨床實(shí)驗(yàn)室有第2講 放射免疫分析 的原理和特點(diǎn)當(dāng)抗體初始濃度Ab0低于標(biāo)記抗原初始

6、濃度Ag*0和非標(biāo)記抗原初始濃度Ag0之和時(shí)，非標(biāo)記抗原Ag將與標(biāo)記抗原Ag*競爭結(jié)合抗體Ab，分別生成非標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物Ag-Ab和標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物Ag*-Ab。第13頁/共119頁第2講 放射免疫分析 的原理和特點(diǎn)Ag* + AbAg*-Ab+AgAg-Ab第14頁/共119頁Ag* + AbAg*-Ab+Ag-Ab第14頁當(dāng)Ab0和Ag*0都已確定時(shí)，如果Ag0低，則生成的Ag*-Ab多(其濃度B高)，剩余的標(biāo)記抗原Ag*少(其濃度F低)，B/F值較高；相反，如果Ag0高，則B低，F(xiàn)高，B/F值較低。第15頁/共119頁當(dāng)Ab0和Ag*0都已確定時(shí)，如果Ag0低，則生在測定時(shí)，A

7、b0和Ag*0都是已知的。以B/F值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液非標(biāo)記抗原初始濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，在相同條件下測定未知非標(biāo)記抗原的B/F值，即可用回歸方程求得未知非標(biāo)記抗原的初始濃度。第16頁/共119頁在測定時(shí)，Ab0和Ag*0都是已知的。以B/F值為縱0Ag0B/F標(biāo)準(zhǔn)曲線第17頁/共119頁0Ag0B/F標(biāo)準(zhǔn)曲線第17頁/共119頁 根據(jù)加樣順序與溫育次數(shù)的不同，放射免疫分析可分為如下三種。平衡法：將非標(biāo)記抗原、抗體、標(biāo)記抗原依次加入反應(yīng)管，混勻后一次性溫育至反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，再加分離劑使B與F分離。第18頁/共119頁 根據(jù)加樣順序與溫育次數(shù)的不同，放射免疫順序加樣法：先將

8、非標(biāo)記抗原與抗體在反應(yīng)管內(nèi)作第一次溫育，待反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，加入標(biāo)記抗原，作第二次溫育，然后分離B與F。第19頁/共119頁順序加樣法：先將非標(biāo)記抗原與抗體在反應(yīng)管內(nèi)作第一次溫育，待反急診檢測法：為臨床上快出結(jié)果而提出的反應(yīng)方式，不等RIA反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡就終止反應(yīng)。第20頁/共119頁急診檢測法：為臨床上快出結(jié)果而提出的反應(yīng)方式，不等RIA反應(yīng)放射免疫分析巧妙地結(jié)合了抗體抗原反應(yīng)的高特異性和放射性核素標(biāo)記的高靈敏度。RIA的靈敏度極高，可檢出0.1 pg/ml(0.05 pM)的胃泌激素。第21頁/共119頁放射免疫分析巧妙地結(jié)合了抗體抗原反應(yīng)的高特異性和放射性核素標(biāo)相比之下，受體位點(diǎn)分析

9、(receptor site assay)的最低檢出濃度一般至少是RIA的10-100倍。酶標(biāo)記分析(enzyme marker assay)由于作為標(biāo)記的酶分子與抗原共價(jià)連接，抗原-抗體反應(yīng)存在空間阻礙，分析靈敏度的降低幾乎不可避免。第22頁/共119頁相比之下，受體位點(diǎn)分析(receptor site assa第3講 放射免疫分析的發(fā)展第1代(1959-1964)：Berson和Yalow等人于1959年首次提出了競爭抑制免疫反應(yīng)原理，創(chuàng)建了RIA技術(shù)檢測人血漿胰島素的水平。1960年，Ekins根據(jù)RIA相同原理，以某些天然特異性蛋白作結(jié)合劑，建立了競爭結(jié)合蛋白分析法(CPBA)檢測血漿

10、中的甲狀腺素、甾體類激素等小分子半抗原。因操作程序比較復(fù)雜，難以應(yīng)用到臨床樣品的常規(guī)檢測。第23頁/共119頁第3講 放射免疫分析的發(fā)展第1代(1959-1964)：B第2代(1965-1970)：RIA技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢受到生物醫(yī)學(xué)研究者的高度關(guān)注，許多學(xué)者對(duì)這一新的檢測技術(shù)進(jìn)行了大量方法學(xué)的研究，在抗原-抗體復(fù)合物和游離標(biāo)記抗原分離方法上取得了滿意的結(jié)果，簡化了實(shí)驗(yàn)程序，將RIA和CPBA技術(shù)推進(jìn)到了臨床實(shí)用水平，為建立試劑盒產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了條件。第24頁/共119頁第2代(1965-1970)：RIA技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢受到生物醫(yī)第3代(1971-1980)：1970年Brown等人將三碘甲腺原氨

11、酸(T3)和聚賴氨酸以共價(jià)鍵偶聯(lián)制成結(jié)合物(T3-PLL)，免疫動(dòng)物獲得T3抗體，打破了半抗原不能制備出抗體的論斷，1971年Chopra首次完成了血清T4 RIA方法的建立。從此，RIA完全取代了CPBA檢測小分子化合物，擴(kuò)大了RIA技術(shù)應(yīng)用范圍，推動(dòng)了RIA試劑盒產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。第25頁/共119頁第3代(1971-1980)：1970年Brown等人將三碘第4代(1981-1995)：早在l975年，Milstein和Kshler將綿羊紅細(xì)胞注射給小鼠，將獲得的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，得到了雜交細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、分離、成株等系列步驟后，首次制備出小鼠抗綿羊紅細(xì)胞的單克隆抗體(mAb)。這一

