大腸桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化與發(fā)酵罐操作

1、關(guān)于大腸桿菌培養(yǎng)基的優(yōu)化及發(fā)酵罐操作第1頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三目錄大腸桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基配置培養(yǎng)方式培養(yǎng)條件操作流程具體步驟參數(shù)控制注意事項第2頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三大腸桿菌 大腸桿菌是基因工程中常用的宿主菌,許多有價值的多肽和蛋白在大腸桿菌中已成功地進(jìn)行了表達(dá),表達(dá)水平有些高達(dá)細(xì)胞總蛋白的30%以上. 大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主,由于具有遺傳背景清楚,目的基因表達(dá)水平高,技術(shù)操作、培養(yǎng)條件簡單,抗污染能力強(qiáng),大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),倍受遺傳工程專家重視,是目前應(yīng)用最廣泛,最成功的表達(dá)體系.第3頁，共32頁，20

2、22年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三高密度培養(yǎng)技術(shù) 高密度培養(yǎng)技術(shù)：是應(yīng)用一定的培養(yǎng)技術(shù)和設(shè)備來提高菌體生物量和目標(biāo)產(chǎn)物時空產(chǎn)率的發(fā)酵技術(shù)。 第4頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三 利用一般的發(fā)酵工藝生產(chǎn)大腸桿菌或以其組建的基因工程菌的表達(dá)產(chǎn)物,大腸桿菌的生物量,表達(dá)產(chǎn)物在菌體內(nèi)和發(fā)酵液中的濃度比較低,難以獲得理想的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益。應(yīng)用高密度發(fā)酵不但可獲得較高的生物量,而且可顯著提高目的基因表達(dá)產(chǎn)物的濃度。高密度發(fā)酵對發(fā)酵設(shè)備有較高的要求,而且對發(fā)酵條件也有非常高的要求。影響高密度發(fā)酵的因素非常多,如細(xì)菌生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)、發(fā)酵過程中生長抑制物的積累、溶氧濃度、培養(yǎng)

3、溫度、發(fā)酵液的pH 值、補(bǔ)料方式及發(fā)酵液流變學(xué)特性等。第5頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三 大腸桿菌高密度培養(yǎng)最關(guān)鍵的問題是代謝副產(chǎn)物乙酸積累所引起的抑制和毒害作用。 預(yù)防措施： 1、通過控制比生長速率來減少乙酸的產(chǎn)生：比生長速率越高，乙酸產(chǎn)生越多，當(dāng)比生長速率超過某個值時，乙酸開始產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^降低溫度，調(diào)節(jié)酸堿度，控制補(bǔ)料等方法來降低比生長速率。 2、透析培養(yǎng)：在大腸桿菌的培養(yǎng)過程中可以用透析技術(shù)除去發(fā)酵液中的有害物質(zhì)，降低乙酸含量從而實現(xiàn)重組菌的高密度發(fā)酵和產(chǎn)物的表達(dá)。 3、控制葡萄糖的濃度：葡萄糖是大腸桿菌發(fā)酵過程中重要的碳源之一，用其作碳源是要將其控制在一個較

4、低的水平上，以減少乙酸的產(chǎn)生。第6頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三培養(yǎng)基選擇 LB培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基) :胰蛋白胨5g,酵母粉2.5g,NaCl5g,溶于500mlH2O,NaOH調(diào)節(jié)pH7.0, 2L三角瓶裝,滅菌鍋濕熱高壓滅菌121, 20min,室溫保存. TB培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基) : 胰蛋白胨240g, 酵母粉480g, 甘油80g, 消泡劑1ml, 溶于H2O, 定容至19L,B. Braun發(fā)酵罐在位滅菌121, 15min.第7頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三培養(yǎng)基配制配制種子固體培養(yǎng)基100mL ， 分裝試管， 0.1MPa 滅菌

5、20min，然后擺成斜面。配制種子培養(yǎng)液600mL，分裝50mL于一個250mL三角瓶中（作一級種子瓶），余下550mL平均分裝于三個500mL三角瓶中（作二級種子用），同上滅菌。第8頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三培養(yǎng)方式 微生物的培養(yǎng)方式主要有分批、連續(xù)和補(bǔ)料分批3種。大腸桿菌發(fā)酵大多采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)，這是在現(xiàn)代發(fā)酵工藝得到優(yōu)化的一種方式，能有效的優(yōu)化微生物培養(yǎng)過程中的化學(xué)環(huán)境。使微生物處于最佳的生長環(huán)境。這種方式一方面可以避免某些營養(yǎng)成分初始濃度過高出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象，另一方面能夠防止限制性營養(yǎng)成分被耗盡而影響細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的形成。補(bǔ)料分批培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于各種各樣

