血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)(趙)

1、血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng).概述血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelialcell,EC）是襯于心，血管和淋巴管腔內(nèi)表面的一種單層扁平上皮細(xì)胞。EC極薄，厚度約為0.11um,長(zhǎng)約2550um,寬約1015Dm,在體內(nèi)呈梭形，相鄰細(xì)胞之間借少量粘合質(zhì)彼此嵌合，細(xì)胞長(zhǎng)軸與血流方向平行。其超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是在胞質(zhì)中含有的特殊顆粒，稱Weibel-palade小體（內(nèi)含有與凝血有關(guān)的第皿因子相關(guān)抗原）；細(xì)胞間有緊密連接的縫隙相連。EC除了能保持血管壁內(nèi)表面的光滑和通透性外，還有多種生物學(xué)功能：維持正常的血液流動(dòng)性,分泌多種生物活性物質(zhì),在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng),改變脂質(zhì)代謝,維持血管壁的完整性,調(diào)節(jié)血管張力和選擇性通透性以及

2、免疫調(diào)節(jié)方面起到重要作用。EC功能的異常，與血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等心血管疾病及腫瘤擴(kuò)散，免疫疾病都有密切關(guān)系。體外培養(yǎng)中的EC形態(tài)呈“鵝卵石樣”鑲嵌排列，細(xì)胞長(zhǎng)滿后呈接觸抑制現(xiàn)象。.培養(yǎng)方法EC生長(zhǎng)在血管內(nèi)表面，由于其所處的獨(dú)特位置不利于觀察和研究，所以體外培養(yǎng)EC顯得特別重要，目前已有多種種屬（人、牛、豬、兔、大鼠等），多種組織（臍帶動(dòng)脈、靜脈、肺動(dòng)脈、主動(dòng)脈、腦毛細(xì)血管、心臟毛細(xì)血管等）的EC能在體外培養(yǎng)成功。人們將培養(yǎng)器皿預(yù)先用明膠或纖連蛋白或膠原等粘附蛋白包被后，形成人工的EC下基質(zhì)層，可促進(jìn)EC的粘附與生長(zhǎng)。方法原理用酶消化法，酶消化+機(jī)械刮脫法或單純刮脫法將EC分離下來(lái)，

3、在適宜的條件下可貼壁并長(zhǎng)成致密單層。介紹幾種主要EC的分離酶消化法大血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離人臍帶動(dòng)、靜脈（或其它大血管）a在37水浴中,預(yù)熱培養(yǎng)用的所有無(wú)菌溶液,備用。b.在無(wú)菌條件下，取健康產(chǎn)婦分娩后新鮮的嬰兒臍帶（25cm左右，不超過(guò)6h）,選擇無(wú)夾痕、無(wú)扭曲、無(wú)凝血阻塞的部分，放入含有100U/ml的青霉素和100ug/ml鏈霉素的D-Hanks液中，在臍靜脈或臍動(dòng)脈的兩端插入磨平的注射器針頭用絲線扎緊，用注射器從一端注入D-Hanks液沖洗血管，直到流出的液體無(wú)血跡。c.注入0.1%膠原酶（1型）溶液，待血管內(nèi)殘留的D-Hanks液流盡后，用注射器封注另一端針頭，繼續(xù)注入膠原酶溶液，致血管

4、充盈，放入37無(wú)菌的D-Hanks液中，消化15min后取出。d.收集血管內(nèi)酶溶液，并且注入含20%小牛血清的M199培養(yǎng)液（pH7.2）沖洗血管收集合并于同一容器內(nèi)，以1000r/min離心710min。e.去上清液，加入20%小牛血清的M199培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞備用。f.其它大血管如牛主動(dòng)脈，豬主動(dòng)脈等，可在無(wú)菌下分離，然后用線結(jié)扎血管各分支，再依上述步驟分離EC。酶消化法小血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離兔主動(dòng)脈,大鼠主動(dòng)脈因血管較小,分支極細(xì),不能采用上述方法消化。a.將動(dòng)物主動(dòng)脈取出后放D-Hanks中，將血管外的脂肪細(xì)組織分離干凈，用絲線結(jié)扎血管一端,然后用探針頂住該端,將整條血管翻轉(zhuǎn),使內(nèi)膜翻