12、重大研究成果為RIA及其他免疫分析技術(shù)提供了新型特異性抗體。進(jìn)入20世紀(jì)80年代，mAb制備技術(shù)的完善和許多固相載體材料的研制成功，將試管固相、塑料球等包被mAb制成固相抗體，傳統(tǒng)IRMA技術(shù)的靈敏度、特異性和檢測量程度提高到了一個(gè)新水平。第26頁/共119頁第4代(1981-1995)：早在l975年，Milstei第5代：近年來，磁性微粒子在標(biāo)記免疫分析中的應(yīng)用迅速，它是在磁性活性炭和磁性微球的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。磁性微粒子和磁性微球主要差別是直徑的大小和均一性。前者直徑為800-2000 nm，均一性良好，在液體中具有較高的懸浮性，而磁性微球則否。磁性微粒子表面帶有活性基團(tuán)，如-CONH2

13、、-NH2和-COOH等，經(jīng)偶聯(lián)劑以共價(jià)鍵結(jié)合抗體制成磁性固相抗體。其包被量大、均一性高、牢固性強(qiáng)等特點(diǎn)是物理吸附難以比擬的。磁性微粒子固相抗體或固相親和素首先應(yīng)用于CLIA試劑盒的制造，最近也應(yīng)用于IRMA和RIA。第27頁/共119頁第5代：近年來，磁性微粒子在標(biāo)記免疫分析中的應(yīng)用迅速，它是在(1)液相雙標(biāo)記IRMA技術(shù)：將兩株mAb分別標(biāo)記125I和異硫氰酸熒光素(fluorescein isothicyanate，F(xiàn)ITC)作為標(biāo)記試劑，檢測時(shí)將樣品和標(biāo)記試劑加至試管中，溫育后加入磁性固相抗FITC，5 min后，置于磁性分離器上，洗滌后即測量放射性?？乖蜆?biāo)記抗體在液相中反應(yīng)生成雙抗

14、體夾心復(fù)合物，免疫反應(yīng)達(dá)到平衡所需時(shí)間比固相試管法更短，各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)均超過目前廣泛采用的IRMA法。第28頁/共119頁(1)液相雙標(biāo)記IRMA技術(shù)：將兩株mAb分別標(biāo)記125I和(2)磁性固相第二抗體RIA競爭法：這一免疫反應(yīng)模式實(shí)際上是一種新型的磁性二抗分離技術(shù)，有兩種不同的第二抗體可制成磁性固相供快速分離。一種是制備抗第一抗體的二抗磁性微粒子固相作分離劑，另一種是將第一抗體IgG標(biāo)記FITC、抗FITC抗體和磁性微粒子結(jié)合作為分離劑，兩種分離劑檢測結(jié)果高度一致。與常規(guī)試劑盒相比，優(yōu)點(diǎn)是不必加復(fù)合二抗分離劑以及離心沉淀分離步驟，簡化了程序，縮短了時(shí)間，提高了精密度。第29頁/共119頁(2

15、)磁性固相第二抗體RIA競爭法：這一免疫反應(yīng)模式實(shí)際上是(3)磁性第一抗體固相RIA競爭法：此種免疫反應(yīng)模式是將第一抗體制成磁性微粒子固相，檢測程序較磁性第二抗體分離劑法更簡便，可一步完成。只需將樣品、125I標(biāo)記抗原和磁性微粒子固相抗體加至塑料管中，溫育后置磁性分離器上傾出上清液，經(jīng)一次洗滌后即可測量放射性強(qiáng)度。在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，此模式非特異結(jié)合過高，而操作人員又很難發(fā)現(xiàn)，從而降低了檢測技術(shù)的靈敏度和精密度，影響測值的準(zhǔn)確性。第30頁/共119頁(3)磁性第一抗體固相RIA競爭法：此種免疫反應(yīng)模式是將第一(4)自身抗體快速檢測法：許多臨床常見病、多發(fā)病的發(fā)病機(jī)理與自身免疫狀態(tài)關(guān)系密切，如甲狀

16、腺疾病、糖尿病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，檢測相關(guān)自身抗體對(duì)臨床診斷及療效判斷是一種有價(jià)值的指標(biāo)。采用磁性微粒子RIA技術(shù)，具有簡便、快速、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，其原理是血清中的抗體和125I-抗原混合溫育，生成抗原-抗體復(fù)合物，然后反應(yīng)液中加入抗人IgG磁性微粒子分離劑5 min，置于磁性分離器上，棄上清液，測放射性。放射性強(qiáng)度與血清中自身抗體量呈正比。第31頁/共119頁(4)自身抗體快速檢測法：許多臨床常見病、多發(fā)病的發(fā)病機(jī)理與(5)生物活性肽IRMA法：生物活性肽是一類分子量為(2-4) 103的肽類，參與多種生理生化代謝和互相調(diào)節(jié)過程，檢測這類物質(zhì)水平對(duì)研究心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展及防治具有重要意

17、義。最近的實(shí)驗(yàn)研究表明，生物活性肽在人血漿中以多種形式存在。既有前體物又有降解產(chǎn)物的片段，目前檢測這類化合物采用多抗RIA競爭法，抗體和降解物片段有不同程度的免疫反應(yīng)，測值為待測物和降解物的總和，稱為免疫反應(yīng)樣物質(zhì)，不能表示待測物的真實(shí)濃度。隨著肽合成技術(shù)的完善和mAb制備方法的改進(jìn)，已可由生物制品公司提供肽的N端和C端肽類化合物片段及相應(yīng)的mAb，使建立生物活性肽IRMA技術(shù)成為現(xiàn)實(shí)。研究者應(yīng)用這一新的技術(shù)研制的人血清C-肽磁性微粒子RIA試劑盒，其各項(xiàng)方法學(xué)指標(biāo)超過目前市場上的產(chǎn)品水平。第32頁/共119頁(5)生物活性肽IRMA法：生物活性肽是一類分子量為(2-4具有類似原理的其他分析方

18、法免疫放射分析(IRMA) 標(biāo)記的是抗體，分為如下兩種。單位點(diǎn)IRMA：抗原為小分子抗原，只有一個(gè)抗原決定簇，見下頁圖。第33頁/共119頁具有類似原理的其他分析方法免疫放射分析(IRMA)第33頁/ 上圖中ImAd-Ag為固相抗原免疫吸附劑，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗原。Ag + Ab*Ag-Ab*+ImAd-AgImAd-Ag-Ab*第34頁/共119頁 上圖中ImAd-Ag為固相抗原免疫吸附劑，一般用聚苯乙雙位點(diǎn)IRMA：又稱雙抗體夾心法，抗原有兩個(gè)抗原決定簇，所用的兩種抗體在與同一抗原結(jié)合時(shí)互不干擾，見下頁圖。第35頁/共119頁雙位點(diǎn)IRMA：又稱雙抗體夾心法，抗原有兩個(gè)抗原決定簇，

