雙向電泳原理與流程課件

1、 萬 翔Xiang.wa雙 向 電 泳 技 術 萬 翔 雙 向 電 泳 技 Proteomics“.the analysis of complete complement of proteins. Proteomics includes not only the identification and quantification of proteins, but also the determination of their localization, modifications, interactions, activities, and, ultimately,

2、their function. Stanley Fields, University of Washington, Seattle, in Science 291, 1221 (2001)Proteomics“.the analysis of Proteomics一個細胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達的所有種類的蛋白質(zhì)稱為蛋白質(zhì)組(proteome) 僅僅從基因組學水平上無法徹底的了解各種生命現(xiàn)象, 因為蛋白質(zhì)才是生命活動的真正執(zhí)行者 從基因組學上我們無法檢測到轉錄后修飾、翻譯調(diào)節(jié)、選擇性剪切、以及蛋白復合物形成、蛋白質(zhì)相互作用等生命現(xiàn)象; 此外并不是細胞內(nèi)的所有的DNA都翻譯轉錄成蛋白質(zhì) Pro

3、teomics一個細胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達的所有Proteome Analysis and ProteomicsThe analysis of the entire PROTEin complement expressed by a genOME, or by a cell or tissue type.Wasinger VC et al, Electrophoresis 16 (1995)“Proteomics is the study of quantitative changes of expression levels and their application to drug

4、discovery, diagnostics and therapy.”Two basic technologies:2-D electrophoresis of complex protein mixturesIdentification and structure analysis of proteins with mass spectrometry methodsProteome Analysis and ProteomWhy 2DE? Only “Proteomics” is the large-scale screening of the proteins of a cell, or

5、ganism or biological fluid, a process which requires stringently controlled steps of sample preparation, 2-D electrophoresis, image detection and analysis, spot identification, and database searches. The core technology of proteomics is 2-DE. At present, there is no other technique that is capable o

6、f simultaneously resolving thousands of proteins in one separation procedure. Why 2DE? Only “Proteomics”理論 pI and Mr 圖 酵母細胞表達6,216種蛋白pI (理論值)Mr kDa2DE 工作范圍注: 圖片中沒有特別強調(diào)蛋白豐度和疏水性至今1,484個蛋白被鑒定 (Nat.Biotechnol. 17,676 and 19, 242)From: Wildgruber et al. Electrophoresis 21 (2000) 2610-2616.理論 pI and Mr 圖

7、酵母細胞表達6,216種蛋白2D 電泳優(yōu)越性對未處理樣本耐受性好不需要預純化 (如：色譜層析) 分辨率非常高2D 可以有效的組分收集器蛋白在凝膠介質(zhì)中受到保護在蛋白質(zhì)組學技術中應用范圍最廣（front-end ）與其他技術相比，在一次試驗中可檢測到的蛋白點更多 與后續(xù)分析技術兼容性好 (如. MDLC)2D 電泳優(yōu)越性對未處理樣本耐受性好蛋白質(zhì)組學應用舉例 研究細胞結果功能和分子組成 發(fā)現(xiàn)新的藥物靶位點 發(fā)現(xiàn)新型生物學活性的分子和藥物 差異蛋白質(zhì)組學 發(fā)現(xiàn)細菌、病毒感染和疾病監(jiān)測的分子標志物 修飾蛋白質(zhì)組學 遺傳或藥理學擾動的分子解剖 病理生理學研究 中藥機理相互作用蛋白質(zhì)組學 研究藥物作用方

8、式和毒性機理 植物抗蟲抗旱抗逆遺傳育種和分子育種資源環(huán)境海洋生物 蛋白質(zhì)組學應用舉例 研究細胞結果功能和分子組成 發(fā)現(xiàn)新的尋找差異蛋白質(zhì)環(huán)孢素A處理前環(huán)孢素A處理后正常 組織腫瘤組織細胞組織尋找差異蛋白質(zhì)環(huán)孢素A處理前環(huán)孢素A處理后正常 組織腫瘤組織Life Sciences 的歷史LKB 電泳發(fā)明者Pharmacia 層析技術開創(chuàng)者Amersham Biosciences 提供基因組、蛋白組學研究整體解決方案GE Healthcare Life Sciences 實現(xiàn)從發(fā)現(xiàn)到功能研究，從體外到體內(nèi)的突破 Life Sciences 的歷史LKBGE Healthcare milestones

9、 in 2-D electrophoresisLKB introduced Ampholine, the first commercial carrier ampholyteThe first multiple separation system, ISO-DALT, was developedPharmacia Fine Chemicals introduced PharmalyteLKB introduced ImmobilinePharmacia Biotech introduced Immobiline DryStripPharmacia Biotech introduced Imag

10、eMaster suitePharmacia Biotech introduced IPGphorPharmacia Biotech launched DALT II systemAmersham Pharmacia Biotech launched Typhoon Amersham Biosciences launched Ettan DIGE The Multiphor flatbed electrophoresis unit is launched. In production for 30 years in 2003! 196719781979198219911993199820002

11、00020021973GE Healthcare milestones in 2-雙向電泳原理與流程課件Image analysisImage acquisitionAutomated spot pickingSpot digestionMALDI target spottingLWS Laboratory workflow systemMALDI-ToFProtein SeparationProteomics 2DE WorkflowSample PrepSample labelingImage analysisImage acquisitio 小鼠肝臟蛋白提取物2D凝膠電泳2-D elec

12、trophoresis gelfrom Prof. Dr. A. Grg, Technical University Munich, Germany 小鼠肝臟蛋白提取物2D凝膠電泳2-D electropho2D/MS 經(jīng)典工作流程細胞裂解勻漿預分級除雜質(zhì)濃縮定量差異分析雙向電泳第一向第二向圖像獲取圖譜分析銀染 考染熒光 蛋白標記樣品制備分離染色圖譜分析挖點酶解點靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細胞2D/MS 經(jīng)典工作流程細胞裂解差異分析雙向電泳圖像獲取銀染樣品制備 細胞破碎蛋白沉淀溶解抑制蛋白酶活性去除 核酸脂類鹽，緩沖液，離子性小分子不溶性物質(zhì)樣品制備 細胞破碎2D/MS 經(jīng)典工作流程差異分析

13、圖像獲取圖譜分析銀染 考染熒光 蛋白標記染色圖譜分析挖點酶解點靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細胞Separation雙向電泳第一向第二向細胞裂解勻漿預分級除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備2D/MS 經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取銀染 蛋白標記染色圖Principle of 2-D Electrophoresis1. First dimension:denaturing isoelectric focusingseparation according to the isoelectric point2. Second dimension:SDS electrophoresisseparation accord

14、ing to the molecular weight 2-D electrophoresis resolves a few thousand protein spots.Principle of 2-D Electrophores等電聚焦電泳原理蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。等電聚焦電泳原理蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負電荷 等電聚焦（IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)，從而構成從正極到負極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運動，最后各自停留在其等電點的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等

15、電點。等電聚焦電泳原理 等電聚焦（IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電雙向電泳：傳統(tǒng)方法sample膠在SDS 緩沖液中平衡Principle according to P.H. OFarrell and J. Klose (1975)pH 10pH 10pH 3pH 3垂直膠管中進行等電聚焦 urea, NP-40一向:二向:SDS 丙烯酰胺凝膠電泳非連續(xù)梯度膠按等電點分離（電荷）按分子量分離（質(zhì)量）雙向電泳：傳統(tǒng)方法sample膠在SDS 緩Principl使用載體兩性電解質(zhì)IEF時存在的問題不同批次載體兩性電解質(zhì)的重現(xiàn)性載體兩性電解質(zhì)梯度不穩(wěn)定蛋白載量有限重現(xiàn)性差導致梯度漂移梯度漂移導致酸

16、性和堿性蛋白質(zhì)丟失管膠柔軟，尺寸不定操作者個人技術影響結果使用載體兩性電解質(zhì)IEF時存在的問題不同批次載體兩性電解質(zhì)的固相凝膠(支持膜上0.5 mm 厚凝膠)丙烯酰胺緩沖液: Immobiline CH2=CH-CO-NH-R,R ：羧基或叔胺基固相 pH梯度 (IPG)固相凝膠丙烯酰胺緩沖液: Immobiline 固相 pHImmobiline 干膠條的特性可重復性無梯度漂移, 真正的平衡方法可分離酸性和堿性蛋白 容納蛋白樣本量更多水平和垂直 SDS 凝膠中都能使用允許樣本水化上樣 機械強度和尺寸穩(wěn)定易操作易于對樣本跟蹤標記Immobiline 干膠條的特性可重復性新pH范圍的 Immob

17、iline 干膠條高分辨率的 IPG 膠條，聯(lián)合使用DeStreak試劑, 能改善極堿性區(qū)域蛋白點結果。歸功于獨特的試劑。使用pH范圍相互重疊的干膠條，可提高2-D 圖譜 分析效率!新pH范圍: Immobiline DryStrip pH 3 5.6 NLImmobiline DryStrip pH 5.3 6.5Immobiline DryStrip pH 6.2 7.5Immobiline DryStrip pH 7 11 NLImmobiline DryStrip pH 3 11 NL新pH范圍的 Immobiline 干膠條高分辨率的 IPG不同pH范圍膠條 不同長度、多種窄pH范圍

18、膠條可選，尤其是1個pH范圍 pH7-11NL堿性膠條不同pH范圍膠條 不同長度、多種窄pH范圍膠條可選，尤其是1寬pH 、窄 pH 范圍膠條寬pH梯度膠條應用:整個蛋白圖譜窄 pH梯度膠條應用:提高分辨率增加樣品上樣量檢測分析更多蛋白pH 345678910456789寬pH 、窄 pH 范圍膠條寬pH梯度膠條應用:pH 345提高分辨率: 斑點顯現(xiàn)IPG 4-7IPG 5-6IPG 4-7IPG 5.5-6.7Mouse liver proteinsFrom A. Grg et al. (1999)提高分辨率: 斑點顯現(xiàn)IPG 4-7IPG 5-6IPG 4不同長度的膠條7 cm 11 c

19、m 13 cm 18 cm24cm不同長度的膠條7 cm 11 cm 線形與非線形膠條for most samples Cell lysates Tissue extractslinear (L)nonlinear (NL)for samples with abundant proteins in the range between pH 5 and 7Serum proteins線形與非線形膠條for most samples linpH 3-10 L and NLfrom Prof. Angelika Grg, Technical University MunichTissue Prote

20、ins from Mouse Liverlinear (L)nonlinear (NL)pH 3-10 L and NLfrom Prof. AngThe IPGphor PlatformThe IPGphor PlatformIPG 膠條 水化IPG 膠條 水化IPG strip rehydration如果水化時加入樣品， 此體積是加入樣品后的終體積IPG strip rehydration如果水化時加入樣品加樣品到膠條槽加樣品到膠條槽泡漲盤 VS 聚焦盤泡漲盤 VS 聚焦盤干膠條的水化主動水化：膠條槽內(nèi)進行，大分子蛋白更容易進入膠條；30120V，1024Hrs被動水化：專用水化盒中進行N

21、EW！無需覆蓋油！避免灰塵污染，空氣作用不透明蓋子，適用于CyDye DIGE標記同時適用于市場上所有724cm干膠條的水化干膠條的水化主動水化：膠條槽內(nèi)進行，大分子蛋白更容易進入膠條在樣品杯中加入少量不含樣品的水化液檢查是否漏液。上樣前吸走水化液。上樣前將樣品離心去掉不溶物，每個樣品杯最多可加樣150l。蓋上膠條槽的蓋子，再蓋IPGphor 儀器的蓋子。分別將兩個IEF 電極片放在IPG 膠條膠的兩端，分別將電極壓在兩個電極片的外緣。樣品杯可放在兩個電極間除膠條槽內(nèi)側凸起外任何位置，對于堿性分離范圍的IPG 膠條，盡量將樣品杯靠近陽極放置.杯上樣 & 紙橋上樣在樣品杯中加入少量不含樣品的水化

22、液檢查是否漏液。上樣前吸走水IEF電泳IPGphor 包括半導體溫控系統(tǒng)(20C)和程序化電源(10000V)可同時進行12根膠條的等電聚焦聚焦效果以“Vh”數(shù)控制，可提高重復性IEF電泳IPGphor 包括半導體溫控系統(tǒng)(20C)和程IPG 膠條的平衡兩步平衡SDS 電泳前, 平衡母液:2% SDS, 50mM Tris-HCl pH 8.8,6M urea, 30% glycerol + 蛋白與SDS結合 甘油和尿素降低電內(nèi)滲作用第一步DTT平衡： (1 x 15min) 1% DTT第二步碘乙酰胺平衡：去除多余的 DTT ，防止拖尾 (1 x 15min) 2.5% iodoacetam