6、的初級、次級生物產(chǎn)品和蛋白等的發(fā)酵生產(chǎn)中。 培養(yǎng)基營養(yǎng)成分過高會抑制細(xì)胞的生長，采用流加補(bǔ)料是提高細(xì)胞濃度和外源蛋白產(chǎn)量的有效方式，高密度培養(yǎng)通過調(diào)節(jié)限制性底物的流加速率來調(diào)控細(xì)胞生長。第9頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三培養(yǎng)條件1、溫度：3638 2、pH： 73、攪拌速率：100200r/min4、溶氧: 2050%5、通風(fēng)：23L/min6、接種量：12%第10頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三操作步驟1、菌種準(zhǔn)備2、上罐前的準(zhǔn)備及實罐滅菌3、發(fā)酵操作4、發(fā)酵管理5、發(fā)酵過程中各生化指標(biāo)的測定 6、補(bǔ)料7、放罐8、清洗第11頁，共32頁，20

7、22年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三菌種準(zhǔn)備1、上罐前兩天，從冰箱中取出菌種轉(zhuǎn)接斜面，37培養(yǎng)24h。2、上罐前一天，由斜面菌種轉(zhuǎn)接一級種子瓶， 37振蕩培養(yǎng)12h，然后轉(zhuǎn)接二級種子瓶， 37振蕩培養(yǎng)10h。第12頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三上罐前的準(zhǔn)備及實罐滅菌1、洗凈發(fā)酵罐及各聯(lián)接膠管2、 配制發(fā)酵培養(yǎng)基5.0L，置發(fā)酵罐內(nèi)，加入幾滴泡敵。3、校正pH電極和溶氧（DO）電極。4、把電極插口、取樣管、補(bǔ)料口、消泡劑料瓶等固定、密封好后，開夾套出、進(jìn)水閥V2、W1，使夾套充滿水，用保護(hù)罩蓋住罐蓋及發(fā)酵罐，用傾倒螺釘鎖緊法蘭，開保護(hù)罩頂部排氣閥V4，啟動蒸氣發(fā)生器，

8、啟動攪拌馬達(dá)，調(diào)轉(zhuǎn)速300r/min，開啟冷凝水出水閥V1，開啟蒸氣閥門S1，進(jìn)行在位滅菌。第13頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三發(fā)酵罐第14頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三上罐前的準(zhǔn)備及實罐滅菌5、當(dāng)保護(hù)罩頂部閥門V4有蒸氣排出時，2min后關(guān)閉閥門，當(dāng)罐溫接近滅菌溫度時，微開閥V4適當(dāng)排氣，并調(diào)整蒸氣閥S1維持罐溫。保溫結(jié)束后，關(guān)蒸氣閥S1，全開冷凝水出水閥V1，開進(jìn)水閥W3，將溫度設(shè)定在37，切入自動。6、當(dāng)溫度降到100以下，緩緩開排氣閥V4，使保護(hù)罩頂壓力表指示為零，移去保護(hù)罩。第15頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星

9、期三上罐前的準(zhǔn)備及實罐滅菌7、連接通氣管路，將進(jìn)氣過濾器K7口與控制臺左側(cè)空氣出口連通，開彈簧夾，接通空氣壓縮機(jī)電源， 對發(fā)酵罐進(jìn)行通氣， 調(diào)整空氣流量3 5L/min。8、當(dāng)溫度達(dá)到37時，將預(yù)先滅菌的pH電極、DO電極（75%酒精消毒、UV消毒）接入發(fā)酵罐，連接各電極導(dǎo)線。第16頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三上罐前的準(zhǔn)備及實罐滅菌9、將流加堿的管線與泵和罐體連接，通過面板操作開關(guān)選擇堿泵，打開手動開關(guān)，使膠管內(nèi)充滿液體，將輸出上限設(shè)在15%，下限設(shè)為“0”，待一切準(zhǔn)備就緒，將“手動”開關(guān)調(diào)節(jié)到“自動”狀態(tài)。10、設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min、空氣流量 23L/m

