植物蛋白酶抑制劑研究進(jìn)展概述

1、植物蛋白酶抑制劑研究進(jìn)展概述摘 要 植物蛋白酶抑制劑主要存在于植物貯藏組織,少量存在于植物葉片，其中大多數(shù)可以抑制絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的活性，少數(shù)可抑制天冬氨酸蛋白酶和羧肽酶的活性！本文概述植物中對(duì)絲氨酸蛋白酶或其他種類蛋白酶有抑制活性的植物蛋白酶抑制劑的分布、活性和主要結(jié)構(gòu)特征諸方面的研究進(jìn)展！ 關(guān)鍵詞植物蛋白酶抑制劑絲氨酸蛋白酶分類家族植物蛋白酶抑制劑(plant protease inhibitor, PI)與 目標(biāo)蛋白酶形成穩(wěn)定復(fù)合物，阻止蛋白質(zhì)底物進(jìn)入酶 活性位點(diǎn)，抑制不同類型蛋白酶的活性,并通過(guò)調(diào)節(jié)蛋 白酶活性調(diào)控植物生理功能。大多數(shù)植物貯藏器官 (如種子和塊莖)含有總蛋白

2、11$%的PI,所以PI也 是構(gòu)成植物蛋白的重要組分1!多數(shù)動(dòng)物進(jìn)食含有蛋 白酶抑制劑的食物可引起生長(zhǎng)抑制，并導(dǎo)致胰腺腫大、 增生,導(dǎo)致食物能量和氮源利用率降低。抑制劑的研 究對(duì)改善和提高植物蛋白食品與飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食 用安全有著重要的意義。根據(jù)所抑制蛋白酶的種類，PI分為四大類：絲氨 酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、天冬氨酸蛋 白酶抑制劑和金屬羧肽酶抑制劑1。根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu) (包括二硫鍵、活性位點(diǎn)數(shù)目和位置)和多級(jí)結(jié)構(gòu)特征 的不同，每個(gè)PI類別又可劃歸為多個(gè)家族。植物蛋白 酶抑制劑數(shù)據(jù)庫(kù)歸納了 16個(gè)抑制劑家族，大多為植 物所特有。在四類抑制劑中，作用于絲氨酸蛋白酶的 PI 研究最為廣

3、泛，其中 Bowman-Birk、Kunitz、Potato I 和 Potato II亞族已有相關(guān)綜述文章詳細(xì)介紹頃。本文重 點(diǎn)介紹半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)、絲氨酸蛋白 酶抑制劑(serpin)家族和其他植物蛋白酶抑制劑家族 (或亞家族)的分布、活性和主要結(jié)構(gòu)特征諸方面的研 究進(jìn)展。1植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑(PhyCys)家族半胱氨酸蛋白酶抑制劑廣泛存在于脊椎動(dòng)物、無(wú) 脊椎動(dòng)物和植物組織，主要抑制木瓜蛋白酶(C1)和 Legumain( C13)家族蛋白酶6。半胱氨酸蛋白酶抑制劑包含五條反向平行.新疊包裹的-螺旋，三個(gè)與蛋 白酶緊密結(jié)合的保守序列(包括與蛋白酶活性位點(diǎn)結(jié) 合

4、的序列)是抑制功能的基礎(chǔ)。植物半胱氨酸蛋白酶 抑制劑代表了其中一個(gè)獨(dú)特的亞族，其氨基酸序列中 包括一段獨(dú)特的N沫端共有基序：LVI-AGT- RKE -FY -AS -VI *-EDQV -HYFQ-螺旋;此外，植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑的第一個(gè)發(fā)夾結(jié) 構(gòu)中的QVVAGTMYIT基序和第二個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的 EAKVWVKPW基序通常都包含QxVxGx和PW序歹列。 一般來(lái)說(shuō),植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑的分子量介于 1216kDa,結(jié)構(gòu)中不存在二硫鍵。一種植物通常存在多種形式的植物半胱氨酸蛋白 酶抑制劑。水稻穎果中的OC-I和0C-!研究比較充 分,分別由102和107個(gè)氨基酸殘基組成，兩者的序列 相

