層析技術(shù)的原理和分類

1、層析技術(shù)的原理和分類指導(dǎo)老師：郭祥群NO.030810211層析法是目前廣泛應(yīng)用的一種分離技術(shù)。是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來的技術(shù)。按照不同的標(biāo)準(zhǔn)層析法有不的分類。根據(jù)層析峰的位置及峰高或峰面積,可以定性及定量。層析法與光學(xué)、電學(xué)或電化學(xué)儀器連用，可檢測出層析后各組份的濃度或質(zhì)量，同時繪出層析圖。層析儀與電子計(jì)算機(jī)聯(lián)用，可使操作及數(shù)據(jù)處理自動化，大大縮短分析時間。由于層析法具有分辨率高、靈敏度高、選擇性好、速度快等特點(diǎn)，因此適用于雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生物樣品的分離分析。近年來，已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)常用的分析方法。在醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境化學(xué)、高分子材料、石油化工等方

2、面也得到了廣泛的應(yīng)用。在層析法實(shí)驗(yàn)技術(shù)有凝膠層析法、離子交換層析法、高效液相層析法、親和層析法、聚焦層析法；2（一）聚焦層析法 聚焦層析是一種操作簡單、廉價的層析技術(shù)。它的原理是根據(jù)各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離的過程，因此本方法具有高分辨、高度濃縮和高度專一等特點(diǎn)。聚焦層析所用的凝膠首先用高pH溶液平衡，然后用多元緩沖液進(jìn)行洗脫，多元緩沖液pH呈梯度下降。聚焦層析所用凝膠主要有兩種：MONOP和多元緩沖液交換劑（PBE）。其中MONOP是帶孔小珠，孔中被帶正電荷的胺基填充，適用于高效聚焦層析。多元緩沖液交換劑是一種交換凝膠，適用作普通聚焦層析的介質(zhì)。各種凝膠性質(zhì)見表。 3表聚焦層析技術(shù)數(shù)據(jù)凝

3、膠名稱 pH范圍 洗脫 MONOP 11-8 Pharmalyte 8-10.5PBE 11-8 Pharmalyte 8-10.5MONOP 9-6 多元緩沖液96 PBE 94 7-4多元緩沖液74 PBE94 7-4多元緩沖液74 4NONOP可制成兩種高效液相柱：MONOP HR5/5(1ml)，和MONOP HR5/20(5ml)。使用時根據(jù)樣品復(fù)雜性選擇相應(yīng)的柱。HR5/5分辨率為pI0.2，HR5/20 pI0.02。多元緩沖液交換劑PBE，屬珠狀交換劑凝膠，有PBE 118（pH11-8）和PBE（pH9-4）。在聚焦層析時，通過使用不同的洗脫液，可使交換容量發(fā)生改變，并且使p

4、H達(dá)到更廣的范圍。 5（二）離子交換層析法 離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的一種方法。 離子交換劑預(yù)處理和裝柱 對于離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的顆粒，以保證有較好的均勻度，對于已溶脹好的產(chǎn)品則不必經(jīng)這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀堿處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用“堿-酸-堿”處理，使最終轉(zhuǎn)為-OH-型或鹽型交換劑；對于陽離子交換劑則用“酸-堿-酸”處理，使最終轉(zhuǎn)為-H-型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強(qiáng)度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡

5、。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當(dāng)加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高。柱子裝好后再用起始緩沖液淋洗，直至達(dá)到充分平衡方可使用。6加樣與洗脫 加樣：層析所用的樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強(qiáng)度，所選定的pH值應(yīng)落在交換劑與被結(jié)合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強(qiáng)度應(yīng)低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達(dá)此目的。樣品中的不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達(dá)到滿意的分離效果，上樣量要適當(dāng)，不要超過柱的負(fù)荷能力。柱的負(fù)荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1-5。洗脫：已結(jié)合樣品的離子交換前，可通過改變?nèi)芤旱膒H或改變離子強(qiáng)度的

6、方法將結(jié)合物洗脫，也可同時改變pH與離子強(qiáng)度。為了使復(fù)雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強(qiáng)度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強(qiáng)度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由于這種洗脫pH與離子強(qiáng)度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細(xì)的分離。最好的洗脫方法是連續(xù)梯度洗脫。 洗脫時應(yīng)滿足以下要求：洗脫液體積應(yīng)足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使分離的各峰不致于太擁擠。梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來。梯度不要上升太快，要恰好使移動的區(qū)帶在快到柱末端時達(dá)到解吸狀態(tài)。目的物的過早解吸，會引起區(qū)帶擴(kuò)散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。 7

7、 (三)親和層析法 親和層析是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達(dá)到分離目的的一類特殊層析技術(shù)。具有專一親和力的生物分子對主要有：抗原與抗體、DNA與互補(bǔ)DNA或RNA、酶與它的底物或競爭性抑制劑、激素（或藥物）與它們的受體、維生素和它的特異結(jié)合蛋白、糖蛋白與它相應(yīng)的植物凝集素等?？捎H和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑，當(dāng)含有混合組份的樣品通過此固定相時，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)合，其它沒有親和力的無關(guān)組份就隨流動相流出，然后改變流動組成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來。親和層析中所用的載體稱為基質(zhì)，與基質(zhì)共價連接的化合

8、物稱配基。親和層析純化過程簡單、迅速，且分離效率高。對分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)尤為有效。但本法必須針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此親和層析的應(yīng)用范圍受到了一定的限制。親和層析可用于純化生物大分子：稀溶液的濃縮；不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的貯藏；從純化的分子中除去殘余的污染物；用免疫吸附劑吸附純化對此尚無互補(bǔ)配體的生物大分子；分離核酸是親和層析應(yīng)用的一個重要方面。8應(yīng)用實(shí)例：2-胰凝乳蛋白酶的提純 親和吸附劑（-氨基-N-乙酰-色氨酸）的制備 取一定體積的Sepharose4B加100mgCNBr。攪拌混合物，滴加2-8mol/L NaOH，使溶液pH維持在11.0。20左右，

9、8-12分鐘完成反應(yīng)。在布氏漏斗中抽濾活化的瓊脂糖，然后用20倍體積冷的0.1mol/L NaHCO3（pH9.0）溶液洗滌。將上述活化的Sepharose4B與等體積0.1mol/L NaHCO3（pH9.0并在冰箱中預(yù)冷）溶液混合，接著迅速加入-胰蛋白酶抑制劑（-氨基-N-乙酰-色氨酸甲酯）。抑制劑的最大用量為每毫升Sepharose 4B 65mol/L。4緩慢攪拌約24小時，而后再用水和緩沖液反復(fù)地洗至沒有游離的抑制劑為止。制得的親和吸附劑在50mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.0）中保存?zhèn)溆谩?分離 親和吸附劑裝柱后用50mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液平衡（室溫）。樣品溶于同樣緩沖液中并上柱，再應(yīng)用同樣緩沖液淋洗柱子。流速為30-60ml/小時，直至280nm無光吸收時停止洗滌，然后改用0.2mol/L醋酸緩沖液（pH3.0）洗脫。9 【參考文獻(xiàn)】1.王昌華.曹