19、所用 上圖中ImAd-Ab為固相抗體免疫吸附劑，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗體。Ag + ImAd-AbImAd-Ab-Ag+Ab*ImAd-Ab-Ag-Ab*第36頁/共119頁 上圖中ImAd-Ab為固相抗體免疫吸附劑，一般用聚苯 從加樣順序來看，雙位點(diǎn)IRMA分為如下三種。正向兩步法：待測抗原先與固相抗體結(jié)合，再與標(biāo)記抗體結(jié)合，然后去除游離的標(biāo)記抗體，測固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物的放射性計(jì)數(shù)。第37頁/共119頁 從加樣順序來看，雙位點(diǎn)IRMA分為如下反向兩步法：待測抗原先與標(biāo)記抗體結(jié)合，再與固相抗體結(jié)合，然后去除游離的標(biāo)記抗體，測固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物的放射性計(jì)數(shù)。第38頁/

20、共119頁反向兩步法：待測抗原先與標(biāo)記抗體結(jié)合，再與固相抗體結(jié)合，然后一步法：又稱同時(shí)加樣法，待測抗原與固相抗體和標(biāo)記抗體同時(shí)反應(yīng)，然后去除游離的標(biāo)記抗體，測固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物的放射性計(jì)數(shù)。第39頁/共119頁一步法：又稱同時(shí)加樣法，待測抗原與固相抗體和標(biāo)記抗體同時(shí)反應(yīng)放射受體分析3H標(biāo)記的四環(huán)素可與樣品中四環(huán)素類藥物競爭結(jié)合特異性受體，當(dāng)樣品中殘留有四環(huán)素類藥物時(shí)，殘留藥物與受體結(jié)合，從而阻止了標(biāo)記四環(huán)素與受體的結(jié)合。樣品中的四環(huán)素類藥物含量越高則結(jié)合的受體越多，而標(biāo)記四環(huán)素結(jié)合的受體越少。第40頁/共119頁放射受體分析第40頁/共119頁第4講 放射免疫分析的應(yīng)用 RIA除了

21、用于測定胰島素、胃泌激素外，還被用于測定維生素B12和甲狀腺素等。在臨床上，用放射免疫分析可檢測2-微球蛋白和鐵蛋白等?？捎肦IA測定的物質(zhì)如下：一、肽類激素垂體激素：生長激素、促腎上腺皮質(zhì)素、促黑激素(-促黑激素、-促黑激素)、糖蛋白類(促甲狀腺素、促卵泡激素、促黃體激素)、催乳素、促脂素、加壓素、催產(chǎn)素絨毛膜激素：人絨毛膜促性腺激素、人絨毛膜生長促乳素胰腺激素：胰島素、胰高血糖素、胰多肽第41頁/共119頁第4講 放射免疫分析的應(yīng)用 RIA除了用于測定胰島素趨鈣激素：甲狀旁腺素、降鈣素胃腸激素：胃泌素、促胰液素、縮膽囊肽、血管活性腸多肽、胃抑制多肽血管活性組織激素：血管緊張素、緩激肽釋放抑

22、制因子：促甲狀腺素釋放激素、促黃體激素釋放激素、促生長素抑制素其他肽：P物質(zhì)、內(nèi)啡肽、腦啡肽第42頁/共119頁趨鈣激素：甲狀旁腺素、降鈣素第42頁/共119頁二、非肽類激素甲狀腺激素：甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、反三碘甲腺原氨酸類固醇：醛固酮、皮質(zhì)類固醇、雌激素、雄激素、孕酮前列腺素生物胺：5-羥色胺、褪黑激素第43頁/共119頁二、非肽類激素第43頁/共119頁三、非激素物質(zhì)藥物與維生素：強(qiáng)心苷、濫用藥物、精神活性藥物、抗生素、中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑、維生素A、葉酸環(huán)核苷酸酶：C1酯酶、果糖1,6-二磷酸酶、纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、碳酸酐酶同工酶、醛糖還原酶、羧肽酶、胰

23、彈性蛋白酶第44頁/共119頁三、非激素物質(zhì)第44頁/共119頁病毒：肝炎相關(guān)抗原、鼠白血病病毒(粗病毒，勞氏病毒，莫氏病毒)、Mason-Pfizer猴病毒腫瘤抗原：癌胚抗原、甲胎蛋白血清蛋白：甲狀腺素結(jié)合球蛋白、免疫球蛋白(G、E、A、M)、備解素、纖維蛋白原、阿樸脂蛋白B、肌紅蛋白、髓基本蛋白其他：內(nèi)在因子、類風(fēng)濕因子、凝血因子XII、后葉激素運(yùn)載蛋白、葡萄球菌腸毒素第45頁/共119頁病毒：肝炎相關(guān)抗原、鼠白血病病毒(粗病毒，勞氏病毒，莫氏病毒第5講 非標(biāo)記抗原的準(zhǔn)備制備標(biāo)記抗原、特異性抗體和制作標(biāo)準(zhǔn)曲線都需要高純度的非標(biāo)記抗原。非標(biāo)記抗原純化的方法有：鹽析法、凝膠過濾法、離子交換法、

24、柱層析法、親和層析法、免疫沉淀法、電泳法和高效液相色譜法等。第46頁/共119頁第5講 非標(biāo)記抗原的準(zhǔn)備制備標(biāo)記抗原、特異性抗體和制作標(biāo)準(zhǔn)若是半抗原，則先要制備成人工抗原。對(duì)于具有氨基的半抗原，可用碳化二亞胺法合成與載體羧基以肽鍵連接的人工抗原，或者用戊二醛法合成與載體氨基以西佛堿鍵連接的人工抗原。 第47頁/共119頁若是半抗原，則先要制備成人工抗原。對(duì)于具有氨基的半抗原，可用第48頁/共119頁第48頁/共119頁第49頁/共119頁第49頁/共119頁對(duì)于具有羧基的半抗原，可用碳化二亞胺法或氯甲酸異丁酯法合成與載體氨基以肽鍵連接的人工抗原。第50頁/共119頁對(duì)于具有羧基的半抗原，可用碳