5、似度達(dá)55%。0C-I對(duì)木瓜蛋白酶的抑制作用(Ki = 30 nM)強(qiáng)于 0C-! ( Ki = 0. 83 *M) , 0C-!對(duì)組織蛋白 酶H ( Ki = 30 nM)的抑制作用強(qiáng)于0C-I ( Ki = 0.79 *M) #基因組分析顯示，水稻中存在12種不同 的植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因，擬南芥和大麥也 各存在7種7。基于蛋白序列的clustalW多重比對(duì)和 MEME保守基序搜索顯示，植物半胱氨酸蛋白酶抑制 劑是高度保守的蛋白質(zhì)家族7 !2絲氨酸蛋白酶抑制劑家族絲氨酸蛋白酶抑制劑是最大的、分布最廣泛的蛋 白酶抑制劑超家族8，已發(fā)現(xiàn)存在于大麥籽粒、小麥籽 粒、黑麥、野燕麥、南瓜和擬南

6、芥中，分子量通常大于 40 kDa,抑制機(jī)制迥異于其他PI的可逆抑制，采取獨(dú)特的“自殺抑制”項(xiàng)。與典型的可逆抑制劑相比，絲氨酸 蛋白酶抑制劑的可變反應(yīng)活性環(huán)(reactive site loop, RCL)具有柔性,暴露在溶劑中可以呈現(xiàn)不同的構(gòu)象， 作為蛋白酶的模擬底物與蛋白酶緊密結(jié)合后形成絲氨 酸蛋白酶抑制劑龔白酶復(fù)合物。隨后，絲氨酸蛋白酶 抑制劑在RCL處發(fā)生肽鍵水解，構(gòu)象發(fā)生不可逆改 變，把共價(jià)結(jié)合的蛋白酶從頂部強(qiáng)制轉(zhuǎn)移到底部并發(fā) 生結(jié)構(gòu)改變,使蛋白酶不可逆地失去活性。在完成測(cè)序的水稻、葡萄和擬南芥基因組中，一些 絲氨酸蛋白酶抑制劑基因已被確認(rèn)。Plants Pls數(shù)據(jù) 庫(kù)(http:

7、/ /plantpis. ba. itb. cnr. it/)已收錄 21 個(gè)水稻 基因組、1個(gè)葡萄基因組和%個(gè)擬南芥基因組絲氨酸 蛋白酶抑制劑家族成員。擬南芥的絲氨酸蛋白酶抑制 劑1( serpin 1，即Atlg 47710)能抑制內(nèi)源性蛋白酶 metacaspase 9 ,另有6個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑基因在擬 南芥幼苗和成熟組織中存在表達(dá)差異10 !3 #4定粉酶/胰蛋白酶抑制劑家族-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑具有抑制淀粉酶和胰 蛋白酶的雙重活性，只存在于植物中。-淀粉酶抑制 劑具有顯著的結(jié)構(gòu)多樣性和抑制方式特異性11，被細(xì)分 為六類： Lectin-like、knottin-like、cer

8、eal-like、Kunitz-like、 /-purothionin-like 和 thaumatin-like。其中 Cereal-like 和 Kunitz-like中的部分抑制劑對(duì)蛋白酶有抑制活性。Cereal-like抑制劑由120 - 160氨基酸組成，包含 多個(gè)保守的半胱氨酸殘基，并存在二硫鍵。第一個(gè)純 化的該類型抑制劑RBI來(lái)自穆子(Eleusine coracana)， 后來(lái)在大麥、小麥和玉米中也發(fā)現(xiàn)其存在，它們對(duì)淀粉 酶和胰蛋白酶都具有抑制活性。RBI是由122個(gè)氨基 酸組成的穩(wěn)定單體，存在5個(gè)二硫鍵，具有完全獨(dú)立的 淀粉酶和胰蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)，是雙功能雙頭抑制劑： N沫端負(fù)

