基因工程原理及實驗技術(shù)

1、基因工程原理及實驗技術(shù)第1頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二教材和參考書教材：簡明基因工程與應用吳建平 主編， 2005，科學出版社主要參考書： 1. 基因工程 張惠展 編著,華東理工大學出版社,2005 2. 基因工程 孫明 主編,高等教育出版社,2006 3. 基因工程原理 吳乃虎 編著，科學出版社,(第二版),1998 4. 基因工程 彭銀祥,主編,2007 5. 基因工程技術(shù) 鐘衛(wèi)鴻主編,化學工業(yè)出版社,2007第2頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二第一章 基因工程的概論第一節(jié) 基因工程的概念 一、基因工程的基本概念 狹義基因工程 廣義基因工

2、程第3頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二狹義基因工程 狹義的基因工程(gene engineering): 從狹義上講，基因工程是指將一種或多種生物體(供體)的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另種生物體(受體)內(nèi)使之按照人們的意愿遺傳并表達出新的性狀。因此，供體、受休、載體稱為基因工程的三大要素。 第4頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二狹義基因工程 狹義的基因工程:就是重組DNA技術(shù)（recombinant DNA techniques） 1）重組DNA技術(shù) （recombinant DNA techniques) 2）分子克隆（molecul

3、ar cloning) 3）基因克隆（gene cloning) 4）遺傳操作(genetic manipulation） 5）遺傳工程 (genetic engineering) 6）基因工程 (gene engineering)第5頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二廣義基因工程廣義的基因工程： 是指DNA重組技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是外源基因重組、克隆、表達的設(shè)計與構(gòu)建(即狹義的基因工程)；下游技術(shù)則涉及含有重組外源基因的生物細胞(基因工程菌或細胞)的大規(guī)模培養(yǎng)以及外源基因的表達、產(chǎn)物的分離、純化過程。因此，廣義的基因工

4、程概念更傾向于工程學的范疇。 第6頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二第7頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二 廣義的基因工程是一個高度統(tǒng)一的整體。上游DNA重組的設(shè)計必須以簡化下游操作工藝和裝備為指導思想。而下游過程則是上游基因重組藍圖的體現(xiàn)與保證。這是基因工程產(chǎn)業(yè)化的基本原則。第8頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二狹義的基因工程 重組DNA技術(shù) 廣義的基因工程 重組DNA技術(shù) 細胞工程 染色體工程 細胞器工程 第9頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二二、基因工程的基本過程 基因工程:兩大部分組成 基因工程的整

5、個過程由工程菌(細胞)的設(shè)計構(gòu)建和基因產(chǎn)物的生產(chǎn)兩大部分組成 工程菌(細胞)的設(shè)計構(gòu)建:實驗室里進行，其單元操作過程如下 : (1)從供體細胞中分離出基因組DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶分別將外源 DNA (包括外源基因或目的基因)和載體分子切開(簡稱“切”)；第10頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二 (2)用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片段接到載體分子上形成DNA重組分子(簡稱“接”)； (3)借助于細胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導入受體細胞中(簡稱“轉(zhuǎn)”)； (4)短時間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞、以擴增DNA重組分子或使其整合到受體細胞的基因組中(簡稱“增”)； (5)篩選和鑒定

6、轉(zhuǎn)化細胞，獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達的基因工程菌或細胞(簡稱“檢”)； 基因工程的上游操作過程；可簡化為：切、接、轉(zhuǎn)、增、檢。 第11頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二三基因工程的基本原理 基因工程的主體戰(zhàn)略思想是外源基因的穩(wěn)定高效表達為目的其基本原理可從以下四個方面考慮。（1)利用載體DNA在受體細胞中獨立于染色體DNA而自主復制的特性，將外源基因與載體分子重組，通過載體分子的擴增提高外源基因在受體細胞中的劑量借此提高其宏觀表達水平。這里涉及到DNA分子高拷貝復制以及穩(wěn)定遺傳的分子遺傳學原理。第12頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二 (2)篩選、修

7、飾和重組啟動子、增強子、操作子、終止子等基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，并將這些元件與外源基因精細拼接通過強化外源基因的轉(zhuǎn)錄提高其表達水平。 (3)選擇、修飾和重組核糖體結(jié)合位點及密碼子等mRNA的翻譯調(diào)控元件。強化受體細胞中蛋白質(zhì)的生物合成過程。 上述(2)和(3)兩點均涉及到基因表達調(diào)控的分子生物學原理。 第13頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二 (4)基因工程菌(細胞)是現(xiàn)代生物工程中的微型生物反應器，在強化并維持其最佳生產(chǎn)效能的基礎(chǔ)上，從工程菌(細胞)大規(guī)模培養(yǎng)的工程和工藝角度切入，合理控制微型生物反應器的增殖速度和最終數(shù)量，也是提高外源基因表達產(chǎn)物產(chǎn)量的主要環(huán)節(jié)，這里涉及的