25、化二亞胺法或氯甲酸異丁酯法合成與第51頁/共119頁第51頁/共119頁具有羥基、酮基、酚基的半抗原先分別用琥珀酸酐法、O-(羧甲基)羥胺法、一氯醋酸鈉法和重氮化的對(duì)氨基苯甲酸法合成具有羧基的半抗原衍生物，再用碳化二亞胺法或氯甲酸異丁酯法合成人工抗原。第52頁/共119頁具有羥基、酮基、酚基的半抗原先分別用琥珀酸酐法、O-(羧甲基第53頁/共119頁第53頁/共119頁第54頁/共119頁第54頁/共119頁第55頁/共119頁第55頁/共119頁第56頁/共119頁第56頁/共119頁第6講 標(biāo)記抗原的準(zhǔn)備 多數(shù)采用125I標(biāo)記抗原，標(biāo)記方法有如下幾種。6.1 氯胺-T法氯胺-T(N-氯-p

26、-甲苯磺胺鈉，見下頁圖)在溶液中能緩慢釋放出次氯酸，該酸是一種溫和氧化劑，可將125I離子氧化成125I，后者可取代抗原Tyr殘基苯環(huán)上3和5位上的H。抗原中的各Tyr的碘化程度不一樣，取決于Tyr的暴露程度。第57頁/共119頁第6講 標(biāo)記抗原的準(zhǔn)備 多數(shù)采用125第58頁/共119頁第58頁/共119頁不足之處是可能引起抗原免疫活性的丟失，原因在于：碘取代Tyr上的H改變了抗原性；內(nèi)照射損傷了抗原；氧化劑對(duì)抗原造成損傷；試劑中聚合的碘引起抗原損傷。第59頁/共119頁不足之處是可能引起抗原免疫活性的丟失，原因在于：碘取代Tyr其操作流程為： 將試劑溶解于磷酸緩沖液中，pH為。在反應(yīng)管中加入

27、抗原5 g(10 L)。加Na125I 37 MBq(10 L)。加氯胺-T 10 g(15 L)，邊加邊攪拌，三者混勻，反應(yīng)1 min。第60頁/共119頁其操作流程為： 第60頁/共119頁加入Na2S2O5 200 g(30 L)中止反應(yīng)。紙層析測定標(biāo)記率。Sephadex G-50凝膠過濾分離、純化。測定標(biāo)記抗原的放化純度、鑒定免疫活性、加防腐劑、加白蛋白稀釋，冷干，保存。第61頁/共119頁加入Na2S2O5 200 g(30 L)中止反應(yīng)。第66.2 酶促碘化法6.2.1 乳過氧化物酶法用乳過氧化物酶催化H2O2放出O2，將125I離子氧化成125I。它比氯胺-T法溫和，副反應(yīng)較少

28、，一般不改變抗原的三維結(jié)構(gòu)，可得到高免疫活性和高比活度的標(biāo)記抗原。第62頁/共119頁6.2 酶促碘化法第62頁/共119頁其操作流程為：將試劑溶解于0.4 mol/L醋酸緩沖液，pH為。在反應(yīng)管中加抗原5 g(10 L)。加乳過氧化物酶25 ng(10 L)。加H2O2 200 ng(10 L)。第63頁/共119頁其操作流程為：第63頁/共119頁具有羥基、酮基、酚基的半抗原先分別用琥珀酸酐法、O-(羧甲基)羥胺法、一氯醋酸鈉法和重氮化的對(duì)氨基苯甲酸法合成具有羧基的半抗原衍生物，再用碳化二亞胺法或氯甲酸異丁酯法合成人工抗原。準(zhǔn)確性是指測量值與真值的符合程度。急診檢測法：為臨床上快出結(jié)果而提

29、出的反應(yīng)方式，不等RIA反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡就終止反應(yīng)。當(dāng)Ab0和Ag*0都已確定時(shí)，如果Ag0低，則生成的Ag*-Ab多(其濃度B高)，剩余的標(biāo)記抗原Ag*少(其濃度F低)，B/F值較高；當(dāng)Ab0和Ag*0都已確定時(shí)，如果Ag0低，則生成的Ag*-Ab多(其濃度B高)，剩余的標(biāo)記抗原Ag*少(其濃度F低)，B/F值較高；放射性強(qiáng)度與血清中自身抗體量呈正比。用緩沖液沖洗Iodo-bead和反應(yīng)管，洗液與反應(yīng)液合并，后經(jīng)純化。具有類似原理的其他分析方法待測樣品作一系列稀釋，將其反應(yīng)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。在反應(yīng)管中加入抗原5 g(10 L)。加Na125I 37 MBq(10 L)?；靹颍磻?yīng)7 min

30、，再加上述H2O2 3 L，繼續(xù)反應(yīng)7 min。加入10 mmol/L巰基乙醇0.5 mL阻斷反應(yīng)1 min。加入載體NaI溶液1 mL。上葡聚糖凝膠柱分離純化。第64頁/共119頁具有羥基、酮基、酚基的半抗原先分別用琥珀酸酐法、O-(羧甲基6.2.2 葡萄糖氧化酶法葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶，能少量而不斷地、有控制地產(chǎn)生H2O2參與碘化反應(yīng)，對(duì)標(biāo)記抗原免疫活性的影響比乳過氧化物酶法更小。反應(yīng)易于控制，加入葡萄糖即能啟動(dòng)，加入含有0.1 N NaN3的緩沖液即能停止。第65頁/共119頁6.2.2 葡萄糖氧化酶法第65頁/共119頁6.3 聯(lián)接碘化法某些抗原缺乏Tyr或Tyr的碘化降低了抗原

