lecture-7-3-染菌防治應(yīng)用課件

1、Lecture 7-2染菌的防治 Lecture 7-2染菌的防治 染菌 什么是染菌？發(fā)酵過程中除了生產(chǎn)菌以外，還有其它菌生長繁殖染菌 什么是染菌？ 染菌的影響 發(fā)酵過程污染雜菌，會嚴(yán)重的影響生產(chǎn)，是發(fā)酵工業(yè)的致命傷。造成大量原材料的浪費，在經(jīng)濟(jì)上造成巨大損失擾亂生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)計劃。遇到連續(xù)染菌，特別在找不到染菌原因往往 會影響人們的情緒和生產(chǎn)積極性。 影響產(chǎn)品外觀及內(nèi)在質(zhì)量 染菌的影響 發(fā)酵過程污染雜菌，會嚴(yán)重的影響生產(chǎn)，是發(fā)酵生產(chǎn)不同的品種，可污染不同種類和性質(zhì)的微生物。不同污染時間，不同污染途徑，污染不同菌量，不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件又可產(chǎn)生不同后果 染菌對發(fā)酵的影響生產(chǎn)不同的品種，可污

2、染不同種類和性質(zhì)的微生物。染菌對發(fā)酵的影發(fā)酵染菌對不同品種的影響放線菌由于生長的最適pH為7左右，因此染細(xì)菌為多，而霉菌生長pH為5左右，因此染酵母菌為多。青霉素發(fā)酵染菌，絕大多數(shù)雜菌都能直接產(chǎn)生青霉素酶，而另一些雜菌則可被青霉素誘導(dǎo)而產(chǎn)生青霉素酶。不論在發(fā)酵前期、中期或后期，染有能產(chǎn)生青霉素酶的雜菌，都能使青霉素迅速破壞。不同菌不同產(chǎn)品發(fā)酵染菌對不同品種的影響放線菌由于生長的最適pH為7左右，因鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素等雖不象青霉素發(fā)酵染菌那樣一無所得，但也會造成不同程度的危害。如雜菌大量消耗營養(yǎng)干擾生產(chǎn)菌的正常代謝；改變pH，降低產(chǎn)量。灰黃霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，

3、對細(xì)菌幾乎沒有抑制和殺滅作用。不同產(chǎn)品鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素等雖不象青霉素發(fā)酵染菌那樣一疫苗生產(chǎn)危害很大?，F(xiàn)在疫苗多采用深層培養(yǎng)，這是一類不加提純而直接使用的產(chǎn)品，在其深層培養(yǎng)過程中，一旦污染雜菌，不論死菌、活菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄。因此，發(fā)酵罐容積越大，污染雜菌后的損失也越大。不同產(chǎn)品疫苗生產(chǎn)危害很大?，F(xiàn)在疫苗多采用深層培養(yǎng)，這是一類不加提純而污染不同種類和性質(zhì)的微生物的影響（1）污染噬菌體 噬菌體的感染力很強(qiáng)，傳播蔓延迅速，也較防治，故危害極大。污染噬菌體后，可使發(fā)酵產(chǎn)量大幅度下降，嚴(yán)重的造成斷種，被迫停產(chǎn)。污染不同種類和性質(zhì)的微生物的影響（1）污染噬菌體（2）污染其它雜菌

4、有些雜菌會使生產(chǎn)菌自溶產(chǎn)生大量泡沫，即使添加消泡劑也無法控制逃液，影響發(fā)酵過程的通氣攪拌。有的雜菌會使發(fā)酵液發(fā)臭、發(fā)酸，致使pH下降，使不耐酸的產(chǎn)品破壞。特別是染芽孢桿菌，由于芽孢耐熱，不易殺死，往往一次染菌后會反復(fù)染菌。 （2）污染其它雜菌染菌時間對發(fā)酵的影響污染時間是指用無菌檢測方法確準(zhǔn)的污染時間，不是雜菌竄入培養(yǎng)液的時間。雜菌進(jìn)入培養(yǎng)液后，需有足夠的生長、繁殖的時間才能顯現(xiàn)出來，顯現(xiàn)的時間又與污染菌量有關(guān)。污染的菌量多，顯現(xiàn)染菌所需的時間就短，污染菌量少，顯現(xiàn)染菌的時間就長。染菌時間對發(fā)酵的影響污染時間是指用無菌檢測方法確準(zhǔn)的污染時間（1）種子培養(yǎng)期染菌由于接種量較小，生產(chǎn)菌生長一開始不

