農(nóng)藥登記毒理學(xué)急性吸入毒性試驗

1、農(nóng)藥登記毒理學(xué)急性吸入毒性試驗1范圍GB/T 15670的本部分規(guī)定了急性吸入毒性試驗的基本原則、方法和要求。 本部分適用于為農(nóng)藥登記而進行的急性吸入毒性試驗。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 14925實驗動物環(huán)境及設(shè)施農(nóng)藥登記資料規(guī)定中華人民共和國農(nóng)業(yè)部令第10號（2007年12月8日）3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1急性吸入毒性 acute inhalation toxicity實驗動物在短時間內(nèi)（指24 h或24 h之內(nèi)，通常采

2、用4 h）一次連續(xù)吸入較高濃度的受試物（氣體、 蒸汽、氣溶膠或顆粒狀物）出現(xiàn)的健康損害效應(yīng)。3.2吸入劑量inhaled dose動物單位體重所吸入受試物的量，即：（1）D二叫a（1）式中：Dih一吸入劑量，單位為毫克每千克（mg/kg）；c吸入氣中受試物的濃度，單位為毫克每升（mg/L）；t吸入持續(xù)時間，單位為分（min）；R呼吸頻率，單位為次每分（次/min）；Tv受試動物的潮氣量，單位為升每次（L/次）；a一與受試物反應(yīng)性和溶解性相關(guān)的保持系數(shù)；W一體重，單位為千克（kg）。3.3半數(shù)致死濃度 median lethal concentration（LC50）在規(guī)定的時間內(nèi)，經(jīng)呼吸道一次

3、連續(xù)吸入受試物后，引起實驗動物總體中半數(shù)死亡的毒物的統(tǒng)計學(xué) 濃度，以單位體積空氣中受試物的質(zhì)量（mg/m3）來表示。3.4劑量-反應(yīng)關(guān)系 dose-response relationship劑量與特定效應(yīng)的發(fā)生率間的關(guān)系。3.5空氣動力學(xué)直徑 aerodynamic equivalent diameter, AD將不同形狀和密度的氣溶膠顆粒與不同直徑的標(biāo)準(zhǔn)單位密度（1.0 g/cm3）球形顆粒相對比，當(dāng)它們 的終端沉降速度相同時，就以該標(biāo)準(zhǔn)球形顆粒的直徑表示此氣溶膠顆粒的直徑，并稱之為該氣溶膠顆粒 的空氣動力學(xué)直徑，其計量單位為微米3m）。3.6質(zhì)量中值空氣動力學(xué)直徑 mass median

4、aerodynamic diameter, MMAD由空氣動力學(xué)直徑大小不一的顆粒組成的氣溶膠樣品中，小于和等于某一空氣動力學(xué)直徑（例如5 |im）的顆粒占氣溶膠樣品總質(zhì)量或總重量50%時，則該氣溶膠顆粒空氣動力學(xué)直徑即為此氣溶膠樣品 的質(zhì)量中值空氣動力學(xué)直徑（5 gm）o3.7幾何標(biāo)準(zhǔn)差 geometric standard deviation, GSD用以描述氣溶膠顆粒粒徑范圍的無量綱數(shù)。幾何標(biāo)準(zhǔn)差越小，含相似大小的顆粒比例越高，亦即氣 溶膠顆粒的均一性越好，離散度越低。通常，將幾何標(biāo)準(zhǔn)差小于或等于2的氣溶膠樣品稱為單相分散氣 溶膠。3.8可吸入顆粒直徑inhalable diameter

5、能夠通過研究對象的口和/或鼻吸入并沉淀在呼吸道任意部位的顆粒的空氣動力學(xué)直徑。通常將空 氣動力學(xué)直徑在10 |im以下的氣溶膠顆粒物稱為可吸入顆粒物。4試驗?zāi)康耐ㄟ^短時間吸入染毒可初步了解受試物對實驗動物的急性毒性特征和劑量-反應(yīng)關(guān)系，為急性吸入 毒性分級、標(biāo)簽管理和其他有關(guān)的毒理學(xué)研究提供科學(xué)的參考資料，也能夠為制定生產(chǎn)和應(yīng)用過程中的 防護措施提供依據(jù)。5試驗概述根據(jù)受試物的理化性質(zhì)，選擇適宜的方法，將其制備成特定濃度的氣態(tài)、蒸汽態(tài)、氣溶膠態(tài)或者顆 粒狀物混懸態(tài)，輸入至動式染毒系統(tǒng)；將實驗動物隨機分成對照及不同染毒劑量組，分別放置于染毒系 統(tǒng)中進行4 h的暴露，染毒結(jié)束后將實驗動物移出；仔細