31、的免疫活性，可用聯(lián)接碘化法。該法由Bolton和Hunter于1973年建立。主要步驟是先用氯胺-T法將3-(p-羥苯)-丙酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯用125I標(biāo)記，用苯抽提碘化產(chǎn)物，干燥后與抗原混合反應(yīng)1 h，碘化乙?；噪逆I與抗原的-NH2或-NH2連接。第66頁/共119頁6.3 聯(lián)接碘化法第66頁/共119頁其優(yōu)點(diǎn)是可避免與氧化劑接觸而導(dǎo)致的損傷；一般不會(huì)使His碘化。缺點(diǎn)是可能使重要的Lys酰基化而影響抗原與抗體的結(jié)合。第67頁/共119頁其優(yōu)點(diǎn)是可避免與氧化劑接觸而導(dǎo)致的損傷；一般不會(huì)使His碘化6.4 固相催化碘化法6.4.1 Iodogen碘化法Iodogen即氯甘脲，化學(xué)名稱為

32、1,3,4,6-四氯-3, 6-二苯甘脲，是一種固相催化劑。主要步驟：將Iodogen 1 mg溶于25 mL的二氯甲烷，取50 L加入反應(yīng)管，用N2吹干有機(jī)溶劑，即在反應(yīng)管底部形成Iodogen薄膜，加入Na125I和抗原，輕輕搖動(dòng)，反應(yīng)5-20 min，即可標(biāo)記抗原。第68頁/共119頁6.4 固相催化碘化法第68頁/共119頁6.4.2 Iodo-bead碘化法Iodo-bead是一種無孔聚苯乙烯小球，其上連接了氯胺-T衍生物(N-氯-苯磺酰胺鈉)。主要步驟：在2 mL帶蓋的塑料試管中加入5 L抗原(5 ng)，加45 L磷酸鹽緩沖液(，0.1 mol/L)，加2 L Na125I 37

33、 MBq，加一?；蚨嗔odo-bead，立即蓋上蓋，反應(yīng)5 min，用移液管把反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)試管。用緩沖液沖洗Iodo-bead和反應(yīng)管，洗液與反應(yīng)液合并，后經(jīng)純化。第69頁/共119頁6.4.2 Iodo-bead碘化法第69頁/共119頁6.5 標(biāo)記抗原的純化和鑒定標(biāo)記后反應(yīng)液中含有未標(biāo)記抗原、損傷的標(biāo)記抗原、未損傷的標(biāo)記抗原、Na125I和磷酸鹽等，只有未損傷的標(biāo)記抗原才是分析所需，其純化的方法有：離子交換法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、薄層層析法和高效液相色譜法等。第70頁/共119頁6.5 標(biāo)記抗原的純化和鑒定第70頁/共119頁一般認(rèn)為每個(gè)抗原分子標(biāo)記上一個(gè)125I原子

34、，對(duì)免疫活性影響不大，若標(biāo)記上二個(gè)125I原子則可能對(duì)免疫活性有影響，因此要測定標(biāo)記抗原的比活度。第71頁/共119頁一般認(rèn)為每個(gè)抗原分子標(biāo)記上一個(gè)125I原子，對(duì)免疫活性影響不比活度按如下公式計(jì)算：A YW比活度 =式中A為投入總放射性，Y為標(biāo)記率，W為投入待標(biāo)記抗原重量。第72頁/共119頁比活度按如下公式計(jì)算：A YW比活度 =式中A為投入總放射標(biāo)記抗原的免疫活性鑒定可用理化方法如電泳法、吸附法和凝膠過濾法等，也可測定標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合率，再測定標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原對(duì)抗體的親和力是否一致。第73頁/共119頁標(biāo)記抗原的免疫活性鑒定可用理化方法如電泳法、吸附法和凝膠過濾第7講 抗體的準(zhǔn)備

35、及標(biāo)記抗原-抗體 復(fù)合物與標(biāo)記抗原的分離7.1 多克隆抗體抗原的乳化：將抗原與福氏完全佐劑(石蠟油2份、羊毛脂1份、每mL另加卡介苗5-10 mg)混合制成乳化液。第74頁/共119頁第7講 抗體的準(zhǔn)備及標(biāo)記抗原-抗體 復(fù)合物與免疫動(dòng)物：一般用兔、豚鼠、山羊和綿羊作為免疫動(dòng)物，多數(shù)采用純種家兔(1.5-2.0 kg雄性健壯大耳白兔)，在同一批中應(yīng)有足夠數(shù)量的兔子，以便從中挑選高質(zhì)量的抗體。免疫劑量：每只兔子注射1-2 mg的抗原。第75頁/共119頁免疫動(dòng)物：一般用兔、豚鼠、山羊和綿羊作為免疫動(dòng)物，多數(shù)采用純免疫部位：在兔頸、背部的皮內(nèi)、皮下多點(diǎn)注射或肌肉、腳墊及近淋巴結(jié)的大腿外側(cè)注射。免疫時(shí)

36、間：對(duì)于大分子抗原，可在注射后6-8周采血測定抗體滴度。對(duì)于人工抗原，在注射后14-16周才可采血測定抗體滴度。第76頁/共119頁免疫部位：在兔頸、背部的皮內(nèi)、皮下多點(diǎn)注射或肌肉、腳墊及近淋7.2 抗體質(zhì)量鑒定特異性：若抗體與待測抗原的結(jié)合力強(qiáng)，與類似抗原的結(jié)合力弱，表示抗體特異性強(qiáng)。反之，表明類似抗原將對(duì)測定結(jié)果產(chǎn)生干擾。第77頁/共119頁7.2 抗體質(zhì)量鑒定第77頁/共119頁鑒定抗體特異性需作交叉反應(yīng)，其方法是將類似抗原配成不同的濃度，按照待測抗原相同的條件制作標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，求得各自的半抑制濃度(IC50)，按Thornecroft法計(jì)算交叉反應(yīng)率。第78頁/共119頁鑒定抗體特異性

