ABI測序儀的測序原理和操作規(guī)程

1、ABI型DNA測序儀的測序原理和操作規(guī)程DNA序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和 Maxam-G il ber t化學(xué)降解法。自動化測序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流。 美國PE ABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA測序 儀，其中310型是臨床檢測實驗室中使用最多的一種型號。本實驗介紹的是ABI PRISM 310型DNA測序儀的測序原理和操作規(guī)程?！驹怼?ABI PRISM310型基因分析儀（即DNA測序儀），采用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺 平板電泳，應(yīng)用該公司專利的四色熒光染料標(biāo)記的ddNTP（標(biāo)記

2、終止物法），因此 通過單引物PCR測序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個堿基的3末端 為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產(chǎn)物可 在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序 的精確度。由于分子大小不同，在毛細(xì)管電泳中的遷移率也不同，當(dāng)其通過毛 細(xì)管讀數(shù)窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD（charge-coupled device）攝影機(jī) 檢測器就可對熒光分子逐個進(jìn)行檢測，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不 同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機(jī)上同步成像，分析軟件可自動 將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達(dá)到DNA測序的目的。分析結(jié)果

3、能以凝膠電 泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。它是一臺能自動灌膠、自動進(jìn)樣、自動數(shù)據(jù)收集分析等全自動電腦控制的測定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子 聚合物，包括DNA測序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4)。這些凝膠顆?？讖骄?一，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細(xì)管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機(jī)和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析 和儀器運(yùn)行等軟件。它使用最新的CCD攝影機(jī)檢測器，使DNA測序縮短至2.5h, PCR片段大小分析和定量分析為1040min。由于該儀器具有DNA測序，PC

4、R片段大小分析和定量分析等功能，因此可進(jìn)行 DNA測序、雜合子分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、微衛(wèi)星序列分析、長片段 PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進(jìn)行常規(guī)DNA測序外，還可進(jìn)行單 核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫(yī)學(xué)上的親子和個體鑒 定、微生物與病毒的分型與鑒定等。【試劑與器材】BigDye測序反應(yīng)試劑盒主要試劑是BigDye Mix,內(nèi)含PE專利四色熒光標(biāo) 記的 ddNTP 和普通 dNTP，AmpliTaq DNApolymerase FS，反應(yīng)緩沖液等。pGEM-3Zf (+)雙鏈DNA對照模板0.2g/L,試劑盒配套試劑。M13(-

5、21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2umol/L，即 3.2pmol/ul，試劑盒 配套試劑。DNA測序模板可以是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等。模板濃度應(yīng)調(diào)整在PCR反應(yīng)時取量1卩1為宜。本實驗測定的質(zhì)粒DNA，濃度為0.2g/L，即200ng/ulo5引物需根據(jù)所要測定的DNA片段設(shè)計正向或反向引物，配制成3.2 u mol/L，即3.2pmol/ul。如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M 13(-21)引物, T7引物等。6滅菌去離子水或三蒸水。0.2ml或和0.5m l的PCR管蓋體分離，PE公司產(chǎn)品。3mol/L醋酸鈉(pH5.2)稱取40.8g

6、NaAc?3H20溶于70ml蒸餾水中，冰醋酸 調(diào)pH至5.2，定容至100ml，高壓滅菌后分裝。9.70%乙醇和無水乙醇。NaAc/乙醇混合液 取37.5ml無水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混勻，室溫可 保存1年。POP 6測序膠ABI產(chǎn)品。模板抑制試劑(TSR) ABI產(chǎn)品。13.10X電泳緩沖液ABI產(chǎn)品。ABI PRISM 310型全自動DNA測序儀。2400 型或 9600 型 PCR 儀。臺式冷凍高速離心機(jī)。臺式高速離心機(jī)或袖珍離心機(jī)。【操作步驟】PCR測序反應(yīng)取0. 2ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑： 所加試劑 測定模板管標(biāo)準(zhǔn)對照管Big

7、Dye Mix 1ul 1ul 待測的質(zhì)粒DNA 1ul -pGEM-3Zf (+)雙鏈 DNA - 1ul待測DNA的正向引物lul -M13(-21)引物一lul滅菌去離子水 2ul 2ul總反應(yīng)體積5ul,不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍 離心。將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增98C變性加in后進(jìn)行PCR 循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96C 10s, 50C5s, 60C4min，25個循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4C保溫。醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物將混合物離心，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中。加入25u l醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10mi