8、是生物化學工程的基本理論體系。 因此分子遺傳學、分子生物學以及生物化學是基因工程原理的三大基石。第14頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二. 四、生物工程等概念生物工程：直接或間接利用生物體的機能生產(chǎn)物質(zhì)的技術(shù)。包括發(fā)酵技術(shù)、基因重組、細胞融合、細胞大量培養(yǎng)、生物反應器等技術(shù)。生物技術(shù)：是在細胞水平上，特別是在分子水平上對生物體遺傳性實現(xiàn)巨大的接近定向改造的一套內(nèi)容繁多和復雜的技術(shù)。包括基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程等。第15頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二現(xiàn)代科技革命高新技術(shù)生物技術(shù)基因工程基因克隆第16頁，共43頁，2022年，5月20日，

9、12點1分，星期二第二節(jié) 基因工程的發(fā)展歷史基因工程的發(fā)展歷史概括為三個階段 基因工程的誕生 基因工程的成熟 基因工程的騰飛第17頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二一、基因工程的誕生 基因工程是一項新興的工程技術(shù)，它的誕生需要理論和技術(shù)上的支持 理論上的三大發(fā)現(xiàn)技術(shù)上的三大發(fā)明第18頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA（基因工程的先導）DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復制機理遺傳信息的傳遞方式（中心法則）1. 理論上的三大發(fā)現(xiàn)第19頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二 證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA（基因工程的先

10、導）： 1944年首先用體外的轉(zhuǎn)化實驗證明基因的化學本質(zhì)就是DNA分子的是加拿大生物化學家艾弗里 O. T. Avery（1877-1955）。他和他的合作者CMMacLeod及MMcCarty在紐約進行細菌轉(zhuǎn)化的研究。 1) 遺傳物質(zhì)是DNA第20頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二 體外的轉(zhuǎn)化實驗證明基因就是DNA分子第21頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二2).DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復制機理 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)Watson（ 沃森）and Crick（克里克）（1953） 美國遺傳學家Watson (J.Watson)和英國生物學家克里克

11、(F. Crick) 1953年4月25日DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)假說（不到1000字的短文）核酸的分子結(jié)構(gòu)脫氧核糖核酸的一個結(jié)構(gòu)模型在（自然）雜志上發(fā)表。1個月后在（自然）雜志上又發(fā)表了遺傳物質(zhì)的復制機理。1962年與M. H. F. Wilkins 共獲諾貝爾生理學獎。DNA半保留復制機理的證明Meselson-Stahl實驗(1958) DNA復制模式的破解M.Meselson(Matthew Meselson,西爾遜)and F. W. Stahl(Franklin Stahl,斯塔爾) (1958) 1958年來西爾遜（Meselson）和斯塔爾（Stahl）首次在分子水平上成功地證明了D

12、NA的半保守復制（semiconservative replication） 利用氮標記技術(shù)在大腸桿菌中首次證實了DNA的半保留復制 ( 15N ) 第22頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二DNA半保留復制圖第23頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二3）遺傳信息的傳遞方式（中心法則） 中心法則的確立F. Crick(1958)中心法則的確立F. Crick(1958)中心法則的確立F. Crick(1958）1958年克里克確立的中心法則(1971年修改), 最早提出遺傳密碼這一名詞的是量子力學奠基人之一，奧地利物理學家施勒丁格(ESchrodinge

13、r，1944)。第一個提出遺傳密碼具體設(shè)想的是美國物理學家G.Gamov，他通過推算提出了三聯(lián)體密碼子的概念，并且進一步推論一種氨基酸可能不止有一個密碼子。 第一個用實驗破譯密碼子的是馬太(Matthaei)和尼倫伯格(Nirenberg)，1966 M.Nirenberg and H.Khorana（1968年諾貝爾生理醫(yī)學獎獲得者）建立了完整的遺傳密碼表第24頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二DNA技術(shù)分子體外切割與連接技術(shù) 限制性內(nèi)切酶(1970)和DNA連接酶(1967)發(fā)現(xiàn)，標志著DNA重組時代的開始基因工程載體技術(shù) 1970載體（vector）的使用成功197