5、在外面。將另一端折入腔內(nèi)0.5cm,并用絲線結(jié)扎緊，以防外膜外露及避免酶液進(jìn)入外膜腔內(nèi)。b.用D-Hanks液清洗干凈外翻的內(nèi)膜面，然后血管浸泡在含0.1%膠原酶溶液的小瓶?jī)?nèi)，蓋上瓶蓋在37水浴中輕輕搖蕩消化，使EC離散下來(lái)，消化1520min后，見(jiàn)酶液稍有混濁，即加入等量的含20%小牛血清的M199培養(yǎng)液，以終止酶的作用。c.收集消化后的酶溶液以1500r/min離心5min，棄上清，用20%小牛血清M199培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞。酶消化-機(jī)械刮脫法豬主動(dòng)脈EC的分離a.麻醉狀態(tài)下，在頸部切口，分離并剪斷頸動(dòng)脈，放血處死。在無(wú)菌條件下，作胸腹聯(lián)合切口，迅速打開(kāi)胸腔，分離并取出胸主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈，

6、置含D-Hanks液的培養(yǎng)皿中，盡量去除血管外膜的脂肪和纖維組織，然后用D-Hanks液多次沖洗血管外表及血管管腔內(nèi)的凝血，再放入新裝有D-Hanks的溶液中。b.縱何剪開(kāi)血管，反復(fù)沖洗干凈血管內(nèi)壁后，在另一無(wú)菌大培皿中，滴加薄薄一層0.125%胰蛋白酶和0.01%EDTA的混合消化液，將主動(dòng)脈內(nèi)膜面朝下鋪在酶混合液之上。在37條件下，讓內(nèi)膜與酶溶液充分接觸并消化1020min,再加入含少量20%小牛血清的M199培養(yǎng)液，以終止酶的作用。c.把上述主動(dòng)脈移至另一無(wú)菌培養(yǎng)皿，用小手術(shù)刀輕輕將內(nèi)皮刮下。先順向有次序地刮內(nèi)膜一2次，然后再橫向刮一2次，用M199液將內(nèi)皮細(xì)胞收集到離心管中，以1000

7、r/min離心710min,去上清，用20%小牛血清M199培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞備用。機(jī)械刮脫法血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離取長(zhǎng)度為20cm的大血管，用D-Hanks液將血管內(nèi)、外沖洗干凈后，無(wú)菌條件下沿縱軸剪開(kāi)，使血管內(nèi)皮朝上向外暴露，再用D-Hanks液沖洗2次，然后用刮刀輕輕刮取內(nèi)膜表面的內(nèi)皮細(xì)胞，刮取時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕柔均勻，刮刀與表面的角度約為60，每處只能刮1次，不可刮血管的邊緣，刮下的細(xì)胞懸浮于M199液中，以1000r/min離心710min,去上清，再重復(fù)洗滌1次，重新懸浮于20%小牛血清M199培養(yǎng)液中備用。還有微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離及干貼法分離EC等，但較少用。EC原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)

8、將分離好備用的EC用含100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素以及20%小牛血清的M199培養(yǎng)液（M199完全培養(yǎng)液）調(diào)整細(xì)胞濃度為1.52.0X105/ml,接種到以0.1%纖連蛋白或1%明膠包被已干燥的平皿或培養(yǎng)瓶中。放37、5%CO2和飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)。24h后棄去培養(yǎng)液，用D-Hanks液淋洗1次，以去除未貼壁或死亡的細(xì)胞，換入等量的M199完全培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育箱中培養(yǎng)。每23d換M199完全培養(yǎng)液1次，換液時(shí)將原培養(yǎng)液棄掉1/22/3,然后加入新鮮的M199完全培養(yǎng)液至原來(lái)的量，67d后細(xì)胞可融合成單層內(nèi)皮細(xì)胞，即可傳代。傳代培養(yǎng)待原代培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)后，棄培養(yǎng)液，用預(yù)