10、in、pH7.0、DO100%，系統(tǒng)進(jìn)入發(fā)酵狀態(tài)。第17頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三發(fā)酵操作 當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)溫度達(dá)到并維持在所需溫度后，進(jìn)行如下操作：1、取樣：松開彈簧夾J2，用無菌空氣將取樣管殘液壓入發(fā)酵罐內(nèi)，再夾緊J2，將出料管放入接料瓶，松開取樣管彈簧夾J3，發(fā)酵液被壓入接料瓶，開J2、J3排出取樣管內(nèi)殘料，夾緊J2、J3 2、接種：將酒精棉置于接種口槽中，旋松接種口，點(diǎn)燃酒精棉，在火焰保護(hù)下，打開接種口，倒入二級種子，然后旋緊接種蓋，移去火焰圈。接種后立即進(jìn)行第一次取樣，用于測定細(xì)菌OD值。第18頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三發(fā)酵管理控

11、制發(fā)酵過程的各項參數(shù)（溫度、PH、溶解氧、攪拌速度、空氣流量、泡沫水平等），如參數(shù)出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，則應(yīng)及時排除。每小時取一次樣，每次取樣50ml。取樣時先將空氣流量計旋鈕調(diào)至01L/min，松開彈簧夾J2，用無菌空氣將取樣管殘液壓入發(fā)酵罐內(nèi)，再夾緊J2，將出料管放入接料瓶，松開取樣管彈簧夾J3，發(fā)酵液被壓入量筒，當(dāng)達(dá)到40mL，開J2排出取樣管內(nèi)殘料，夾緊J3、J2。將樣液入標(biāo)記有取樣時間的三角瓶，用保鮮膜封口，立即入冰箱冷藏，取完樣要及時清洗量筒。每次取樣前（每隔1小時）記錄發(fā)酵過程溫度、PH值、DO、通風(fēng)、轉(zhuǎn)速的測定數(shù)值，并記錄操作情況。第19頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分

12、，星期三發(fā)酵過程中各生化指標(biāo)的測定 發(fā)酵過程中，雖然能自動控制溫度和pH兩個重要條件，但仍需專人負(fù)責(zé)照看。完成下列工作：（1）經(jīng)常注意發(fā)酵罐運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常，檢查各控制參數(shù)是否在合適的范圍內(nèi)，遇有故障及時排除。（2）每小時取樣測定細(xì)菌光密度值，進(jìn)行革蘭氏染色及鏡檢，以了解菌生長情況及檢查是否有雜菌污染。（3）隨著培養(yǎng)時間的延長，適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)進(jìn)氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，以維持一定的DO值。 第20頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三發(fā)酵過程中各生化指標(biāo)的測定（4）定時取樣用裴林快速定糖法測定培養(yǎng)液中還原糖的含量。測定步驟如下： 發(fā)酵液中糖含量小于 4時，直接取發(fā)酵液 0.5 ml于錐形瓶中，

13、若糖含量大于 4時，先稀釋10倍后，取稀釋液 0.5ml于錐形瓶中。 向錐形瓶加入裴林試劑甲液和乙液各 5ml，混勻，加熱至沸騰。 用0.1標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定至藍(lán)色消失，記錄消耗葡萄糖液的體積數(shù)（V）。 取0.5 ml蒸餾水于錐形瓶中，同法進(jìn)行滴定，記錄消耗葡萄糖的體積數(shù)（V0）。 按下公式進(jìn)行計算：(V0-V)x0.1/0.5x稀釋倍數(shù)V0 為葡萄糖滴定空白時消耗的毫升數(shù)。V為葡萄糖滴定樣品時消耗的毫升數(shù)。 第21頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三發(fā)酵過程中各生化指標(biāo)的測定（5）定時取樣測定發(fā)酵液中氨基氮的含量，測定步驟如下：取發(fā)酵液經(jīng)3500 rmin離心 10min。

14、 分別吸取上清液 2.0 ml于兩個磨口具塞錐形瓶中，各加蒸餾水 5ml。向另一磨口具塞錐形瓶中加入 7 ml蒸餾水，作空白對照。向上述 3個瓶各加中性申醛溶液 5.0 ml，混勻，加 0.5 溴麝香草酚蘭液 2滴和 0.5酚酞液4滴。 用標(biāo)準(zhǔn) 0.100molL NaOH溶液滴定至紫色，分別記錄消耗的NaOH液毫升數(shù)。 按下式計算: (V0-V)x1.4008 V為滴定發(fā)酵液時消耗NaOH溶液的毫升數(shù)。V0 為滴定空白時消耗NaOH溶液的毫升數(shù)。1.4008為 1ml 0.1molLNaOH溶液相當(dāng)?shù)牡量藬?shù)，氨基氮的含量是每毫升中的含量。第22頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3