37、需作交叉反應(yīng)，其方法是將類似抗原配成不同的濃度交叉反應(yīng)率(%)=待測抗原的IC50類似抗原的IC50 100第79頁/共119頁交叉反應(yīng)率(%)=待測抗原的IC50類似抗原的IC50 1親和力：抗體與抗原的親和力表示兩者結(jié)合的牢固程度。親和力大，則結(jié)合速度快、解離度小。反之，則結(jié)合速度慢、不牢固、易解離。第80頁/共119頁親和力：抗體與抗原的親和力表示兩者結(jié)合的牢固程度。親和力大，抗體親和力可用親和常數(shù)K表示。如果Ab0已確定，那么K =Ag*-AbAg*Ab=Ag*-AbAg*(Ab0Ag*-Ab)BF(Ab0B)B F =KAb0 KB第81頁/共119頁抗體親和力可用親和常數(shù)K表示。如

38、果Ab0已確定，那么K K值可通過作Scatchard圖求得，以B/F值為縱坐標(biāo)，以B濃度為橫坐標(biāo)作直線回歸，所得直線斜率即為親和常數(shù)K。第82頁/共119頁K值可通過作Scatchard圖求得，以B/F值為縱坐標(biāo)，以滴度：抗體的稀釋倍數(shù)過高或過低均會(huì)影響分析的靈敏度和準(zhǔn)確性。抗體的滴度反應(yīng)其濃度。將抗體按一系列倍數(shù)稀釋，分別與定量的標(biāo)記抗原反應(yīng)，用分離劑將標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物和標(biāo)記抗原分離，以B/T%為縱坐標(biāo)，以抗體的稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，B/T%為50%時(shí)的稀釋倍數(shù)即稱為抗體的滴度。第83頁/共119頁滴度：抗體的稀釋倍數(shù)過高或過低均會(huì)影響分析的靈敏度和準(zhǔn)確性。7.3 單克隆抗體將B淋巴細(xì)

39、胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞，該雜交細(xì)胞產(chǎn)生的抗體只作用于一種抗原決定簇。將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按2-10 : 1的比例混合，在50%的聚乙二醇作用下可實(shí)現(xiàn)融合，融合的成功率約幾萬分之一。第84頁/共119頁7.3 單克隆抗體第84頁/共119頁指抗體與待測抗原的類似抗原的交叉反應(yīng)程度，前文已作敘述。根據(jù)加樣順序與溫育次數(shù)的不同，放射免疫分析可分為如下三種。磁性微粒子固相抗體或固相親和素首先應(yīng)用于CLIA試劑盒的制造，最近也應(yīng)用于IRMA和RIA?？贵w的滴度反應(yīng)其濃度。放射免疫分析及其相關(guān)的技術(shù).3H標(biāo)記的四環(huán)素可與樣品中四環(huán)素類藥物競爭結(jié)合特異性受體，當(dāng)樣品中殘留有四環(huán)素類藥物時(shí)，殘留藥

40、物與受體結(jié)合，從而阻止了標(biāo)記四環(huán)素與受體的結(jié)合。正向兩步法：待測抗原先與固相抗體結(jié)合，再與標(biāo)記抗體結(jié)合，然后去除游離的標(biāo)記抗體，測固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物的放射性計(jì)數(shù)。放免實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)換氣應(yīng)良好，避免空氣中有粉塵，應(yīng)采用濕式操作的方法，可使污染降低到最低。腫瘤抗原：癌胚抗原、甲胎蛋白第四軍醫(yī)大學(xué)出版社.具有羥基、酮基、酚基的半抗原先分別用琥珀酸酐法、O-(羧甲基)羥胺法、一氯醋酸鈉法和重氮化的對(duì)氨基苯甲酸法合成具有羧基的半抗原衍生物，再用碳化二亞胺法或氯甲酸異丁酯法合成人工抗原。有的放射免疫分析先在37溫育一段時(shí)間，再在4下溫育。具有羥基、酮基、酚基的半抗原先分別用琥珀酸酐法、O-(羧甲基

41、)羥胺法、一氯醋酸鈉法和重氮化的對(duì)氨基苯甲酸法合成具有羧基的半抗原衍生物，再用碳化二亞胺法或氯甲酸異丁酯法合成人工抗原。常用的緩沖液有磷酸鹽緩沖液、巴比妥緩沖液、Tris-HCl緩沖液、醋酸緩沖液和硼酸緩沖液。第113頁/共119頁福建水產(chǎn), 2005, (3): 47-49.采用磁性微粒子RIA技術(shù)，具有簡便、快速、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，其原理是血清中的抗體和125I-抗原混合溫育，生成抗原-抗體復(fù)合物，然后反應(yīng)液中加入抗人IgG磁性微粒子分離劑5 min，置于磁性分離器上，棄上清液，測放射性。融合后在氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶（HAT）培養(yǎng)液中、5-7%的CO2、37的條件下培養(yǎng)。未融合的B淋

42、巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞幾天后漸漸死亡，只有融合的雜交細(xì)胞能在HAT培養(yǎng)液中生長傳代，經(jīng)10-14天的培養(yǎng)，雜交細(xì)胞形成克隆。第85頁/共119頁指抗體與待測抗原的類似抗原的交叉反應(yīng)程度，前文已作敘述。融合此時(shí)用免疫學(xué)方法檢測雜交細(xì)胞分泌的抗體，通過對(duì)千百個(gè)培養(yǎng)小孔中培養(yǎng)的上清液進(jìn)行篩選，可發(fā)現(xiàn)一些抗體陽性的孔，盡快將能夠分泌所需抗體的高滴度陽性孔中的雜交細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞克隆。第86頁/共119頁此時(shí)用免疫學(xué)方法檢測雜交細(xì)胞分泌的抗體，通過對(duì)千百個(gè)培養(yǎng)小孔重復(fù)上述檢測和克隆，確保得到的抗體是單個(gè)細(xì)胞后代分泌的。一旦雜交細(xì)胞能穩(wěn)定地產(chǎn)生高滴度抗體，即將該雜交細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。第87頁/共119頁重復(fù)上述檢測