9、溫的D-Hanks液淋洗2次，加入終濃度0.125%胰蛋白酶、0.01%EDTA混合消化液，正好形成一淺層液面將細(xì)胞復(fù)蓋，室溫下（2025）消化12min。鏡下見(jiàn)細(xì)胞稍收縮變圓,細(xì)胞間隙增寬后,立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,棄酶液。可再用D-Hanks液輕洗1次或直接加入新鮮M199完全培養(yǎng)液后，用吸水管（滴管）將細(xì)胞輕輕吹打下來(lái)，按1：2或1：3的比例傳代。每隔23d換液1次，每次換掉2/3量，待細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)后，再次傳代。觀察結(jié)果用酶消化進(jìn)行的原代培養(yǎng)，從動(dòng)脈內(nèi)膜上消化收集下來(lái)的內(nèi)皮細(xì)胞，30min后即開(kāi)始貼壁，呈扁平短梭形或多角形分散生長(zhǎng)；46h后大部分細(xì)胞已貼壁，并開(kāi)始生長(zhǎng)，分裂，24h后形成數(shù)量

10、不等的細(xì)胞群，約67d融合成片。傳代培養(yǎng)的EC,10min后貼壁，57d融合成單層。內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定光鏡檢查在倒置相差顯微鏡下可觀察到活細(xì)胞呈扁平的短梭形或多角形，大小均勻，胞核清晰，呈卵圓形。有核的區(qū)域較無(wú)核的區(qū)域突出，細(xì)胞呈單層鵝卵石樣或鋪路石樣鑲嵌排列。透射電鏡檢查經(jīng)切片技術(shù)處理后可觀察到具有特征性的細(xì)胞器（webel-palade,W-P小體），但兔及豬的EC無(wú)W-P小體。第皿因子相關(guān)抗原免疫熒光檢測(cè)EC用PBS沖洗干凈，放入乙醇和丙酮（1：1）溶液中固定10min,空氣晾干，加入第皿因子相關(guān)抗原抗血清（兔抗人皿因子相關(guān)抗原抗血清），37孵育60min。用PBS沖洗干凈，晾干后加第一動(dòng)物

11、IgG熒光抗體（羊抗兔IgG熒光抗體），37孵育30min。PBS沖洗干凈，晾干，最后用緩沖甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察到EC的胞漿內(nèi)呈顯較強(qiáng)的黃綠色熒光，是鑒定體外培養(yǎng)EC最可靠的標(biāo)志。因第皿因子只存在于內(nèi)皮細(xì)胞、巨核細(xì)胞和血小板中，其它細(xì)胞無(wú)第皿因子，但培養(yǎng)的豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞也無(wú)此因子。注意事項(xiàng)接種材料的制備血管取材的離體時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般不超過(guò)6h,萬(wàn)一不能當(dāng)時(shí)培養(yǎng)，則應(yīng)放置4c下保存（但不應(yīng)超過(guò)24h）,血管內(nèi)、外表面的血跡必須充分洗凈，以免殘留的RBC及血液中某些因子影響EC的貼壁或生長(zhǎng)。酶消化液濃度的選擇0.1%（1型）膠原酶溶液，0.25%胰蛋白酶溶液，0.25%胰蛋白酶0.02

12、%EDTA混合消化液，0.125%胰蛋白酶0.01%EDTA混合消化液（常用于傳代），根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況選定。掌握好酶液的消化時(shí)間是內(nèi)皮細(xì)胞存活的關(guān)鍵（原代培養(yǎng)）。雜細(xì)胞的排除細(xì)胞傳代時(shí)，加入酶消化液之后，置顯微鏡下觀察，12min即可見(jiàn)大部分EC收縮變圓，而雜細(xì)胞（主要是成纖維細(xì)胞）仍然貼壁。此時(shí)，立即加入M199完全培養(yǎng)液以終止酶的活性，然后棄去其液體，加新鮮M199完全培養(yǎng)液，輕輕將細(xì)胞吹打下來(lái)，傳到另一培養(yǎng)瓶，如此經(jīng)過(guò)23次，可得到較純的EC。其次有人使用含肝素的完全培養(yǎng)液（在液體中加入90U/ml的肝素）可使EC純度提高。EC的培養(yǎng)條件EC培養(yǎng)條件要求比較嚴(yán)格，培養(yǎng)液的pH溫度，抗生素的種