6、觀察染毒期間及14 d內(nèi)的毒性作用表現(xiàn)和體征、 死亡等情況，死亡動物應(yīng)及時進行大體解剖；觀察期終了時，處死動物做大體解剖，如發(fā)現(xiàn)病變組織或 器官應(yīng)進行組織病理學(xué)檢查。6試驗方法試驗準(zhǔn)備受試物受試物應(yīng)采用制備工藝穩(wěn)定、符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的樣品，注明名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、 保存條件及配制方法等，并附有檢驗報告。所用賦形劑、溶劑或其他介質(zhì)等均應(yīng)標(biāo)明批號、規(guī)格和生產(chǎn) 廠家。受試物氣化或氣溶膠制備方法選擇與準(zhǔn)備氣態(tài)受試物經(jīng)流量計與空氣混合成一定濃度之后，直接輸入染毒柜。沸點較低易揮發(fā)的液態(tài)受試物通過空氣鼓泡或適當(dāng)加熱促使其揮發(fā)后，再與空氣混合，通入染毒柜中。高沸點不易揮發(fā)液態(tài)受試物根據(jù)受試物的

7、理化特性，可以選取噴霧方法，或者利用氣溶膠發(fā)生裝置，制備符合試驗要求的液態(tài) 氣溶膠再與一定量的空氣混合輸入至染毒柜中。粉狀或固體受試物利用氣溶膠發(fā)生裝置，將受試物制備成固體氣溶膠，再與一定量的空氣混合，通入染毒柜中。動式吸入染毒方法采用機械通風(fēng)裝置，連續(xù)不斷地將含有一定濃度受試物的空氣均勻地送入染毒柜，換氣量大約為12 次/h15次/h,維持相對穩(wěn)定的染毒濃度。采用全身暴露或頭/鼻部暴露方式對動物進行持續(xù)4 h的急性 吸入性染毒。染毒時，染毒柜內(nèi)染毒氣體的分配保持均衡，氧含量不低于9%, CO2含量不高于1%，溫 度在（223）,相對濕度30%70% （特殊情況，如蒸汽態(tài)染毒除外）。如果采用動

8、物全身暴露的染 毒方式，為確保染毒柜內(nèi)空氣穩(wěn)定，應(yīng)當(dāng)注意使實驗動物的總體積不超過染毒柜體積的5%。染毒柜內(nèi) 應(yīng)維持微弱的負(fù)壓，以防受試物泄漏污染周圍環(huán)境。同時，應(yīng)注意防止受試物爆炸。染毒系統(tǒng)可靠性的確定吸入毒性試驗中，應(yīng)產(chǎn)生穩(wěn)定濃度的氣態(tài)、蒸汽態(tài)或氣溶膠狀態(tài)的受試物。其濃度應(yīng)通過間斷（至 少每30 min采樣一次）或連續(xù)采樣，并通過適當(dāng)?shù)姆治鰞x器，采用可靠的檢測方法進行監(jiān)控。對于以氣溶膠染毒方式進行的吸入毒性試驗，除了分析染毒柜中的濃度之外，還應(yīng)測定氣溶膠顆粒 的大小及其分散度。在對染毒柜濃度進行的動態(tài)檢測過程中，如果連續(xù)兩次測定的結(jié)果能夠證明染毒柜內(nèi)受試物的濃度 相對恒定，液態(tài)或氣態(tài)農(nóng)藥及其

9、制劑在設(shè)定吸入濃度的10%,固態(tài)或干粉制劑制備的氣溶膠在擬采用 吸入濃度20%的范圍之內(nèi)波動，則認(rèn)為染毒系統(tǒng)對濃度的平衡和控制是成功的。否則，需要繼續(xù)進行 調(diào)試。如果是固態(tài)或干粉制劑制備的氣溶膠，還需對其粒徑進行連續(xù)測定和監(jiān)控。通常要求所制備氣溶 膠的MMAD值在1 gm4 gm范圍內(nèi)，且應(yīng)達到連續(xù)兩次測定的MMAD值的波動范圍在10%之內(nèi)，GSD 在1.53.0之間。實驗動物的準(zhǔn)備實驗動物首選健康8周10周大鼠，體重差異不得超過同性別平均體重的20%。選用其他動物需說明適當(dāng)?shù)?理由。應(yīng)使用具有質(zhì)量合格證的實驗動物。飼養(yǎng)條件正式試驗之前，動物應(yīng)在試驗環(huán)境中檢疫、適應(yīng)3 d5 d時間。實驗動物飼