8、n以沉淀DNAO 12 000r/min于4C離心30 min，小心棄上清。力加 70%(V/V)的乙醇50u l洗滌沉淀2次。12 000r/min于4C離心5min， 小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀1015min。電泳前測序PCR產(chǎn)物的處理。(1)加入12u l的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離 心。將溶液轉(zhuǎn)移至蓋體分離的0.2ml PCR管中，稍離心。在PCR儀上進(jìn)行熱變性(95C 2min)，冰中驟冷，待上機(jī)。4上機(jī)操作 按儀器操作說明書安裝毛細(xì)管，進(jìn)行毛細(xì)管位置的校正，人工手動灌膠和建立 運(yùn)行的測序順序文件。儀器將自動灌膠至毛細(xì)管，1.2kV預(yù)電泳5mi

9、n,按編程 次序自動進(jìn)樣，再預(yù)電泳(1.2kV, 20min)，在7.5kV下電泳2h。電泳結(jié)束后儀 器會自動清洗，灌膠，進(jìn)下一樣品，預(yù)電泳和電泳。每一個樣品電泳總時間為 2.5h。電泳結(jié)束后儀器會自動分析或打印出彩色測序圖譜。5儀器將自動進(jìn)行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進(jìn)行序列比較。如測序序列已 知，可通過序列比較以星號標(biāo)出差異堿基處，提高工作效率。6測序完畢按儀器操作規(guī)程進(jìn)行儀器清洗與保養(yǎng)?！居嬎恪繙y序反應(yīng)精確度計算公式：100%差異堿基數(shù)(不包括N數(shù))/650 X 100%差異堿基即測定的DNA序列與已知標(biāo)準(zhǔn)DNA序列比較不同的堿基，N為儀器不能 辨讀的堿基?！咀⒁馐马椗c評價】1ABI P

10、RISM 310基因分析儀是高檔精密儀器，需專人操作、管理和維護(hù)。本實驗測序PCR反應(yīng)的總體積是5ul,而且未加礦物油覆蓋，所以PCR管蓋 的密封性很重要，除加完試劑后蓋緊PCR管蓋外，最好選用PE公司的PCR管。如PCR結(jié)束后PCR液小于44.5卩1,則此PCR反應(yīng)可能失敗，不必進(jìn)行純化和 上樣。作為測序用戶來說，只需提供純化好的DNA樣品和引物，一個測序PCR反應(yīng) 使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR測序所需模板的量較少，一般 PCR產(chǎn)物需3090ng，單鏈DNA需50100ng，雙鏈DNA需200500ng，DNA的 純度一般是A260nm/A280nm為1.62.0，最好用去

11、離子水或三蒸水溶解DNA， 不用TE緩沖液溶解。引物用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/卩l(xiāng)較好。4本實驗使用的測序試劑盒是BigDye熒光標(biāo)記終止底物循環(huán)測序試劑盒，一 般可測DNA長度為650bp左右。本儀器DNA測序精確度為(98.5 土0.5)%，儀器不能辨讀的堿基NV2%，所需測定的長度超過了 650bp，則需設(shè)計另外 的引物。為保證測序更為準(zhǔn)確，可設(shè)計反向引物對同一模板進(jìn)行測序，相互印 證。對于N堿基可進(jìn)行人工核對，有時可以辨讀出來。為提高測序的精確度， 根據(jù)星號提示位置，可人工分析該處彩色圖譜，對該處堿基作進(jìn)一步核對。一.Pump Block的清潔及維護(hù)在機(jī)器運(yùn)行前，必須確認(rèn)P

12、ump Block是干凈的，使用POP-6測序時，注意POP-6 室溫下4天須更換。打開310主機(jī)，然后打開Macintosh微機(jī)，打開Data Collection軟件。在 Instrument 菜單下，選擇 manual control。選中 syringe home，點 execute 執(zhí)行。取下1 ml玻璃注射器，去離子水洗凈，晾干。松開capillary fitting，取下毛細(xì)管。取下 buffer reservior雙手執(zhí)穩(wěn)pump block，均勻用力，將其徑直拔出。取5ml塑料注射器，用去離子水反復(fù)清洗pump block，特別注意管路的清洗。晾干后裝上block，并裝上毛細(xì)

13、管。二安裝毛細(xì)管，灌膠從4 C冰箱取出P0P 6膠，室溫回溫30分鐘。吸取少量POP 6，將注射器來回抽動幾次使膠浸潤注射器內(nèi)壁，然后將膠排凈。吸取POP-6適量（0. 2ml）,用DI H20洗凈注射器外壁，擦干，于Pump Block 右側(cè)上緊。將膠放回4 C冰箱。重新裝好毛細(xì)管。進(jìn)入Manual Con trol菜單，關(guān)閉緩沖閥門（Buffer Valve Close），松開廢 液閥門，手指壓注射器排凈管道中氣泡，關(guān)上閥門（Buffer Valve Close）。進(jìn)入Manual Control菜單，打開緩沖閥門（Buffer Valve Open）,同樣方法 排凈管道中氣泡，然后關(guān)閉緩

14、沖閥門。松開capillary fitting，排凈毛細(xì)管一側(cè)的氣泡，關(guān)緊fitting，注意毛 細(xì)管頂端位于管路十字架的右邊緣。將毛細(xì)管固定于檢測窗口 holder處，注意毛細(xì)管窗口之清潔（可用無水乙 醇清洗）, 毛細(xì)管窗口應(yīng)與機(jī)器檢測窗口位置的吻合（此點可用毛細(xì)管上的 Marker位于檢測窗邊緣來證實）。毛細(xì)管另一端插入電極端，使尖端比電極略低約0 . 5 mm ，同時用手指輕輕左右調(diào)節(jié)毛細(xì)管,使之尖端貼近電極尖端（間隔約2毫米），調(diào)好后用膠帶固定，合上控溫板門。在 Instrument 菜單下執(zhí)行 Autosampler Calibration 命令, 出現(xiàn)Autosampler Cal

15、ibration窗口，根據(jù)右下角的提示進(jìn)行操作。打開 Manual Control,執(zhí)行 Syringe Home,然后選擇 Syringe Down，輸 入合適的值并執(zhí)行，使曲柄幾乎與注射器的活塞頂部接觸。具體方法：可先輸入較大的值，如200 ，然后待靠近后，將值減少，如1 00,50, 20, 5。三樣品準(zhǔn)備將 10 X Buffer 稀釋到 1 X Buffer （需約 15ml）。將 1 X Buffer 加入到 Buffer Reservior 及1 號 Buffer Vial,注意將液面 達(dá)到 Marker。2號位為裝有約4ml DI H20的Buffer Vial, 3號位為注入

16、DI H20的去蓋1.5ml eppendorf 管。用適量的TSR溶解測序樣品（根據(jù)試劑盒的Protocol）,變性，冰上劇冷后, 轉(zhuǎn)入專用0.5ml樣品管，蓋好septa。于 Manual Ctrl 中，執(zhí)行 Autosampler HomeX,Y axis 和 Autosampler Home Z axis命令。按Pump Block左邊的Tray鍵，待自動樣品盤伸出后將上述樣品及試劑放置 到相應(yīng)位置，按Tray退回，關(guān)好前門。四測序程序的運(yùn)行于打開的收集軟件之File菜單中選中New。于跳出的菜單中選 Seq. Sample Sheet. 48Tube or 96 Tube （依 Tr

17、ay 的不 同而定）以樣品的實際位置為準(zhǔn)輸入相應(yīng)的樣品名并選擇相應(yīng)的 mobility file 和 instrument file（Matrix file）。存盤（save）關(guān)掉 Sample Sheet。同上所述再次選New，于眺出菜單中選Seq. Inj List。Seq. Inj List表中，可見Sample Sheet下拉菜單，選中剛才編好的SampleSheet （有時間及日期顯示名）。在第一個樣品前須做一個Test CCD 4-Color程序。具體方法是，用鼠標(biāo)選 中Inj#項的No.l，于Edit下拉菜單中，選中Insert，有一個空行插入于表的 No.l處。任選一個Tube & Sample Name后，于Module下拉菜單處，選Test CCD 4-Color，不選擇自動分析即完成。正常情況下4條信號線應(yīng)在2048 （Y軸值） 以下，如高于次值則需暫停機(jī)器并將毛細(xì)管窗口擦凈后再繼續(xù)運(yùn)行。編好Inj List后，存盤（save）（注意Module的選擇）。選擇Run運(yùn)行此編好Inj List。五測序結(jié)果的分析一般分析軟件可對結(jié)果進(jìn)行自動分析，用戶可直接打開Sample file查看測序 結(jié)果。如果用戶