13、類和含量，血清質(zhì)量和活性，ECGF的質(zhì)量和含量，EC分離時(shí)所受到的創(chuàng)傷，孵育箱的培養(yǎng)條件，都對(duì)EC的生長(zhǎng)有重要影響。小?；蛱ヅＱ宓馁|(zhì)量對(duì)EC的生長(zhǎng)影響很大，胎牛血清較小牛血清更好。一般原代培養(yǎng)用20%,傳代培養(yǎng)用10%血清，常用培養(yǎng)基為M199,pH7.2為宜。塑料培養(yǎng)瓶或皿較玻璃或皿更利于EC生長(zhǎng)，培養(yǎng)瓶或皿鋪上纖連蛋白，明膠或膠原，以利EC的貼壁生長(zhǎng)，但應(yīng)首選纖連蛋白，因它對(duì)蛋白和DNA的測(cè)定無(wú)顯著影響。EC的傳代培養(yǎng)一般EC的傳代比例是1：2或1：3。如需要單次傳代，擴(kuò)大體外培養(yǎng)規(guī)模時(shí)，可以1：20以上的比例進(jìn)行傳代，這樣可在短期內(nèi)獲得大量的EC,進(jìn)行凍存或?qū)嶒?yàn)工作，但單次傳代，擴(kuò)大體

14、外培養(yǎng)規(guī)模，須在培養(yǎng)液中加入內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（endothelialcellgrowthfactor,ECGF）,只是該因子價(jià)格較昂貴。EC經(jīng)多次傳代后其形態(tài)和生物學(xué)特性會(huì)有所改變，并且其生長(zhǎng)期有限，不斷衰退，故不宜作長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，一般生長(zhǎng)期在2030d左右，如實(shí)驗(yàn)需要可重復(fù)從原代建立培養(yǎng)。體外培養(yǎng)EC用于評(píng)價(jià)抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)介紹幾種常用的實(shí)驗(yàn)方法.保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelialcells,EC）藥的實(shí)驗(yàn)損傷學(xué)說(shuō)認(rèn)為，機(jī)械、化學(xué)、免疫、感染等引起EC損傷是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的起始因素，反復(fù)的EC損傷引起單核巨噬細(xì)胞、血小板粘附，可致AS斑

15、塊形成。對(duì)血管內(nèi)皮具有保護(hù)作用的藥物可使EC免受有害因子的損傷，可能有抗AS作用。原理將EC置于適宜的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),將EC以缺氧，損傷劑造成細(xì)胞損傷，通過(guò)形態(tài)學(xué)、功能、生長(zhǎng)等指標(biāo)觀察藥物抗損傷效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)方案取傳代后制成單細(xì)胞懸液的EC，用含10%小牛血清的M199液調(diào)細(xì)胞至2X105/ml,接種入用0.1%纖連蛋白包被的96孔（100*/孔）或24孔（0.5ml/孔）板中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通常設(shè)：正常組（不加藥，不加損傷劑）；損傷組（不加藥只加損傷劑）；若干給藥組（加不同劑量藥物，加損傷劑，或不加損傷劑）。給藥組細(xì)胞首先給含藥M199液，培養(yǎng)數(shù)h（一般624h）,使藥物與細(xì)胞充

