改進(jìn)的18Ｏ同位素標(biāo)記法標(biāo)記蛋白質(zhì)多肽

1、改良的18同位素標(biāo)記法標(biāo)記蛋白質(zhì)多肽【摘要】針對18同位素標(biāo)記反響兩個(gè)重要影響因素肽段分散度和胰酶滅活方法，進(jìn)展了標(biāo)記條件的改良和滅活方法的優(yōu)化。在h218中參加rapigesttsf助溶劑并微波輔助加熱，使-酪蛋白胰酶酶切肽段的標(biāo)記效率得到明顯改良18/16峰面積比值99%。標(biāo)記后，對胰酶進(jìn)展復(fù)原烷基化化學(xué)修飾徹底滅活，使標(biāo)記后的肽段穩(wěn)定性顯著進(jìn)步，放置6d不發(fā)生回交反響。對標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)甲狀腺球蛋白酶切肽段混合物標(biāo)記后的質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：優(yōu)化的標(biāo)記方法能快速穩(wěn)定地標(biāo)記蛋白質(zhì)酶切多肽?！娟P(guān)鍵詞】18同位素標(biāo)記；多肽；蛋白質(zhì)組peptidelabelingithiprved18inrpratine

2、thdzhayan，luzhuang，jiaei，yingan-a，qianxia-hng*(statekeylabfprteis，beijingprteeresearhenter，beijing102206(beijinginstitutefradiatinediine，beijing100850)abstratinrdertptiizethe18labelingethd，tkeyaspets，peptidedispersinandtrypsindeativatineredisussed。theadditinfrapigesttsfinh218andiraveheatingenhanedla

3、belingeffiienyf-aseindigestedpeptides(18/16rati99%).heialdifiatinithtris(2-arbxyethyl)phsphine(tep)andidaetaide(iaa)resultedintrypsindeativatedpletely.nsignifiantbak-exhangefr18t16asbservedafterlabelingin6days.theexperientresultithpeptideixturefrshedthattheiprvedethduldbeeffetivelyusedtlabelprteinan

4、dpeptide.keyrds18stableistpelabeling；peptide；prtee1引言定量蛋白質(zhì)組學(xué)通過批量觀察正常與疾病細(xì)胞或組織在蛋白質(zhì)表達(dá)譜上的差異，從整體程度上規(guī)?；暨x和開掘與疾病相關(guān)的蛋白，為致病機(jī)理研究和臨床應(yīng)用提供重要參考信息。18同位素標(biāo)記技術(shù)是定量蛋白質(zhì)組的一種常用技術(shù)15。蛋白質(zhì)酶切后的肽段，在胰蛋白酶的催化下，-末端的兩個(gè)16原子被交換成18原子，從而使質(zhì)譜檢測產(chǎn)生4da的質(zhì)量差異。通過比擬標(biāo)記肽段和未標(biāo)記肽段的峰面積強(qiáng)度，得到一對蛋白樣本的相對定量關(guān)系。盡管該標(biāo)記反響具有條件溫和，標(biāo)記前后肽段的理化性質(zhì)不發(fā)生改變，能和肽段的其它別離分析方法兼容等優(yōu)

5、點(diǎn)，但卻由于反響條件極難控制，反響后標(biāo)記產(chǎn)物不穩(wěn)定而影響其在實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用。本研究基于18同位素的標(biāo)記原理，討論了肽段分散度和胰酶滅活兩個(gè)重要因素對標(biāo)記的影響，并據(jù)此對方法進(jìn)展了優(yōu)化。相比文獻(xiàn)6采用的水浴孵育標(biāo)記和沸水加熱滅活技術(shù)，本方法標(biāo)記時(shí)間短，標(biāo)記效率強(qiáng)，抑制回交反響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，即便對于復(fù)雜的多肽混合物體系，采用本方法也能獲得高效的標(biāo)記結(jié)果18/16峰面積比值99%。2實(shí)驗(yàn)局部2.1儀器與試劑4800基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀aldi-tf-tfs，美國appliedbisystes公司。-氰基4-羥基肉桂酸(ha)、甲狀腺球蛋白、-酪蛋白美國siga公司)；測序級胰蛋

6、白酶(美國prega公司)；97%h218(上?；ぱ芯克?；三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽tep，siga公司；碘乙酰胺(iaa，美國nejersey公司)；乙腈(j.t.bake公司)；三氟乙酸(tfa，ars公司)；rapigesttsf美國aters公司。其它試劑為國產(chǎn)分析純。2.2蛋白酶切牛甲狀腺球蛋白和-酪蛋白蛋白用20l/lnh4h3溶解后，參加rapigesttsf終濃度0.1%和tep終濃度5l/l，在56復(fù)原1h，再參加iaa終濃度25l/l，放置暗處復(fù)原1h。參加胰酶-底物150，/的trypsin酶切過夜。2.3蛋白標(biāo)記和胰酶的滅活將酶切后的肽段溶液冷凍枯燥后直接參加h21