10、養(yǎng)條件應(yīng)符合GB 14925的有關(guān)規(guī)定。每個濃度組的動物按性別分籠飼養(yǎng)，每籠動物數(shù) 量以不干擾動物個體活動及觀察反應(yīng)為度。動物食用常規(guī)飼料，自由飲水。數(shù)量和性別每個濃度組至少10只動物，雌雄各5只。雌性動物應(yīng)為未妊娠和未經(jīng)產(chǎn)的。吸入劑量與分組至少應(yīng)設(shè)置3個不同濃度的染毒組，組間濃度距離適當(dāng)，以便能夠在各濃度組的實驗動物中發(fā)生一 定程度的毒效應(yīng)和死亡。同時，設(shè)空白和/或相應(yīng)賦型劑、溶劑或其他介質(zhì)對照組，所得資料應(yīng)足以繪 制出濃度死亡曲線，并求出lc50直。如果受試物的毒性很低，也可以采用20只大鼠（雌、雄各半），進行單一劑量的急性吸入毒性試驗。 單一急性吸入染毒濃度應(yīng)為體積分?jǐn)?shù)2X10-2（氣體

11、受試物）、20 mg/L （液體受試物蒸汽）、5 mg/L （固 體或液體受試物氣溶膠），如果因受試物理化性質(zhì)所限，不能達到該濃度要求，也應(yīng)以受試物所能達到 的最高濃度進行試驗。受試物具有爆炸性時，應(yīng)注意避免采用可能造成爆炸的濃度。試驗步驟吸入染毒的實施染毒濃度的平衡與控制采用試驗準(zhǔn)備階段的各種適宜條件，對染毒濃度、可吸入顆粒直徑等進行控制。染毒動物的體重測定與染毒期間的觀察試驗開始前，應(yīng)對每只動物的體重進行稱量。動物持續(xù)吸入受試物的時間為4 h,染毒過程當(dāng)中，動物通常處于禁食和禁水狀態(tài)。吸入染毒期間，應(yīng)注意觀察受試物對呼吸系統(tǒng)的影響，如呼吸道刺激反應(yīng)，呼吸節(jié)律的變化，以及 吸氣和呼氣模式的改

12、變等。試驗觀察和檢查觀察期限吸入染毒結(jié)束之后，實驗動物每天至少仔細觀察1次，連續(xù)14 d。但觀察期也不是固定不變，可依 據(jù)毒性反應(yīng)和體征的發(fā)生時間，以及恢復(fù)期的長短進行調(diào)整。如果染毒后動物出現(xiàn)中毒反應(yīng)、死亡時間 延遲，觀察期限應(yīng)適當(dāng)延長，最長不超過21 do觀察內(nèi)容詳細觀察并記錄染毒動物的臨床表現(xiàn)和體征，包括出現(xiàn)時間及其恢復(fù)時間、動物死亡時間等。觀察 的內(nèi)容包括：a）中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)肌肉系統(tǒng)：體位異常、叫聲異常、不安、呆滯、震顫、抽搐、麻痹、運動 失調(diào)、對外反應(yīng)過敏或遲鈍，異常行為如過度反復(fù)抓撓口周、梳理、轉(zhuǎn)圈，甚至自殘、倒退行 走等；b）植物神經(jīng)系統(tǒng)：瞳孔擴大或縮小、流涎或流淚；c）呼吸系

13、統(tǒng)：鼻孔流液、鼻衄、鼻翼扇動、呼吸深緩、呼吸過速、蜂腰；d）泌尿生殖系統(tǒng)：會陰部污穢、有分泌物、陰道腫脹；e）皮膚和被毛：皮膚充血、紫紺、被毛蓬松或潮濕、污穢；f）眼：眼球突出、結(jié)膜充血、溢血性分泌物、角膜混濁；g）消化系統(tǒng)：腹瀉、厭食。記錄中毒體征的出現(xiàn)和消失時間以及動物死亡時間，特別是有死亡延遲趨勢時，更應(yīng)認(rèn)真觀察和記 錄。衰弱或瀕死動物應(yīng)迅速隔離，人道處死并解剖檢查，按中毒死亡處理。觀察期間如果發(fā)現(xiàn)動物死亡 應(yīng)及時解剖，如不能立即檢查，應(yīng)冷藏保存，并在24 h內(nèi)進行解剖檢查。體重稱量應(yīng)分別在染毒前、染毒后（至少每周一次）和動物處死之前稱量并詳細記錄體重。病理學(xué)檢查所有的實驗動物均應(yīng)進行大