16、分作用，然后用Hanks液洗去全部藥液，加損傷劑。多聚陽(yáng)離子損傷-加入含多聚賴氨酸培養(yǎng)液200泊或500泊，終濃度200nmol/L，孵溫箱培養(yǎng)2h后，實(shí)驗(yàn)觀察檢測(cè)結(jié)果。氧自由基損傷-加入含黃嘌呤的培養(yǎng)液100ul或250ul，終濃度10umol/L，同時(shí)加入含黃嘌呤氧化酶100ul或250ul終濃度200umol/L，孵育箱培養(yǎng)16h，即可觀察檢測(cè)結(jié)果。缺氧損傷-缺氧培養(yǎng)，供應(yīng)含3%氧氣的混合氣體（CO2和N2）37培養(yǎng)34h，可觀察檢測(cè)結(jié)果。1.3結(jié)果觀察形態(tài)觀察正常生長(zhǎng)的EC光鏡下呈梭形或多角形，鑲嵌排列成鋪路石狀，相互融合，單層致密。損傷的細(xì)胞形態(tài)細(xì)長(zhǎng)如柳葉，大小不勻，分布不均，間隙增

17、寬。3H-TdR摻入測(cè)定EC損傷后吸去原液體，加入含3H-TdR培養(yǎng)液（1uci/200ul/孔，3.7*10434）摻入24h，收集樣品，以液閃儀檢測(cè)3H-TdR的摻入率，損傷越重，DNA合成減少，3H-TdR摻入率就愈低。細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）測(cè)定因細(xì)胞被損傷可使內(nèi)含物滲出到培養(yǎng)液中，隨著損傷的加重，滲出物增多，其測(cè)定方法與以前介紹練習(xí)的用LDH釋放法檢測(cè)NK細(xì)胞活性的操作相類似。.促進(jìn)EC合成或釋放一氧化氮（nitricoxide，NO）藥物的實(shí)驗(yàn)原理EC能釋放多種活性因子，其中NO為血管舒張因子，能阻止AS病變的形成，故試驗(yàn)觀測(cè)NO釋

18、放的多少，就可確定藥物抗AS及其機(jī)理的方式之一。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品的收集取第2代生長(zhǎng)良好的EC，常規(guī)制備單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為2X105/ml，接種于24孔板，0.5ml/孔，待呈融合狀態(tài)時(shí)，去上清，用無(wú)血清無(wú)酚紅的M199液淋洗23次，即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。觀察藥物對(duì)EC分泌NO的量效關(guān)系正常組（加入無(wú)血清無(wú)酚紅的M199）；含藥物的M199溶液組（一般分為5個(gè)藥物濃度）；含藥物的M199及EDTA溶液組（選定一個(gè)有效藥物濃度，EDTA的終濃度為0.02%），每孔總體積0.5ml（原量），設(shè)復(fù)孔6個(gè)，置孵溫箱中培養(yǎng)24h，收集上清樣品，待測(cè)NO的含量（或以O(shè)D值表示）。觀測(cè)藥物對(duì)EC分泌NO的時(shí)效關(guān)系

19、同樣設(shè)上述三組，后二組選定一個(gè)有效的藥物濃度，在孵育箱中培養(yǎng)0.5、1、2、4、6h后，分別收集上清液樣品，在酶標(biāo)儀上550nm處檢測(cè)OD值。NO濃度的測(cè)定取3份體積的上清液+1份體積的Gress試劑（10%對(duì)氨基苯磺酸，0.1%N-奈基乙二胺，2.5ml%磷酸）混合后，在550nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值，或用NO檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，從已知標(biāo)性的曲線上換算得出其含量的濃度，以u(píng)mol/L表示。用t檢驗(yàn)比較組間差異性。形態(tài)學(xué)觀察比較各實(shí)驗(yàn)組的變化。結(jié)果分析具有促進(jìn)NO合成和釋放的藥物，在適當(dāng)?shù)臐舛认驴墒沽啃?shí)驗(yàn)的給藥組上清液中NO濃度升高，并呈量效關(guān)系；藥物+EDTA組上清液中NO濃度可能不變，這是因?yàn)橛?/p>