14、0年，逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn) 使真核基因的制備成為可能。2 技術(shù)上的三大發(fā)明第25頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二DNA技術(shù)分子體外切割與連接技術(shù) 限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶Hind 1970年，美國生化學家 Simith 和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離提純了限制性核酸內(nèi)切酶 Hind （ 1978年諾貝爾生理醫(yī)學獎獲得者) EcoR 1限制性核酸內(nèi)切酶(1972年Bover實驗室 發(fā)現(xiàn)） GAATTC DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)：1967年世界上5個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶。1970年，在美國Khorana實驗室發(fā)現(xiàn)了一種高效連接活性的DNA連接酶T

15、4 DNA連接酶 第26頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二 1970美國Dullecco Temin 和Baltimore（1975年諾貝爾生理醫(yī)學獎獲得者）在腫瘤病毒中存在反轉(zhuǎn)錄酶打破了中心法則，使真核基因的制備成為可能。 DNA分子序列分析及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展也推動了基因工程的發(fā)展 DNA分子的核苷酸序列分析技術(shù)，瓊脂糖凝膠電泳和Southern雜交技術(shù)等技術(shù)的展?；蚬こ梯d體技術(shù)1970載體（vector）的使用成功.1970年噬菌體導入大腸桿菌細胞內(nèi)（轉(zhuǎn)化） 1970年，逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn).第27頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二 1973年，美國斯坦

16、福大學Boyer 和Cohen等獲得了抗四環(huán)素和抗新霉素（卡那霉素）的重組菌落，標志著基因工程的誕生。1973年建立的基因工程的基本模式為標志的。他們將大腸桿菌體內(nèi)的兩個不同的質(zhì)粒提取出來，拼接成一個雜合的質(zhì)粒。當雜合質(zhì)粒被導入大腸桿菌后，它能在大腸桿菌內(nèi)復制并表達雙親質(zhì)粒的遺傳信息。這是基因工程的第一個成功的克隆轉(zhuǎn)化實驗。 Tetracycline pSC101EcoR IDNA LigaseKanamycin R6-5Kanr and Tetr基因工程的誕生標志第28頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二基因工程的成熟 1977年日本的Itakura及其同事首次在大腸桿菌

17、中克隆并表達了人的生長激素釋放抑制素基因。 幾個月后美國的Ullvich克隆并表達了人的胰島素基因。1978年，美國Genentech公司開發(fā)出利用重組大腸桿菌合成人胰島素的先進生產(chǎn)工藝，從而揭開了基因工程產(chǎn)業(yè)化的序幕。 第29頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二表1-1 主要基因工程產(chǎn)品的研制、開發(fā)、上市時間產(chǎn)品時間國家用途上市時間國家人生長激素釋放抑制素(SRM)1977日本巨人癥人胰島素1978美國糖尿病1982歐洲人生長激素（HGH）1979美國侏儒癥1985美國人-干擾素（IFN）1980美國病毒1985歐洲乙肝疫苗（HBsAgV）1983美國乙肝1986歐洲人白

18、細胞介素1984美國腫瘤1989歐洲人促紅細胞生成素（EPO）日本貧血1988歐洲人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美國人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）血栓癥1987 美國第30頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二三、基因工程的騰飛： 1. 1982年，美國人，大鼠生長激素基因轉(zhuǎn)入小鼠；2. 1983年，美國人，Ti質(zhì)粒導入植物細胞（細菌 Neor基因）3. 1990年，美國人，腺苷脫氨酶（ADA）基因治療，重度聯(lián)合免疫缺陷癥（SDID）4. 1990年，美國倡導，人類基因組計劃，15年時間30億USD；2000年6月26日各國科學家向全世界宣布“人類基因組計

19、劃”工作草圖繪制成功，“基因”和“基因組研究”更是成為人們談?wù)摰慕裹c問題。2003 人類基因組側(cè)序完成。 5. 1997年，英國，克隆多利綿羊第31頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二第32頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二三、基因工程的騰飛：第33頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二第34頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二第35頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二四.基因工程的意義 基因工程可以繞過遠緣有性雜交的困難，使基因在微生物、植物、動物之間交流，迅速并定向的獲得人類需要的新的生物類型概括地講，其意義體現(xiàn)在以下三個方面 大規(guī)模生產(chǎn)生物分子； 設(shè)計構(gòu)建新物種； 搜集、分離、鑒定生物信息資源第36頁，共43頁，2022年，5月20日，12點1分，星期二導致第四次工業(yè)大革命 1980年11月15日，美國紐約證券交易所開盤的20分鐘內(nèi)，Genentech公司的新上市股要從3.5USD上至89USD，胰島素基因