15、分，星期三發(fā)酵過程中各生化指標(biāo)的測定（6）測定OD值 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取10mL離心管，與105烘2h至恒重，用鑷子夾取入干燥器，待冷卻后于分析天平上稱重（W0），精確到小數(shù)后4位，然后準(zhǔn)確取10mL發(fā)酵液，于3000rpm離心10min，棄去上清液，用蒸餾水洗滌沉淀，同上離心，棄上清液，與100烘至恒重，用鑷子夾取如干燥器中冷卻，于分析天平上稱重（W1），精確至小數(shù)后4位，得細(xì)胞干重為W1-W0。取同一發(fā)酵液，稀釋2、5、10、20、50倍，于600nm下測OD值。以0D值為縱坐標(biāo)，菌液濃度（g/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 均勻取樣品5mL于編號試管中，用空白發(fā)酵液稀釋至一定濃度，

16、在721分光光度計上測定A600，根據(jù)菌體濃度與吸光度之間關(guān)系地標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出菌體濃度。 其余發(fā)酵液于3，2000r/min條件下離心分離8min,上清液裝入編號三角瓶，用于測糖。第23頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三發(fā)酵過程中各生化指標(biāo)的測定（7）當(dāng)發(fā)酵到一定時候，光密度值達(dá)到11.5，發(fā)酵液中還原糖和氨基氮含量較低時，開始補(bǔ)料，并在發(fā)酵結(jié)束前一小時終止。 （8）每小時記錄發(fā)酵過程溫度、pH和DO的測定數(shù)值，并記錄操作情況。第24頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三大腸桿菌流加發(fā)酵策略 大腸桿菌是迄今為止遺傳背景最清楚的菌株，廣泛用于基因工程的研究

17、中。大腸桿菌高密度培養(yǎng)時最關(guān)鍵的問題是如何盡量減少乙酸的產(chǎn)生，因為高濃度葡萄糖或高比生長速率帶來的高濃度乙酸會嚴(yán)重抑制細(xì)胞生長和重組蛋白的生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，即使葡萄糖濃度只有0.250.5 g/L，大腸桿菌仍會產(chǎn)生乙酸。因此，高細(xì)胞密度發(fā)酵所采用的流加策略必須按照一定的算法制定，以保持反應(yīng)器中底物濃度處于較低的水平。營養(yǎng)物最好以它們的消耗速率加入反應(yīng)器中，這樣不僅可以防止底物積累到毒性水平，也不會使細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)。第25頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三補(bǔ)料方式 采用簡單反饋控制補(bǔ)料，又稱單一循環(huán)法，此法控制與營養(yǎng)物利用相偶聯(lián)的pH或溶解氧濃度等參數(shù),使之保持恒定。例如,

18、預(yù)先設(shè)定pH恒定值,發(fā)酵中菌體代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)或銨,使pH值發(fā)生改變,從而啟動控制開關(guān),開始補(bǔ)料,pH恢復(fù)至恒定值以溶解氧濃度作為補(bǔ)料開關(guān)則是根據(jù)培養(yǎng)基中某種關(guān)鍵營養(yǎng)物(主要是碳源)消耗,會導(dǎo)致溶解氧濃度迅速改變。第26頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三溶氧控制的分批補(bǔ)料培養(yǎng)控制的幾個關(guān)鍵參數(shù)如下：1、溫度：培養(yǎng)溫度為37 。2、pH：自動流加30%的氨水，使PH保持 在7.0左右。 3、葡萄糖的流加：根據(jù)發(fā)酵的實際經(jīng)驗，流加補(bǔ)料分三個階段進(jìn)行，發(fā)酵過程中04h不加補(bǔ)料，410h補(bǔ)加含50g葡萄糖的補(bǔ)料，1020h加入含190g葡萄糖的補(bǔ)料，誘導(dǎo)前0.5h追加100ml補(bǔ)料。第27頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三放罐發(fā)酵8小時后，測OD值及還原糖量，當(dāng)發(fā)酵液的PH不斷上升且為堿性、OD值增長緩慢，且還原糖量很低時，可判斷發(fā)酵結(jié)束，準(zhǔn)備放罐。放罐操作同取樣。將全部發(fā)酵液取出后，100煮沸10分鐘滅菌，滅完菌的發(fā)酵液可排放入下水道。第28頁，共32頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)3分，星期三清洗放罐完畢后，打開自來水進(jìn)水口，往發(fā)酵罐中注滿水，同時開動攪拌軸攪動清洗五分鐘，排水。再次注入自來水清洗，操作如1。清洗結(jié)束，關(guān)閉電源。第29頁，共32頁，2