14、體解剖，包括試驗過程中死亡的動物以及試驗結(jié)束時仍存活的動物。應(yīng) 特別注意呼吸系統(tǒng)的任何改變，對于任何組織器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時，均應(yīng)記錄并進行組 織病理學(xué)檢查。其他指標(biāo)檢查必要時，根據(jù)受試物的性質(zhì)及所觀察的毒性反應(yīng)，宜增加其他敏感指標(biāo)的檢查。7試驗結(jié)果和評價試驗結(jié)果試驗結(jié)果應(yīng)包括以下內(nèi)容：a）用表格列出試驗中獲得的各染毒組及對照組兩種性別動物的全部原始數(shù)據(jù)，具體內(nèi)容包括動物 編號、性別、染毒劑量、體重、各種體征及程度、死亡或存活情況、大體解剖及組織病理學(xué)檢 查結(jié)果；b）分別統(tǒng)計各組及不同性別動物的數(shù)目，體征發(fā)生、死亡、存活、大體解剖及組織病理學(xué)檢查的 各類病變發(fā)生的頻數(shù);計算不同組、

15、不同性別動物上述各項的發(fā)生率及不同時間的體重平均值；c）空氣中受試物濃度、粒徑、分散度等的測定結(jié)果；d）染毒空氣的溫度、相對濕度檢測結(jié)果；e）用適宜的統(tǒng)計學(xué)方法對上述數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析；f）可能的情況下，計算出劑量-效應(yīng)或劑量-反應(yīng)關(guān)系；g）計算吸入染毒的lc50值。試驗結(jié)果的評價根據(jù)各種反應(yīng)在不同劑量下出現(xiàn)的時間、發(fā)生率、劑量-反應(yīng)關(guān)系、不同種屬動物及實驗室的歷史 背景數(shù)據(jù)、組織病理學(xué)檢查的結(jié)果以及同類受試物的毒理學(xué)資料等，對受試物經(jīng)呼吸道吸入染毒的毒理 學(xué)作用特點做出初步評價；根據(jù)毒性可能涉及的部位，綜合大體解剖和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果，初步判 斷毒性作用靶器官；如果能夠得出比較明確的劑量-

16、效應(yīng)、劑量-反應(yīng)曲線，可以對受試物經(jīng)呼吸道吸入 染毒作用的閾值做出初步評價；求出lc50值，對受試物的急性吸入毒性級別做出評價，急性吸入毒性級 別按照農(nóng)藥登記資料規(guī)定3.3.2.8條的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)判定；總結(jié)受試物的安全范圍、出現(xiàn)毒性的嚴(yán)重程度 及可恢復(fù)性。急性吸入毒性試驗的結(jié)果可為相關(guān)的后續(xù)毒理學(xué)試驗劑量的選擇提供參考，也可提示一些后續(xù)毒性 試驗需要重點觀察的指標(biāo)。在參考或引用這些試驗結(jié)果時，應(yīng)注意各種數(shù)據(jù)和資料之間的有機聯(lián)系。 lc50值應(yīng)當(dāng)被看作一個相對粗糙的毒理學(xué)指標(biāo)，主要用于標(biāo)識某一受試物吸入毒性效能及作為對其進行 毒性分級的依據(jù)，在引用或參考lc50值時，除了應(yīng)結(jié)合受試物的毒性效應(yīng)、組織

17、病理學(xué)檢查等結(jié)果之外， 還應(yīng)始終注意動物的種屬、染毒時間的長短和計算lc50的方法等具體問題。8試驗報告試驗報告至少應(yīng)包括以下內(nèi)容：a）試驗名稱、試驗單位名稱和聯(lián)系方式、報告編號；b）試驗委托單位名稱和聯(lián)系方式、樣品受理日期和封樣情況；c）試驗開始和結(jié)束日期、試驗項目負(fù)責(zé)人、試驗單位技術(shù)負(fù)責(zé)人、簽發(fā)日期；d）試驗摘要；e）受試物名稱、有效成分美國化學(xué)文摘登錄號（CAS號）（如已知）、代碼（如有）、純度（或 含量）、劑型、生產(chǎn)日期（批號）、理化性質(zhì)、配制所用溶劑和方法；f）實驗動物種屬、品系、級別、數(shù)量、體重、性別、來源（供應(yīng)商名稱、實驗動物質(zhì)量合格證號、 實驗動物生產(chǎn)許可證號），檢疫、適應(yīng)情況，實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括溫度、相對濕度、飼料、 單籠飼養(yǎng)或群飼