7、8重溶，混勻后放入微波中反響10in。參加tep終濃度100l/l滅活，37水浴孵育1h后，微波反響10in。再參加iaa終濃度100l/l，于暗處放置1h。2.4質(zhì)譜分析基質(zhì)采用ha。儀器控制軟件為4800explrersftare，數(shù)據(jù)處理軟件為gpsexplrersftare2.0。一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集使用s-1kv反射形式，加速電壓20kv，掃描范圍/z7003500，激光能量4500，每張譜圖累加1500次。馬心肌紅蛋白胰酶酶切肽段作為標(biāo)準(zhǔn)物對儀器進(jìn)展外標(biāo)校正，校準(zhǔn)至誤差0.1da，相對標(biāo)準(zhǔn)偏向10。3結(jié)果與討論3.1增強(qiáng)蛋白質(zhì)酶切肽段的標(biāo)記效率蛋白質(zhì)酶切肽段18標(biāo)記方法的原理是基于胰蛋

8、白酶催化產(chǎn)生的兩次酶-肽段復(fù)合物水解反響。該反響是快速的動(dòng)態(tài)可逆反響。因此，經(jīng)常發(fā)生標(biāo)記效率不完全和標(biāo)記肽段發(fā)生回交的情況，有效地控制標(biāo)記和回交抑制這兩個(gè)環(huán)節(jié)是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵7，。本實(shí)驗(yàn)通過改善肽段在反響體系中的分散程度和輔助加熱，增加反響效率來有效地進(jìn)步標(biāo)記效率。肽段在體系中的分散程度增高后，有利于肽段端的完全暴露，增加與胰酶和h218的接觸時(shí)機(jī)。因此，改善肽段分散程度，能推進(jìn)標(biāo)記向正反響方向進(jìn)展。在實(shí)驗(yàn)中，參加rapigesttsf助溶劑，能增強(qiáng)蛋白質(zhì)及多肽的溶解性，進(jìn)步分散程度，有利于h218進(jìn)展末端羧基的交換反響。在-酪蛋白酶切肽段18標(biāo)記產(chǎn)物質(zhì)譜分析結(jié)果中，因?yàn)閰⒓觬apigestt

9、sf助溶劑，/z1660，1267和2316的肽段的標(biāo)記效率明顯進(jìn)步圖1a和圖1d。而未參加助溶劑組的3個(gè)肽段那么標(biāo)記不完全，仍然存在大量未標(biāo)記的16肽段圖1。圖1-酪蛋白酶切肽段18標(biāo)記前后aldi-tf-tf-s質(zhì)譜圖略fig.1aldi-tf-tf-sspetruftryptidigestedpeptidesf-aseina.未標(biāo)記的-asein酶切肽段質(zhì)譜圖(spetrufunlabeledpeptideixture)；b./z1267，1660和2316的肽段標(biāo)記前質(zhì)譜圖(spetrufunlabeledpeptidesith/zf1267，1660and2316)；./z1267，

10、1660和2316的肽段未加rapigesttsf，孵育過夜標(biāo)記后的質(zhì)譜圖(spetruflabeledpeptidesith/zf1267，1660and2316ithutrapigesttsf，at37fr24h)；d./z1267，1660和2316的肽段參加rapigesttsf，孵育過夜標(biāo)記后的質(zhì)譜圖(spetruflabeledpeptidesith/zf1267，1660and2316ithrapigesttsf，at37fr24h)；e.質(zhì)荷比為1267，1660和2316的肽段參加rapigesttsf，微波加熱10in標(biāo)記的質(zhì)譜圖(spetruflabeledpeptide

11、sith/zf1267,1660and2316ithrapigesttsfandiraveheatingfr10in)。常規(guī)方法中，18標(biāo)記需要在37水浴中孵育24h,以到達(dá)充分反響的目的。但即便如此，溫和的反響條件和較長的反響時(shí)間也難以保證標(biāo)記完全。蛋白質(zhì)酶切加上標(biāo)記所消耗的時(shí)間超過36h，滯后了實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程。并且由于長時(shí)間置于水浴環(huán)境，容易因?yàn)槊芊獠粐?yán)等情況引入h216，從而導(dǎo)致標(biāo)記不完全。本實(shí)驗(yàn)采用微波加熱的方式，不僅隔絕了潮濕的環(huán)境，而且只需要10in即可標(biāo)記完全。質(zhì)譜結(jié)果見圖1d和圖1e。與傳統(tǒng)的水浴加熱方法相比，由于微波使肽段的受熱更為快速和均勻，因此能在很短時(shí)間內(nèi)到達(dá)理想的標(biāo)記效果