20、EDTA螯合了鈣離子，影響了EC中NO合成酶的激活所致。在時(shí)效關(guān)系實(shí)驗(yàn)中，單給藥組可呈時(shí)效關(guān)系曲線，其它二組基本不變。在形態(tài)方面，試驗(yàn)24h后有促進(jìn)NO合成和釋放的藥物，（單給藥組）EC仍呈融合狀態(tài)，變化不明顯。余EC呈邊緣皺縮，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞質(zhì)中有大小不等的顆粒狀空泡。.用6-酮前列腺素F1a放射免疫檢測(cè)盒間接檢測(cè)藥物促EC分泌前列腺環(huán)素（PGI2）的水平。我們已知PGI2是最強(qiáng)的血管擴(kuò)張劑和血小板聚集抑制劑，EC是PGI2的主要合成場(chǎng)所。PGI2很不穩(wěn)定，尤其在體內(nèi)，半衰期只有23min無(wú)法直接測(cè)定，只能通過(guò)其穩(wěn)定的代謝物6-酮-PGF-1a的測(cè)定來(lái)間接反映PGI2的含量。原理抗6-酮

21、-PGF-1a抗體與血漿或EC上清液中的6-酮-PGF-1a抗原結(jié)合形成特異性抗原抗體復(fù)合物，向該反應(yīng)體系中加入一定量的3H標(biāo)記的6-酮-PGF1a作為示蹤劑，當(dāng)抗體量不足時(shí)，示蹤劑與樣品中的6-酮-PGF-1a競(jìng)爭(zhēng)抗體。加入第二抗體或活性炭將抗原抗體復(fù)合物和游離的抗原分開(kāi)，測(cè)定抗原抗體復(fù)合物放射性，即可算出樣品中6-酮-PGF-1a的含量，具體操作按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。注意事項(xiàng)EC培養(yǎng)上清液中的6-酮-PGF-1a含量比血漿高許多培，檢測(cè)時(shí)可適當(dāng)稀釋。.氧化型低密度脂蛋白介導(dǎo)單核細(xì)胞粘附的實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)前認(rèn)為單核細(xì)胞（monocyte,MC）粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞（vasculerendothelial

22、cell,VEC）是循環(huán)MC進(jìn)入動(dòng)脈內(nèi)膜，并且局部形成泡沫細(xì)胞的前提，故實(shí)驗(yàn)觀測(cè)oxLDL（oxidelowdensitylipoprotein,oxLDL）對(duì)MC與VEC間的粘附。且已有試驗(yàn)證明經(jīng)oxLDL處理的VEC可提高對(duì)MC的粘附力45倍，36h達(dá)高峰，經(jīng)oxLDL處理的MC也可提高對(duì)VEC的粘附性，1h即達(dá)高峰并繼續(xù)24h。因此觀察oxLDL對(duì)MC與VEC間的粘附是研究抗動(dòng)脈粥樣硬化藥的作用機(jī)理之一。放射性同位素標(biāo)記MC法測(cè)定oxLDL介導(dǎo)VEC的粘附作用用51Cr標(biāo)記的MC細(xì)胞與培養(yǎng)的VEC孵育，然后洗掉未粘附的乂0加入NaOH溶解與EC粘附的MC。通過(guò)測(cè)定放射性即可算出與VEC粘

23、附的MC百分率。白細(xì)胞的分離抗凝全血（EDTA?Na212mg/ml血）+等量6%的右旋糖酐生理鹽水液，于37靜置30min,使RBC沉淀，吸出上層液體于3ml淋巴細(xì)胞分離液上,2000r/minX20離心，在二層液面交界處為MC,離心管底部為多形核白細(xì)胞（polymorphonuclearneutrophilcell,PMNC）,分別吸出兩種WBC,力口D-Hanks液1000r/minX10去上清，加11Tris-NH4Cl緩沖液（0.16mol/LNH4C1和0.17mol/LTris,9?1混合pH7.2）1ml作用35min溶解RBC,補(bǔ)足D-Hanks液到原體積，1000r/minX10,去上清，再懸浮于D-Hanks液中。WBC的標(biāo)記將上述WBC用D-Hanks液調(diào)整到5X106/ml,加入51Cr20uci/ml（終濃度），37孵育1h,用D-Hanks洗滌三次，用M199完全培養(yǎng)液再懸浮，備用。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)正常組：VEC+51Cr標(biāo)記的MC；模型組：VE