43、和克隆，確保得到的抗體是單個(gè)細(xì)胞后代分泌的。一旦其方法是將它注射到預(yù)先用降植烷或醫(yī)用石蠟油處理過的同種小鼠的腹腔內(nèi)，讓雜交細(xì)胞在腹腔內(nèi)生長，一般經(jīng)10-14天后，小鼠腹部脹大形成腹水，在其腹水或血清中含有高濃度的單克隆抗體。這種細(xì)胞若不用時(shí)，可在液氮中長期保存，需要時(shí)可取出擴(kuò)大培養(yǎng)，可得到同質(zhì)的單克隆抗體。第88頁/共119頁其方法是將它注射到預(yù)先用降植烷或醫(yī)用石蠟油處理過的同種小鼠的7.4 標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物與標(biāo)記抗原的分離雙抗體法：第一抗體與抗原結(jié)合，第二抗體與第一抗體結(jié)合，生成分子量較大的復(fù)合物(Ag-Ab1-Ab2)，能自然沉淀。優(yōu)點(diǎn)是分離效果好、非特異性結(jié)合率低，缺點(diǎn)是費(fèi)用增加、需

44、要第二次溫育、時(shí)間延長。第89頁/共119頁7.4 標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物與標(biāo)記抗原的分離第89頁/共11聚乙二醇(PEG)法：PEG濃度為7-9%時(shí)能使抗原-抗體復(fù)合物沉淀。優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)、簡便，缺點(diǎn)是重復(fù)性差、非特異性結(jié)合率高。第90頁/共119頁聚乙二醇(PEG)法：PEG濃度為7-9%時(shí)能使抗原-抗體復(fù)活性炭吸附法：用包被了葡聚糖衣的活性炭吸附抗原，然后離心收集。鹽析法：用中性鹽如硫酸銨沉淀抗原-抗體復(fù)合物，然后離心收集。微孔濾膜法：用微孔濾膜吸附抗原-抗體復(fù)合物。第91頁/共119頁活性炭吸附法：用包被了葡聚糖衣的活性炭吸附抗原，然后離心收集固相法：抗體與固體材料連接，生成的抗原-抗體復(fù)合

45、物亦與固體材料連接。凝膠過濾法：利用葡聚糖的分子篩效應(yīng)。雙抗體-PEG法：將兩種方法組合，沉淀抗原-抗體復(fù)合物。第92頁/共119頁固相法：抗體與固體材料連接，生成的抗原-抗體復(fù)合物亦與固體材磁化活性炭吸附法：將活性炭和氧化鐵混合，加入聚丙烯酰胺交聯(lián)成膠狀顆粒，吸附抗原后，將反應(yīng)管放在磁鐵上，使顆粒沉淀?，F(xiàn)在一般采用第二抗體與PEG合用的方法，稱為雙抗體-PEG法，它結(jié)合了兩種方法的優(yōu)點(diǎn)。第93頁/共119頁磁化活性炭吸附法：將活性炭和氧化鐵混合，加入聚丙烯酰胺交聯(lián)成第8講 放射免疫分析方法 的建立和鑒定8.1 方法的建立8.1.1 標(biāo)記抗原、抗體和待測抗原的用量標(biāo)記抗原的加入量一般為6000

46、-10000 cpm，抗體的滴度一般用與標(biāo)記抗原結(jié)合率為30-50%時(shí)的滴度，待測抗原的含量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，三者的容積為0.3-1.2 mL。第94頁/共119頁第8講 放射免疫分析方法 的建立和鑒定8.1 方法8.1.2 反應(yīng)條件常用的緩沖液有磷酸鹽緩沖液、巴比妥緩沖液、Tris-HCl緩沖液、醋酸緩沖液和硼酸緩沖液。溫度一般為4或37 ，在4下反應(yīng)達(dá)到平衡所需時(shí)間長，但結(jié)合率較高；在37下反應(yīng)達(dá)到平衡所需時(shí)間短，結(jié)合率較低。有的放射免疫分析先在37溫育一段時(shí)間，再在4下溫育。加樣均須在4下進(jìn)行。第95頁/共119頁8.1.2 反應(yīng)條件第95頁/共119頁8.1.3 樣品預(yù)處理和加樣順序

47、若樣品中的待測抗原含量高，可先稀釋；可用溶劑萃取待測抗原，然后去除溶劑；可分離純化。后兩種方法必須測定回收率。按加樣順序不同分為平衡法和非平衡法。平衡法：將待測抗原、標(biāo)記抗原和抗體依次加入、溫育。非平衡法：先加待測抗原和抗體、溫育一定時(shí)間，然后加入標(biāo)記抗原、溫育。第96頁/共119頁8.1.3 樣品預(yù)處理和加樣順序第96頁/共119頁8.1.4 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算樣品含量計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合率Bs/B0(%)：Bs/B0(%)= cpms cpm0 100 cpms為標(biāo)準(zhǔn)抗原 + 標(biāo)記抗原 + 抗體反應(yīng)的平均計(jì)數(shù)率，cpm0為標(biāo)記抗原 + 抗體反應(yīng)的平均計(jì)數(shù)率。第97頁/共119頁8.1.4 制作標(biāo)準(zhǔn)

48、曲線和計(jì)算樣品含量Bs/B0(%)= c令b = Bs/B0(%)，b的logit轉(zhuǎn)換logitb = loge 100 b b以標(biāo)準(zhǔn)抗原的劑量為橫坐標(biāo)，若以Bs/B0(%)為縱坐標(biāo)，則標(biāo)準(zhǔn)曲線是“L”形，若以logitb為縱坐標(biāo)，則標(biāo)準(zhǔn)曲線是一條直線。第98頁/共119頁令b = Bs/B0(%)，b的logit轉(zhuǎn)換logitb 在與標(biāo)準(zhǔn)抗原相同的條件下測得樣品 + 標(biāo)記抗原 + 抗體反應(yīng)的平均計(jì)數(shù)率，計(jì)算樣品的結(jié)合率或其logit轉(zhuǎn)換，然后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出樣品中的抗原含量。第99頁/共119頁在與標(biāo)準(zhǔn)抗原相同的條件下測得樣品 + 標(biāo)記抗原 + 抗體反應(yīng)8.2 方法的鑒定8.2.1 精密