12、。3.2標(biāo)記肽段回交的抑制18標(biāo)記反響的另一個(gè)常見問題是標(biāo)記肽段容易發(fā)生回交。由于該標(biāo)記反響是一種可逆反響，因此假如將18標(biāo)記完全的肽段溶于h216中，仍能使18標(biāo)記肽段回復(fù)到16標(biāo)記狀態(tài)。胰酶是造成回交的主要因素，目前文獻(xiàn)報(bào)道抑制回交的方法有酸中止法、超濾胰酶法和微波胰酶滅活法，都不能完全抑制胰酶的活性，置于h216中仍能發(fā)生一定程度的回交7。本研究采用化學(xué)滅活法，通過高濃度的復(fù)原試劑和烷基化試劑，對溶液中殘留的胰酶徹底滅活。如圖2所示，胰酶滅活后，18標(biāo)記肽段在液相色譜流動(dòng)相2%乙腈-98%水-0.5%甲酸中保存6d仍沒有觀察到明顯的回交產(chǎn)物，穩(wěn)定的標(biāo)記肽段能在液相色譜中進(jìn)展后續(xù)別離分析。

13、圖218標(biāo)記后的-酪蛋白酶切肽段在2%乙腈-98%水-含0.5%甲酸溶液中穩(wěn)定性考察略fig.2stabilityflabeled-aseinpeptidesin2%an-98%ater-0.5%friaid(fa)slutina-酪蛋白酶切肽段標(biāo)記后aldi-tf-tf質(zhì)譜圖(aldi-tf-tf-sspetruflabeled-asein)；-asein酶切肽段/z1267，1660和2316標(biāo)記后的aldi-tf-tf質(zhì)譜圖(afterlabelingaldi-tf-tf-sspetruflabeled-aseinpeptides/z1267，1660and2316):b.0d；.1d；

14、d.3d；e.6d。3.3復(fù)雜肽段混合物標(biāo)記結(jié)果牛甲狀腺蛋白分子量為660kda。酶切后aldi-tf-tf質(zhì)譜能檢測到其中24條肽段。將優(yōu)化后的方法用于該蛋白質(zhì)酶切肽段的標(biāo)記，以考察方法在復(fù)雜肽段混合物中應(yīng)用的有效性和耐受性。結(jié)果如圖3所示，本方法對于復(fù)雜肽段混合物仍能產(chǎn)生令人滿意的標(biāo)記效率。圖3牛甲狀腺球蛋白酶切肽段18標(biāo)記效率圖標(biāo)記效率計(jì)算用18標(biāo)記肽段的單同位素質(zhì)譜峰面積與16肽段的單同位素峰面積比值略fig.3labelingeffiienyfthyrglbinpeptidesith18(18inrpratineffiienyasalulatedby18/16ratifthefirs

15、tistpipeakarea)小結(jié)18標(biāo)記反響是定量蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的同位素標(biāo)記方法之一。但由于該反響是一種動(dòng)態(tài)可逆反響，18交換受到多種因素影響，標(biāo)記效率和抑制回交一直是實(shí)驗(yàn)過程中的棘手問題，目前仍不能穩(wěn)定地在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用9，。本研究在標(biāo)記和抑制回交兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)上對18標(biāo)記方法進(jìn)展了優(yōu)化。通過增強(qiáng)肽段的分散度，改變輔助加熱方式，結(jié)合化學(xué)方法徹底滅活胰酶，阻斷回交反響的發(fā)生，減少了標(biāo)記時(shí)間，標(biāo)記效率顯著進(jìn)步，增強(qiáng)了標(biāo)記產(chǎn)物的耐用性，滿足差異蛋白質(zhì)組分析的需要?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1hingse，pauldv，stuartgd，erir.prteis，2022，8:164516602jins，peterg，nathane，atherinef.jprteeres.,2022，6:460146073atherinesl，yuq，rihardb，illiajg，laurenehp.l.ellprteis，2022，6:9539624suisha-hui(隋少卉)，angjing-lan(王京蘭)，jiaei(賈偉)，luzhuang(盧莊)，liujin-feng(劉金鳳)，sngli-na(宋麗娜)，aiyun(蔡耘)，qiaxia-hng(錢小紅).hinesej.anal.he.(分析化學(xué))，2022，36(8):1017102