5、占優(yōu)勢，而且培養(yǎng)液中幾乎沒有抗生素（產(chǎn)物）或只有很少抗生素（產(chǎn)物）。因而它防御雜菌能力低，容易污染雜菌。如在此階段染菌，應(yīng)將培養(yǎng)液全部廢棄。（1）種子培養(yǎng)期染菌由于接種量較小，生產(chǎn)菌生長一開始不占優(yōu)勢（2）發(fā)酵前期染菌發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大。原因 發(fā)酵前期菌量不很多，與雜菌沒有競爭優(yōu)勢；且還未合成產(chǎn)物（抗生素）或產(chǎn)生很少，抵御雜菌能力弱。在這個時期要特別警惕以制止染菌的發(fā)生。染菌措施 可以用降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整補(bǔ)料量，用酸堿調(diào)pH值，縮短培養(yǎng)周期等措施予以補(bǔ)救。如果前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補(bǔ)加一些營養(yǎng)，重新接種再用。（2）發(fā)酵前期染菌發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大。（3

6、）發(fā)酵中期染菌 發(fā)酵中期染菌會嚴(yán)重干擾產(chǎn)生菌的代謝。雜菌大量產(chǎn)酸，培養(yǎng)液pH下降；糖、氮消耗快，發(fā)酵液發(fā)粘，菌絲自溶，產(chǎn)物分泌減少或停止，有時甚至?xí)挂旬a(chǎn)生的產(chǎn)物分解。有時也會使發(fā)酵液發(fā)臭，產(chǎn)生大量泡沫。措施 降溫培養(yǎng)，減少補(bǔ)料，密切注意代謝變化情況。如果發(fā)酵單位到達(dá)一定水平可以提前放罐，或者抗生素生產(chǎn)中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌。（3）發(fā)酵中期染菌 發(fā)酵中期染菌會嚴(yán)重干擾產(chǎn)生菌的代謝。雜菌（4）發(fā)酵后期染菌發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對雜菌有一定的抑制或殺滅能力。因此如果染菌不多，對生產(chǎn)影響不大。如果染菌嚴(yán)重，又破壞性較大，可以提前放罐。（4）發(fā)酵后

7、期染菌發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗 發(fā)酵染菌對提煉和產(chǎn)品質(zhì)量的影響1、發(fā)酵染菌對過濾的影響染菌的發(fā)酵液一般發(fā)粘，菌體大多數(shù)自溶，所以在發(fā)酵液過濾時不能或很難形成濾餅，導(dǎo)致過濾困難。即使采取加熱、冷卻、添加助濾劑等措施，使部分蛋白質(zhì)凝聚，但效果并不理想。 發(fā)酵染菌對提煉和產(chǎn)品質(zhì)量的影響1、發(fā)酵染菌對過濾的影污染雜菌的種類對過濾的影響程度有差異，如污染霉菌時，影響較小，而污染細(xì)菌時很難過濾。由于過濾困難，過濾時間拉長，影響發(fā)酵液儲罐和過濾設(shè)備的周轉(zhuǎn)使用，破壞了生產(chǎn)平衡。染菌發(fā)酵液還會因過濾困難而大幅度降低過濾收率，直接影響提煉總收率。污染雜菌的種類對過濾的影響程度有差異，如污染霉菌時

8、，影響較小2、發(fā)酵染菌對提煉的影響染菌發(fā)酵液中含有比正常發(fā)酵液更多的水溶性蛋白和其它雜質(zhì)。采用有機(jī)溶劑萃取的提煉工藝，則極易發(fā)生乳化，很難使水相和溶劑相分離，影響進(jìn)一步提純。采用直接用離子交換樹脂的提取工藝，如鏈霉素、慶大霉素，染菌后大量雜菌黏附在離子交換樹脂表面，或被離子交換樹脂吸附，大大降低離子交換樹脂的交換容量，而且有的雜菌很難用水沖洗干凈，洗脫時與產(chǎn)物一起進(jìn)入洗脫液，影響進(jìn)一步提純。2、發(fā)酵染菌對提煉的影響染菌發(fā)酵液中含有比正常發(fā)酵液更多的水 染菌的原因（一）發(fā)酵染菌率計算基準(zhǔn)總?cè)揪手敢荒臧l(fā)酵染菌的批（次）數(shù)與總投料批（次）數(shù)之比的百分率。染菌批次數(shù)應(yīng)包括染菌后培養(yǎng)基經(jīng)重新滅菌，又再