49、度精密度是指結(jié)果的重復(fù)性，即同一份樣品用同一種方法多次測量，若結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)誤差小，表示重復(fù)性好。在同一批測定中取高、中、低不同劑量，每個(gè)劑量至少作20個(gè)重復(fù)，得到的標(biāo)準(zhǔn)誤差為批內(nèi)誤差，應(yīng)小于10%。第100頁/共119頁8.2 方法的鑒定第100頁/共119頁8.2.2 準(zhǔn)確性準(zhǔn)確性是指測量值與真值的符合程度。將樣品分二份，一份加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)品，測定加入標(biāo)準(zhǔn)品的回收率。平均回收率應(yīng)為90-110%?；厥章?%)= 所加標(biāo)準(zhǔn)品的量 100 樣品加標(biāo)準(zhǔn)品的測定含量 樣品的測定含量 第101頁/共119頁8.2.2 準(zhǔn)確性回收率(%)= 所加標(biāo)準(zhǔn)品的量 1008.2.3 健全性待測樣品作一系列稀釋，

50、將其反應(yīng)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。若二者平行，則測定結(jié)果與樣品實(shí)際含量成正比；若不平行，則測定結(jié)果存在系統(tǒng)誤差。第102頁/共119頁8.2.3 健全性第102頁/共119頁8.2.4 靈敏度一般用B0管10個(gè)以上，求出結(jié)合率的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。平均值減去兩倍標(biāo)準(zhǔn)誤差的值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度為該方法的最小檢出量，即該方法的靈敏度。第103頁/共119頁8.2.4 靈敏度第103頁/共119頁8.2.5 特異性指抗體與待測抗原的類似抗原的交叉反應(yīng)程度，前文已作敘述。第104頁/共119頁8.2.5 特異性第104頁/共119頁第9講 進(jìn)行放射免疫分析時(shí)應(yīng)注意的防護(hù)9.1 放射性污染的危害空氣污染

51、和表面污染：外照射；吸入和取食：內(nèi)照射。125I可以通過無損傷的皮膚進(jìn)入體內(nèi)。第105頁/共119頁第9講 進(jìn)行放射免疫分析時(shí)應(yīng)注意的防護(hù)9.1 放射性污染9.2 源的管理9.2.1 試劑每月寄來的放免試劑必須專人登記包裝盒的數(shù)量，有無破損溢漏；專人負(fù)責(zé)管理試劑的用量。每天操作人員檢測完畢后登記125I消耗量。每月統(tǒng)計(jì)的125I用量和剩余量，并對(duì)剩余的125I進(jìn)行嚴(yán)格統(tǒng)一的處理。第106頁/共119頁9.2 源的管理第106頁/共119頁9.2.2 廢物處理廢氣主要是通過換氣扇等排氣口排出，確保門窗、走廊的通氣性。廢水：125I廢液、剩余125I溶液、沉淀后的上清液和洗滌液直接進(jìn)入單位儲(chǔ)藏的衰

52、變池統(tǒng)一處理。作為125I的固體廢物集中收集在標(biāo)有放射性垃圾的特殊標(biāo)記的醫(yī)用紅色塑料袋內(nèi)，存放在特制的鉛柜中，l0個(gè)半衰期后經(jīng)過放射性檢測達(dá)豁免要求后再按一般醫(yī)用廢物深埋處理。第107頁/共119頁9.2.2 廢物處理第107頁/共119頁9.2.3 放免分析去污的一般原則要盡早去污，因?yàn)槲廴緯r(shí)間較短的放射性物質(zhì)容易達(dá)到較高的單次去污效率，也可以減少污染的擴(kuò)大。要配制合適的去污劑。被125I污染時(shí)先用5%硫代硫酸鈉或5%亞硫酸鈉洗滌，再以10%碘化鉀或碘化鈉為載體幫助去污；也可以用普通肥皂去污，這時(shí)清洗的次數(shù)應(yīng)適當(dāng)?shù)囟嘁恍?。?08頁/共119頁9.2.3 放免分析去污的一般原則第108頁/共

53、119頁9.3 放免分析工作人員的個(gè)人防護(hù)放免實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)換氣應(yīng)良好，避免空氣中有粉塵，應(yīng)采用濕式操作的方法，可使污染降低到最低。打開放免藥盒應(yīng)有專門的場所，打開標(biāo)記物瓶蓋時(shí)要防止標(biāo)記溶液溢漏出來污染手指，如果手指接觸到標(biāo)記物應(yīng)立即洗手，如果灑到桌面、地面上應(yīng)立即處理。操作完畢應(yīng)將桌面擦干凈，及時(shí)測量設(shè)備、工具表面、工作人員的衣物和手，確定是否有污染，如果污染水平超過相應(yīng)的導(dǎo)出限，應(yīng)及時(shí)采取去污染措施。第109頁/共119頁9.3 放免分析工作人員的個(gè)人防護(hù)第109頁/共119頁在有傷口的情況下，不要進(jìn)行直接接觸手的操作，養(yǎng)成良好的操作習(xí)慣。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不得進(jìn)食、飲水、吸煙；不得進(jìn)行無關(guān)的工作和存

54、放無關(guān)的物品。養(yǎng)成良好的個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣，離開實(shí)驗(yàn)室必須用洗滌液或肥皂反復(fù)洗手3-5次。打開標(biāo)記物的凍干品時(shí)需要特別小心，在凍干品的瓶內(nèi)由于呈負(fù)壓狀態(tài)，必須采取以下步驟可以避免放射性物質(zhì)的飛濺和溢出，先將瓶塞稍微啟開一點(diǎn)，待瓶內(nèi)外達(dá)到大氣平衡之后，再打開瓶塞。第110頁/共119頁在有傷口的情況下，不要進(jìn)行直接接觸手的操作，養(yǎng)成良好的操作習(xí)致 謝本課件中的文本、圖表等引自眾多文獻(xiàn)（見下頁），在此對(duì)這些文獻(xiàn)的作者深表謝意！第111頁/共119頁致 謝本課件中的文本、圖表等引自眾多文獻(xiàn)（見下頁），在主要參考文獻(xiàn)1 R.S. Yalow. Radioimmunoassay: a probe for fine structure of biologic systems. Nobel Lecture, Physiology or Medicine 1977. 447-468. 2 吳美文. 放射免疫分析及其相關(guān)的技術(shù). 見: 陳子元, 主編. 核農(nóng)學(xué). 中國農(nóng)業(yè)出版社. 北京: