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文檔簡介
1、第三章 DNA的功能第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄 Transcription DNA一般存在于核內(nèi),蛋白質(zhì)合成則在細胞質(zhì)內(nèi),那么DNA是怎樣控制蛋白質(zhì)的合成呢? 一. RNA是中間體:實驗證據(jù)用放射性RNA前體(如尿嘧啶)作標記實驗表明,最先合成的放射性RNA是在細胞核中產(chǎn)生的;然后用非放射性RNA前體作跟蹤實驗,結(jié)果:放射性RNA又流向了細胞質(zhì),這提示,在DNA和蛋白質(zhì)之間的遺傳信息傳遞過程中,RNA是一中間物。 用非放射性用放射性RNA前體標記 示蹤后RNA出現(xiàn)于細胞質(zhì)中 RNA前體示蹤遺傳信息的流向中心法則如用T2 噬菌體感染大腸桿菌,最明顯的變化是 RNA 的快速合成,而且發(fā)現(xiàn)RNA與T2噬菌體的DN
2、A的核苷酸成份是非常相近的。證明 RNA是由DNA合成而來的,然后進入細胞質(zhì),在細胞質(zhì)的特定場所指導合成特定的蛋白質(zhì),因此遺傳信息的流向包括三個步驟。DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄 核RNARNA 質(zhì)轉(zhuǎn)譯蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)錄 以DNA為模板,按照堿基互補原則合成一條單鏈RNA,從而將DNA中的遺傳信息轉(zhuǎn)移到RNA中去的過程稱轉(zhuǎn)錄(transcription),RNA合成以53方向進行。 轉(zhuǎn)錄 不對稱轉(zhuǎn)錄:轉(zhuǎn)錄僅發(fā)生在DNA的一條鏈上。分子雜交證明,某一基因的RNA只能與其DNA的一條鏈有雜交反應(yīng),即說明DNA上只有一條鏈可作為模板合成該基因的RNA。 5 3 變性分開5 3 + 標記的RNA 復(fù)性 5 5 5 3 3
3、 3 3 5 模板鏈(或互補鏈)編碼鏈 三、轉(zhuǎn)錄的起始(Initiation) 1啟動子(promoter):是DNA轉(zhuǎn)錄起始信號的一段序列,它能指導全酶與模板正確地結(jié)合,并活化酶使之具有起始特異性轉(zhuǎn)錄形式。 大腸桿菌啟動子序列分三個部位:R位點:RNA聚合酶識別位點;B位點:結(jié)合部位;I位點:轉(zhuǎn)錄起始部位。 10區(qū) 35區(qū) pribnow box TGTTGACA1517bpTATAAT58bp起始點)+1 2RNA聚合酶 E.coli RNA聚合酶500kd,由、五種不同的亞基組成,全酶:2。 核心酶:2; 因子本身無催化功能,當它與核心酶結(jié)合時可使RNA聚合酶識別啟動子序列,并能特異性地
4、在這些部位上形成穩(wěn)定的復(fù)合體。The early stages of transcription in prokaryotes, showing (a) the components of the process; (b) template binding at the 10 site involving the sigma subunit of RNA polymerase and subsequent initation of RNA synthesis; and (c) chain elongation, after the sigma subunit has dissociated f
5、rom the transcription complex and the enzyme moves along the DNA template.12-8五、轉(zhuǎn)錄的終止(Termination) RNA聚合物也能識別鏈的終止信號。 1在某些情況下,識別作用是直接的。終止子(tenminator):轉(zhuǎn)錄終止的信號,其作用是在DNA模板特異位置處終止RNA的合成。在終止處RNA聚合酶作用停止,新生RNA鏈釋放, 2識別終止信號有時需要某些蛋白質(zhì)因子(rho因子)的作用,rho因子與RNA聚合酶相互作用導致RNA鏈釋放。終止子(terminator):DNA序列上轉(zhuǎn)錄終止的信號,其作用是在DNA模
6、板的特定位置處終止RNA的合成。DNA上終止子有兩個明顯特征:如下圖(1)鏈內(nèi)具有對稱結(jié)構(gòu),能使轉(zhuǎn)錄物形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu);(2)DNA上有一串A,轉(zhuǎn)錄形成的RNA 3端具有多個U,AU配對不牢固,使RNA脫落。 UCC U G G C A U25 C G 15C G G C C G C G 5UAAUCCCACAG CAUUUU 3 535 核糖體ribosomes 是由核糖體蛋白和核糖體RNA(rRNA)組成的復(fù)合體。在電鏡下,一個核糖體象一個墨滴。有關(guān)核糖體的精細的功能仍然是目前眾多研究中的重要課題,rRNA分子如何與蛋白質(zhì)相結(jié)合以及其功能目前仍然不清楚。A comparison of the
7、 components in the prokaryotic and eukaryotic ribosome 13-1 二、蛋白質(zhì)合成 3新的氨基酸通過肽鍵接到生長的鏈上: aa3-tRNA3 + aa1-aa2-tRNA2aa1-aa2-aa3-tRNA3 + tRNA2(釋放) 較大的多肽 4上述過程繼續(xù)進行直至aan(最后一個aa連接上) ,整個過程還需mRNA,核糖體,一些蛋白質(zhì)因子,酶和無機離子。 三、蛋白質(zhì)合成的特異性1. 識別mRNA上編碼特異性氨基酸的密碼子是tRNA還是氨基酸?半胱氨酸-tRNA半 丙氨酸t(yī)RNA半 用雜合性的丙氨酸t(yī)RNA半合成的蛋白在原先預(yù)期是半胱氨酸 的
8、位置上都是丙氨酸。 結(jié)論:氨基酸在語言上有錯誤,識別密碼子是由tRNA的特異 性決定的。鎳化氫2反密碼子(anticodon):tRNA上能識別一個mRNA密碼子的位置,這個位置上的堿基與密碼子的堿基是互補的。3tRNA的一般結(jié)構(gòu)和功能區(qū)由于tRNA上反密碼子環(huán)能識別mRNA相應(yīng)的密碼子,因此在遺傳信息的轉(zhuǎn)譯中起十分重要的作用。4tRNA來自何處?一個基因一條多肽的理論并不是完全正確的,有些基因編碼蛋白,而另一些基因(如rRNA或tRNA基因)是編碼并合成RNA作為終產(chǎn)物。 Holleys two-domensional cloverleaf model of transfer RNA. 13
9、-3A three-dimensional model of transfer RNA. 13-4四、核糖體功能和蛋白質(zhì)合成 1. 轉(zhuǎn)譯組分Elongation of the growing polypeptide chain during translation. 3.延長Termination of the process of translation. 13-84.終止在原核生物中,轉(zhuǎn)譯并不等到mRNA合成完成之后開始,一部分mRNA合成后,核糖體能立即附著到mRNA上起動轉(zhuǎn)譯,而在真核生物中,轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯有時間和空間上的分開。 第三節(jié) 遺傳密碼 The Genetic Code 假如核苷
10、酸對是密碼中的字母,字母的不同組合會形成代表不同氨基酸的文字,要解決的問題是:1.密碼是重疊還是非重疊的?2.由多少個字母組成一個文字?即密碼子3.哪一種特定的密碼子或哪幾種密碼子代表各自特 定的氨基酸? 一、遺傳密碼的非重疊性 ( nonoverlapping) 11961年,用遺傳分析證明,遺傳密碼是非重疊的實驗證據(jù):對TMV由亞硝酸誘發(fā)的突變的蛋白作分析表明,在某一蛋白質(zhì)區(qū)段中一次只有一個氨基酸的變化。如果是重疊密碼子,那么一個堿基的變化將會使蛋白質(zhì)中鄰近位置上多達三個氨基酸的變化。 A T T G C T C A G C T T G A C A T T T T G T G C G C
11、T C T COverlapping code aa1 aa2 aa3 aa4 aa5 1 2 3 4 5 Nucleic acidNonoverlapping code aa1 aa2 aa3 aa4 aa5Amino acidCodonCodonAmino acid 非重疊密碼子和重疊密碼子的區(qū)別 2在某一特定蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯中是以非重疊方式讀碼的,但并不排除用相應(yīng)不同的讀碼框架(reading frames)來編碼不同蛋白質(zhì)的氨基酸的可能性。一種蛋白編碼方式 ATT GCT CAG CTT G 另一種蛋白解讀時移動一個堿基: A TTG CTC AGC TTG二、密碼中字母的數(shù)目 理論上推測
12、:至少三個核苷酸對組成一個密碼子:43 = 64種 三、利用抑制基因證明密碼三聯(lián)體性質(zhì) 60年代初,Crick等用遺傳學實驗驗證了密碼子的三聯(lián)體特征: 1原黃素能誘發(fā)T4的rII突變(不能在K上生長),其作用是在DNA鏈中造成單個核苷酸對的插入或缺失: 插AT A TC T A G T C T T A GA T C A G A A T C T G T C T T A G A C A G A T A G A C A A 缺CG A T C T G T T 開始由原黃素誘導的突變體稱FCO突變體,F(xiàn)CO再經(jīng)黃原素處理會自發(fā)產(chǎn)生能在E.coli K()上形成野生型噬菌斑的“回復(fù)突變體”(revert
13、ants)。對這些突變體作遺傳分析發(fā)現(xiàn),與真正的野生型不同,其回復(fù)突變的表型是由于在FCO的同一順反子中不同位點上發(fā)生了第二個突變。這種第二個突變抑制了原先FCO突變的表達 突變抑制基因(Suppressor mutation):能反作用于或抑制另一突變的效應(yīng)。(1)抑制基因與它被抑制的那個基因的位置不同;(2)可位于同一基因內(nèi),也可位于不同的基因內(nèi);(3)不同的抑制基因有不同的功能。 利用重組可以從原初的正向突變體分離到抑制基因突變體。奇怪的是,發(fā)現(xiàn)該抑制基因自身也是一種rII突變。 rII(FCO)rIIrII回復(fù)rIIrII+ +rIIrII和分離FCO和抑制基因Wild type 怎樣
14、解釋上述結(jié)果? 原黃素誘導的單個核苷酸對的插入或缺失會引起移碼突變(frame-shiit mutation),從而引起大多數(shù)密碼的錯讀,但是在某個地方由于插入和缺失的補償作用,會恢復(fù)合適的讀碼,只在兩個突變位點之間產(chǎn)生一小段錯誤的密碼: (用三字母英文單詞代表密碼子) THE FAT CAT ATE THE BIG RAT 缺C:THE FAT ATA TET HEB IGR AT 插A:THE FAT ATA ATE THE BIG RAT插入恢復(fù)了信息中大多數(shù)密碼的含義,從而抑制了缺失的效應(yīng)大多數(shù)密碼的錯讀大部分恢復(fù)合適的讀碼 假定FCO突變是由于一個核苷酸對的插入,那么第二個突變即抑制
15、基因突變就應(yīng)該是一個缺失,因為只有這樣才能恢復(fù)該基因的讀碼框。假定密碼由三字母組成: 野生型:CAT CAT CAT CAT CAT rII 插入A:CAT ACA TCA TCA TCA T 不正確 rIIrII 缺失A: CAT ACA TCT CAT CAT 正確結(jié)論 在抑制性基因型中只有少數(shù)密碼子錯誤,大部分可恢復(fù)原來野生型的密碼子,從而產(chǎn)生近乎正常的酶。因此具有類似野生型表型。這與Crick發(fā)現(xiàn)的抑制基因突變體表型回恢的遺傳事實相符。2符號突變 如果將FCO突變的插入定為“+”,那么抑制基因突變就可自動地定為“”,一個突變與它的抑制因子的符號相反,實驗證明:一個“+”不能抑制一個“+
16、”,一個“”也不能抑制一個“”,相同符號的兩個突變永遠不會相互抑制。 Crick用巧妙的遺傳學實驗提供了三聯(lián)體密碼學說的第一個證據(jù):*構(gòu)成“+”或“”的三重突變組合共同作用可以恢復(fù)到野生型表型,這一發(fā)現(xiàn)說明:遺傳密碼的單詞是由三個連續(xù)的核苷酸對組成的?;謴?fù)合適的讀碼進一步圖解 : CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT ACA TAT CAT CAT CAT 正常 * 結(jié)論:只有密碼子是三聯(lián)體才會使一個基因內(nèi)的三個插入或三個缺失自動恢復(fù)正確讀碼,才可以恢復(fù)到野生型表型. Deletions 四、遺傳密碼的兼并性(degeneracy)一個氨基酸具有兩個或多個不同的密碼子
17、稱作密碼的兼并性。如果只有20種三聯(lián)密碼有意義,其余44種為無意義,那么大多數(shù)移碼突變將導致蛋白質(zhì)合成的終止。小結(jié)有關(guān)密碼的基本知識:(1)密碼是非重疊的。(2)密碼子是三聯(lián)體。(3)讀碼從一固定的起始點開始一直連續(xù)不斷地讀至編碼序列的末端,移碼突變會改變序列中其余密碼子的排列。(4)密碼子是兼并的,一個氨基酸不只有一種密碼子。第四節(jié) 遺傳密碼的破譯Cracking the code遺傳密碼的破譯確定每種三聯(lián)體的含義,這是過去近四十年來遺傳學中最重大的突破之一。一、破譯密碼的試驗1制備單一核苷酸的mRNA。Nurenberg(1961)用大腸桿菌蛋白 質(zhì)合成的無細胞系統(tǒng)。 Poly U:苯丙氨
18、酸的多肽(UUU)。 CCC:脯,GGG:甘,AAA:賴。2合成含有兩種和三種不同核苷酸的mRNA,確定了許多氨基酸的密碼子組成,但尚不能確定順序。如將U和G以3:1摻入合成的mRNA,可得以下結(jié)果: 由3/4U和1/4G合成的mRNA中各種密碼子的預(yù)期頻率密碼子機率比例 UUU p(UUU)=(3/4)(3/4)(3/4)=27/64 1.00 UUG p(UUG)=(3/4)(3/4)(1/4)=9/64 0.33 UGU p(UGU)=(3/4)(1/4)(3/4)=9/64 0.33 GUU p(GUU)=(1/4)(3/4)(3/4)=9/64 0.33 UGG p(UGG)=(3/
19、4)(1/4)(1/4)=3/64 0.11 GGU p(GGU)=(1/4)(1/4)(3/4)=3/64 0.11 GUG p(GUG)=(1/4)(3/4)(1/4)=3/64 0.11 GGG p(GGG)=(1/4)91/4)(1/4)=1/64 0.03由3/4U和1/4G組成的mRNA轉(zhuǎn)譯蛋白質(zhì)中各種氨基酸的比例氨基酸比例密碼子組成苯1.00亮0.37UUUG+2U纈 0.36G+2U半胱 0.35G+2U色0.14U+2G甘0.12U+2G 3三聯(lián)體結(jié)合試驗 最終破譯密碼的試驗是三聯(lián)體結(jié)合試驗。1964年Nurenberg設(shè)計。原理:特定Mini mRNA(三聯(lián)體)能與特定的t
20、RNA氨基酸和核糖體組成復(fù)合體,這種復(fù)合體不能通過硝酸纖維濾膜,而未與Mini mRNA結(jié)合的tRNA氨基酸能通過濾膜,從而達到檢定。 例子與步驟:1. 制備Mini mRNA GUU,加到有E.coli核糖體,各種tRNA及20種氨基酸的合成體系中反應(yīng),每次反應(yīng)中只有一種氨基酸(隨意的)是用14C標記的,反應(yīng)系統(tǒng)經(jīng)濾膜過濾后,其中只有與核糖體結(jié)合的GUU和14C標記的相應(yīng)于該密碼子的氨酰tRNA復(fù)合體結(jié)合到膜上,其它未與GUU結(jié)合的tRNAaa都流走,直至找到GUU結(jié)合的標記氨基酸為止。 很快解決了G+2U三種異構(gòu)三聯(lián)體的意義:如:GUU將纈氨酰tRNA纈結(jié)合到核糖體上,因此,GUU為纈氨酸
21、密碼子。同樣可測定UUG為亮氨酸密碼子,UGU為半胱氨酸密碼子。4用三聯(lián)體多聚體作模板體外合成多肽。如用(UUC)。多核苷酸作模板可按三種方式中的任何一種方式讀碼:(1)UUC UUC UUC UUC (2)UCU UCU UCU UCU (3)CUU CUU CUU CUU 在無細胞系統(tǒng)中會得到三種肽鏈,一條是單一苯丙氨酸肽鏈,一條是單一絲氨酸肽鏈,再一條是單一亮氨酸肽鏈,從而縮小了(C+2U)密碼子意義的范圍。再經(jīng)三聯(lián)體結(jié)合試驗可以很快確定UUC為苯丙氨酸密碼子,UCU為絲氨酸密碼子,CUU為亮氨酸密碼子。二、某些氨基酸會有多個密碼子原因主要有二個:1有些氨基酸能被多個不同的tRNA帶到核
22、糖體上,不同的tRNA有不同的反密碼子。2某些tRNA能將特異的aa帶到多種密碼子上,因為堿基的配對在密碼子的3端和反密碼子的5端是不嚴格的,這種松散的配對學說稱擺動學說,反密碼子5位的G能與C和U配對,說明一種tRNA(圖中攜帶絲氨酸)能識別UCU和UCC兩種密碼子。 AG G UCU/C 53mRNA 密碼子3 5 反密碼子環(huán) 密碼子反密碼子配對擺動原則 反密碼子5端 密碼子3 G U orCC G onlyA U onlyU A or GI U,C or A 密碼子反密碼子配對原則三、終止密碼子(Stop Codons)定義:并不編碼任何aa,為肽鏈合成終止的信號。1965年,Brenn
23、er等發(fā)現(xiàn)終止密碼子。將T4噬菌體控制頭部蛋白合成的一個順反子中的6種突變體蛋白的末端與野生型比較,記下每個突變體蛋白末端接下來的那個氨基酸,這6種aa在其密碼子的一個核苷酸位置發(fā)生變化就會形成UAG,因此UAG是一個終止密碼子。野生型 m+Su+ m1Su+(谷酰)CAG m2Su+(賴) AAG m3Su+(谷) GAG m4Su+(酪) UAU UAG m5Su+(色) UGG m6Su+(絲) UCG mSu 多肽長度緊跟突變體蛋白末端接下來的那個氨基酸:UAG終止密碼子稱為琥珀型密碼子(amber codon),由琥珀密碼子造成的突變稱為琥珀型突變(amber mutation),另
24、二個終止密碼子為UGA(乳白型Ocher)。UAA(赭石型ocher)* 終止密碼子也稱無義密碼子(nonsense codons),無義突變是指某一密碼子變?yōu)榻K止密碼子后造成肽鏈合成中斷的突變,而錯義突變(missense mutation)是導致多肽鏈中單個氨基酸的變化,是一種aa的密碼子變?yōu)榱硪籥a的密碼子的突變。四、無義突變抑制基因 * Nonsense Suppressor Mutations是tRNA反密碼子環(huán)上發(fā)生突變的tRNA基因,它能識別mRNA上的一個無義密碼子,因此它能將攜帶的氨基酸在無義密碼子處插入,從而使轉(zhuǎn)譯能順利通過那個無義密碼子,而不致造成肽鏈合成的中止。 酪氨酸
25、反密碼子發(fā)生突變后能識別終止密碼子UAG,UAG的終止作用受到了突變的tRNA抑制后,肽鏈得以繼續(xù)延伸。五、起始密碼子Start CodonAUG為起始密碼子,在mRNA中,通常編碼Met,而在大多數(shù)原核生物中新的多肽的第一個氨基酸一般為NfMet。攜帶NfMet的tRNA能起始一條多肽但不能插入到一條生長的鏈中;攜帶Met的tRNA能插入到生長的肽鏈中,但不能起始一條肽鏈;這二種tRNA具有相同的反密碼子,并與密碼子AUG互補。小結(jié):遺傳信息的貯存、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯在所有的生物中基本上是一致的。 至1966年,全部64種遺傳密碼破譯 第五節(jié) 真核生物RNA在真核生物中,RNA的合成和加工在某
26、些方面不同于原核生物 一、RNA合成 在原核生物中,只用單一的RNA聚合酶合成各種類型的RNA;而在真核系統(tǒng)中,有三種不同的RNA聚合酶:(1)RNA聚合酶1合成tRNA;(2)RNA聚合酶II合成mRNA,mRNA是單順子反子(monocistron),而在原核生物中許多mRNA是多順反子。(polycistron) ;(3)RNA聚合酶III合成tRNA。二、RNA的加工由細胞核產(chǎn)生的初級RNA轉(zhuǎn)錄物在運送到細胞質(zhì)作轉(zhuǎn)譯之前通常要以多種方式進行加工:1在轉(zhuǎn)錄物的5端通過三磷酸鍵結(jié)合上一個7甲基鳥 苷,即“戴帽”。 2在3端加一串多聚腺苷,即由polyA組成的尾巴 (150200)。 3剪接,除去RNA轉(zhuǎn)錄物的某些內(nèi)部的插入序列 (intervening seguences)。由細胞核產(chǎn)生的初級RNA轉(zhuǎn)錄物在運送到細胞質(zhì)作轉(zhuǎn)譯之前通常要以多種方式進行加工 12-9三、斷裂基因 (Split Genes) 1DNA分子上編碼蛋白區(qū)被一些間隔序列分開,這些間隔序列稱為內(nèi)含子(intron)。Those DNA sequences tha
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