9、次染菌的批次數(shù)在內(nèi)。這是習(xí)慣的計算方法，也是我國的統(tǒng)一計算方法。總?cè)揪?= 染菌的原因（一）發(fā)酵染菌率計算基準(zhǔn)（二）染菌原因 造成染菌的因素很多，但總結(jié)幾十年的經(jīng)驗，對絕大部分罐批染菌的原因是比較清楚的，但在實際生產(chǎn)中發(fā)酵染菌率仍比較高，可以說產(chǎn)生這種現(xiàn)象大多數(shù)是由于工作中“明知故犯”“不負(fù)責(zé)任”和“僥幸心理”所造成的。例如，滅菌的蒸汽壓不足不能滅菌；設(shè)備有滲漏不能進(jìn)罐等等都是眾所周知的，但因為有僥幸心理還是照樣滅菌，進(jìn)罐，結(jié)果以污染雜菌而告終。現(xiàn)將我們收集到的國內(nèi)外幾家抗生素工廠發(fā)酵染菌原因列于下：（二）染菌原因日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所多年來抗生素發(fā)酵染菌原因分析 項目 百分率%種子帶菌或

10、懷疑種子帶菌 9.64接種時罐壓跌零 0.19培養(yǎng)基滅菌不透 0.79總空氣系統(tǒng)有菌 19.96泡沫冒頂 0.48夾套穿孔 12.36盤管穿孔 5.89接種管穿孔 0.39閥門滲漏 1.45攪拌軸密封滲漏 2.09罐蓋漏 1.54其它設(shè)備滲漏 10.13操作原因 10.15 原因不明 24.94日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所多年來抗生素發(fā)酵染菌原因分析上海第三制藥廠染菌原因分析 項目 百分率%種子帶菌 14.15盤管穿孔 14.20閥門滲漏 23.30空氣系統(tǒng)有菌 10.0管理不善 25.80其它 7.49原因不明 5.78 上海第三制藥廠染菌原因分析管理不善而染菌的有31個罐批，占25.08經(jīng)分析

11、有下表所列原因： 項目 百分率%進(jìn)罐前未做設(shè)備嚴(yán)密度檢查 25.8接種違反操作規(guī)程 25.8檢修質(zhì)量缺乏驗收制度 19.35操作不熟練 19.35配料違反工藝規(guī)程 6.45調(diào)度不當(dāng) 3.25管理不善而染菌的有31個罐批，占25.08經(jīng)分析有下表所列第四制藥廠鏈霉素發(fā)酵染菌原因分析 項目 百分率%外界帶入雜菌（取樣、補(bǔ)料） 8.20設(shè)備穿孔 7.60空氣系統(tǒng)有菌 26.00停電罐壓跌零 1.60接種 11.00蒸汽壓力不足或蒸汽量不足 0.60管理問題 7.80 操作違反規(guī)程 1.60種子帶菌 0.60原因不明 35.00第四制藥廠鏈霉素發(fā)酵染菌原因分析造成染菌的主要原因總結(jié)1、設(shè)備滲漏 設(shè)備滲

12、漏包括夾套穿孔、盤管穿孔、接種管穿孔、閥門滲漏、攪拌軸滲漏、罐蓋漏和其它設(shè)備漏等。從日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所對染菌原因分析發(fā)現(xiàn)，這類染菌占33.85，上海三廠的分析這類染菌為37.5。所以說加強(qiáng)設(shè)備本身及附屬零部件的嚴(yán)密度檢查，對制服染菌是極其主要的，也是重要的。造成染菌的主要原因總結(jié)1、設(shè)備滲漏 設(shè)備滲漏包括夾套穿孔、盤2、空氣帶菌從日本工業(yè)技術(shù)院和上海第四制藥廠分析空氣帶菌而造成的染菌分別為19.96和 26%。國內(nèi)外空氣除菌技術(shù)雖已有較大改善，但仍然沒有使染菌率降低到理想的程度。因為空氣除菌系統(tǒng)較為復(fù)雜，環(huán)節(jié)多，偶遇不慎便會導(dǎo)致空氣除菌失敗。2、空氣帶菌從日本工業(yè)技術(shù)院和上海第四制藥廠分