23、ideIPG 膠條的平衡兩步平衡SDS 電泳前, 平衡母液:第二向垂直電泳系統(tǒng) 瓊脂糖覆蓋密封 放置 IPG strip低熔點瓊脂糖第二向垂直電泳系統(tǒng) 瓊脂糖覆蓋密封 放置 低熔點瓊脂糖Push the IPG Strip Down onto the Gel SurfacePush the IPG Strip Down onto tSeal the Cassette and Fix the IPG Strip with AgaroseSeal the Cassette and Fix the Inserting the CassetteInserting the CassetteSDS參數(shù)SD

24、S參數(shù)SE600rubySE600rubyEttan DALTsixEttan DALTsixEttan DALTtwelve systemEttan DALTtwelve system第二向系統(tǒng)stripgelnumberrunning length (cm)size (cm)of gelstime (hr)Ettan Dalt1218, 2425 x 20124.5Ettan Dalt618, 2425 x 20 64.5SE 6002 x 7, 1314 x 16 (24) 44MiniVE 78 x 7, 8 x10 21.5Multiphor II7, 1124 x 11* 11.5

25、1824 x 18 13.3PhastSystem (4)*4 x 4 20.5* 2 or 3 strips side-by-side* cut or home-made strip第二向系統(tǒng)stripgelnumberrunn2D/MS 經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取圖譜分析蛋白標記圖譜分析挖點酶解點靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細胞分離細胞裂解勻漿預分級除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備雙向電泳第一向第二向銀染 考染熒光染色2D/MS 經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取蛋白標記圖譜分析挖點Protein Detection Methods Protein Detection Methods Coomassie

26、 Blue-考馬斯亮藍染色+ 靈敏度 ，低至0.01 mg (“膠體”考染)+ 非特異性染色+ 染料與蛋白成比例結合+ 線性化好 擴散速度受限，膠的厚度影響跑膠速度 純度不夠 有限的動力學范圍Coomassie Blue-考馬斯亮藍染色+ 靈敏度 ， 膠體考馬斯亮藍染色1 mg E. coli strain BIPGphor 24 cm pH 4 - 7Colloidal CBBG250 staining 膠體考馬斯亮藍染色1 mg E. coli str銀染+ 靈敏度 ，低至0.2 ng + 在凝膠基質(zhì)中與蛋白交聯(lián)+ 自動催化反應 染凝膠表面蛋白 線性化程度比考染低一些大分子物質(zhì)也被染色 步

27、驟多，某些步驟時間控制嚴格銀染+ 靈敏度 ，低至0.2 ng Silver stained gel of E. coli Lysate IPG 4-7Silver stainedwith PlusOneKitwithout glutaraldehydeand formaldehydein the Ag sol.Silver stained gel of E. coli 2D/MS 經(jīng)典工作流程差異分析蛋白標記挖點酶解點靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細胞分離細胞裂解勻漿預分級除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備雙向電泳第一向第二向圖像獲取圖譜分析銀染 考染熒光染色圖譜分析2D/MS 經(jīng)典工作流程差異分析蛋白標記

28、挖點蛋白鑒定體液植物ImageScanner III圖像掃描系統(tǒng)灰度校正功能平臺具有防水功能，可直接掃描SDS濕膠。3.7OD高動態(tài)范圍，保證高、低豐度蛋白的準確定量。掃描平臺大，A3掃描面積，一次可掃描2塊24cm凝膠。Gray 256 scaleTransmissive300dpiImageScanner III圖像掃描系統(tǒng)灰度校正功能Gr由SIB, GeneBio和GE Healthcare合作開發(fā)，為SwissProt推薦分析軟件。高效能參數(shù)自動找點，全自動蛋白定量計算方法，不受背景影響。在原始數(shù)據(jù)上進行分析，結果可靠。界面窗口可隨意設計，界面極其友好。全自動凝膠匹配，采用先進的算法。根據(jù)點的相關因素、形狀、位置、周圍情況，膠間匹配效率高。多種統(tǒng)計學分析工具，快速找到膠間蛋白表達差異?？芍苯渔溄拥紼xPASy 和 SwissP