13、析空氣帶菌而造3、種子帶菌種子帶菌又分為種子本身帶菌和種子培養(yǎng)過程中染菌。加強(qiáng)種子管理，嚴(yán)格無菌操作，種子本身帶菌是可以克服的。種子培養(yǎng)過程染菌與發(fā)酵一樣有許多因素造成。3、種子帶菌種子帶菌又分為種子本身帶菌和種子培養(yǎng)過程中染菌。4、滅菌不徹底滅菌技術(shù)的好壞與滅菌質(zhì)量很有關(guān)系蒸汽通入培養(yǎng)基，升溫快慢、保溫時間產(chǎn)生過多泡沫蒸汽總壓是否達(dá)到要求標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中的雜菌數(shù)量因季節(jié)而有很大差別。如上海第四制藥廠在卡那霉素生產(chǎn)中，于炎熱的夏季將連續(xù)滅菌預(yù)熱至800C的培養(yǎng)基采樣培養(yǎng)，可發(fā)現(xiàn)無法計數(shù)的大量的芽孢桿菌；而在冬季取樣的培養(yǎng)中，則僅發(fā)現(xiàn)23個芽孢桿菌。故染菌率因季節(jié)不同而發(fā)生明顯變化。4、滅菌不徹底滅菌

14、技術(shù)的好壞與滅菌質(zhì)量很有關(guān)系原材料儲存和保管，如液胨、玉米漿、母液糖等有機(jī)原料雜菌的數(shù)量發(fā)酵罐、培養(yǎng)基配制罐等設(shè)備的清洗質(zhì)量有無滅菌的死角對減少或避免染菌仍然是十分必要的。 原材料儲存和保管，如液胨、玉米漿、母液糖等有機(jī)原料雜菌的5、技術(shù)管理不善技術(shù)管理就是要對發(fā)酵每個環(huán)節(jié)嚴(yán)格控制，發(fā)酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有僥幸心理而放松管理5、技術(shù)管理不善技術(shù)管理就是要對發(fā)酵每個環(huán)節(jié)嚴(yán)格控制，發(fā)酵中三、無菌狀況的檢測1、環(huán)境無菌的檢查塵埃粒子檢測無菌平板檢測三、無菌狀況的檢測1、環(huán)境無菌的檢查2、種子及發(fā)酵液無菌狀況檢測酚紅肉湯培養(yǎng)基檢測平板劃線顯微鏡觀察2、種子及發(fā)酵液無菌狀況檢測酚紅肉湯培養(yǎng)基

15、檢測四、染菌情況分析染菌的原因有多種，對于實際情況如何分析呢？1、單罐染菌不是系統(tǒng)問題，而是該罐本身的問題。如種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、罐有滲漏、分過濾器失效四、染菌情況分析染菌的原因有多種，對于實際情況如何分析呢？12、多罐染菌系統(tǒng)問題，如空氣過濾系統(tǒng)有問題，特別是總過濾器長期沒有檢查，可能受潮失效；移種或補(bǔ)料的分配站有滲漏或滅菌不徹底3、前期染菌種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底2、多罐染菌3、前期染菌4、中后期染菌補(bǔ)料的料液滅菌不徹底或補(bǔ)料管道、閥門滲漏，一般不會是種子問題4、中后期染菌五、染菌的防止1、防止種子帶菌制備種子時對沙土管及搖瓶嚴(yán)格加以控制。沙土制備時要多次間歇滅菌注意接種時的無菌

16、操作子瓶、母瓶的移種和培養(yǎng)無菌室和搖床間都要保持清潔。無菌室內(nèi)要供給恒溫恒濕的無菌空氣，還要裝紫外燈用以滅菌，或用化學(xué)藥品滅菌。五、染菌的防止1、防止種子帶菌制備種子時對沙土管及搖瓶嚴(yán)格加無菌室要求在無菌室中裝有紫外燈，打開紫外燈，照半小時，關(guān)燈后15分鐘再接種。用消毒藥水如新潔而滅配成1/1000濃度擦桌子、拖地，開啟超凈臺的通風(fēng)，接種時必須在超凈臺上操作，超凈臺裝有一臺鼓風(fēng)機(jī)，進(jìn)風(fēng)口有一粗過濾器，出風(fēng)口有高效過濾器，保證無菌風(fēng)從超凈臺吹出，外界有菌空氣不可能進(jìn)入接種區(qū)域，保證無菌條件。接種人員必須穿好無菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干凈。無菌室要求在無菌室中裝有紫外燈，打開紫外燈，照半小時

17、，關(guān)燈后lecture-7-3-染菌防治應(yīng)用課件2、防止設(shè)備滲漏發(fā)酵設(shè)備及附件由于化學(xué)腐蝕、電化學(xué)腐蝕，物料與設(shè)備摩擦造成機(jī)械磨損以及加工制作不良等原因會導(dǎo)致設(shè)備及附件滲漏。設(shè)備上一旦滲漏，就會造成染菌，例如冷卻盤管、夾套穿孔滲漏，有菌的冷卻水便會通過漏孔而進(jìn)入發(fā)酵罐中招致染菌。閥門滲漏也會使帶菌的空氣或水進(jìn)入發(fā)酵罐而造成染菌。設(shè)備上的漏隙如果肉眼能看見，容易發(fā)現(xiàn)，也容易治理；但有的微小泄漏，肉眼看不見，必須通過一定的試漏方法才能發(fā)現(xiàn) 。2、防止設(shè)備滲漏發(fā)酵設(shè)備及附件由于化學(xué)腐蝕、電化學(xué)腐蝕，物料試漏方法可采用水壓試漏法。即被測設(shè)備的出口處裝上壓力表，將水壓入設(shè)備，待設(shè)備中壓力上升到要求壓力，

18、關(guān)閉進(jìn)出水，看壓力有否下降。壓力下降則有滲漏。但有些滲漏很小，看不出何處漏水，可以用稀堿溶液壓入設(shè)備，然后用蘸有酚酞的紗布揩，只要酚酞能變紅處即為滲漏處。 閥門滲漏可以用集氣桶來試漏。方法是先在集氣桶中裝滿水，然后關(guān)閉所有閥門，向發(fā)酵罐中通入空氣，使罐壓上升到要求壓力，一般一公斤以上。由于集氣桶連通各管道，觀察哪根管子冒泡，即這根管子的閥門漏氣。試漏方法可采用水壓試漏法。即被測設(shè)備的出口處裝上壓力表，將水3、防止培養(yǎng)基滅菌不徹底培養(yǎng)基滅菌方法高壓蒸汽滅菌分批滅菌 1210C，30分鐘連續(xù)滅菌 罐溫1251300C，3045分鐘3、防止培養(yǎng)基滅菌不徹底培養(yǎng)基滅菌方法高壓蒸汽滅菌5、發(fā)酵染菌后的措

19、施染菌后的培養(yǎng)基必須滅菌后才可放下水道。滅菌方法：可通蒸汽滅菌，也可加入過氧乙酸等化學(xué)滅菌劑攪拌半小時，才放下水道。否則由于各罐的管道相通，會造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也會造成空氣的污染而導(dǎo)致其它罐批染菌。凡染菌的罐要找染菌的原因，對癥下藥，該罐也要徹底清洗，進(jìn)行空罐消毒，才可進(jìn)罐。染菌厲害時，車間環(huán)境要用石灰消毒，空氣用甲醛熏蒸。特別，若染噬菌體，空氣必須用甲醛蒸汽消毒。5、發(fā)酵染菌后的措施染菌后的培養(yǎng)基必須滅菌后才可放下水道。滅四、染噬菌體的防治（一）染噬菌體對發(fā)酵的影響發(fā)酵過程中如果受噬菌體的侵染，一般發(fā)生溶菌，隨之出現(xiàn)發(fā)酵遲緩或停止，而且受噬菌體感染后，往往會反復(fù)連續(xù)感染，使生產(chǎn)無法進(jìn)行，甚至使種子全部喪失。四、染噬菌體的防治（一）染噬菌體對發(fā)酵的影響發(fā)酵過程中如果受染噬菌體表現(xiàn)為：1、鏡檢可發(fā)現(xiàn)菌體數(shù)量明顯減少，菌體不規(guī)則，嚴(yán)重時完全看不到菌體，且是在短時間內(nèi)菌體自溶。2、發(fā)酵pH值逐漸上升，48小時之內(nèi)可達(dá)8.0以上，不再下降。3、發(fā)酵液殘?zhí)歉?，有刺激臭味，粘度大，泡沫多?、生產(chǎn)量甚少或增長緩慢或停止有無染噬菌體，根本的要做噬菌斑檢驗染噬菌體表現(xiàn)為：（二）產(chǎn)生噬菌體的原因通常在工廠投產(chǎn)初期并不感到噬菌體的危害，經(jīng)過12年以后，主要是由于生產(chǎn)和試驗過程中不斷不加注意地把許多活菌體排放到環(huán)境中去，自然