9、責(zé)抑制淀粉酶，C沫端負(fù)責(zé)抑制胰蛋白 酶12。作為胰蛋白酶抑制劑，RBI遵循大多數(shù)絲氨酸 蛋白酶抑制劑的普遍機(jī)制，是一種強(qiáng)有力的牛胰蛋白 酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑(Ki=1.2nM)，色譜層析和抑制作用 研究表明重組RBI能夠以1 ： 1的摩爾比同時(shí)結(jié)合兩 種靶酶。Kunitz-like抑制劑大約由180個(gè)氨基酸組成，存在 兩個(gè)二硫鍵。大麥-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑 (BASI)也是雙功能雙頭抑制劑，包含181個(gè)氨基酸殘 基，抑制大麥內(nèi)源性-淀粉酶2的活性，同時(shí)對(duì)外源性 枯草桿菌蛋白酶(來(lái)源于病原菌或昆蟲(chóng))也有抑制作 用。在小麥和水稻中發(fā)現(xiàn)的BASI同源蛋白與BASI序 列相似度分別為92%和58%。

10、4南瓜胰蛋白酶抑制劑家族南瓜胰蛋白酶抑制劑家族包含32條抑制劑序列， 組成植物特異性PI的第四大家族。這些抑制劑來(lái)自 南瓜、夏南瓜、西葫蘆、西瓜、異株瀉根、黃瓜、花椒、意 面瓜、小雀瓜種子、佛手瓜種子和冬瓜種子等。南瓜抑制劑是已知分子量最小的抑制劑，由27 33個(gè)氨基酸殘基組成，包含多個(gè)亞型，三個(gè)交聯(lián)的二 硫橋?qū)Ψ肿拥姆€(wěn)定性和剛性起重要作用13。南瓜抑 制劑是絲氨酸蛋白酶的特異性抑制劑，抑制劑高度的 穩(wěn)定性和剛性特征使其具有很強(qiáng)的抑制活性(Ki范圍 為0. 001-0. 01 nM)，它們可以抑制胰蛋白酶、纖溶酶、 激肽釋放酶、凝血因子(Xa和XIIa)和組織蛋白酶G。南瓜抑制劑家族成員在進(jìn)化

11、上保守性很高，家族 成員序列相似度在44%-97%之間。該家族抑制劑和 胰蛋白酶形成的復(fù)合物已經(jīng)通過(guò)高分辨率X射線衍射 分析，確認(rèn)了其底物識(shí)別機(jī)制和其他絲氨酸蛋白酶抑 制劑底物識(shí)別機(jī)制相似14。5芥菜胰蛋白酶抑制劑家族芥菜胰蛋白酶抑制劑僅存在于十字花科植物，與 其他抑制劑家族不存在結(jié)構(gòu)上的同源性。從芥菜籽分 離的芥菜胰蛋白酶抑制劑_2( MTI-2)是第一個(gè)被測(cè)序 的家族成員。MTI-2富含半胱氨酸和甘氨酸殘基，由 63個(gè)氨基酸組成，對(duì)牛胰蛋白酶的抑制活性較高(Ki = 0. 001 nM)，對(duì)胰凝乳蛋白酶的抑制活性較低(Ki 1 000 nM)。在野生十字花科細(xì)葉二行芥(Diplotaxis

12、 tenuifolia) 和墻生二行芥(Diplotaxis muralis)中也發(fā)現(xiàn)類似芥菜 胰蛋白酶抑制劑的編碼基因，它們和mit-2基因高度相 似。目前為止，芥菜胰蛋白酶抑制劑家族中只有擬南 芥胰蛋白酶抑制劑(ATTp)的前體形式用核磁共振得 到解析，該抑制劑蛋白包含一個(gè)-螺旋和兩個(gè)由IV型 .梟角連接的反向平行折疊。-螺旋及抑制“1。叩” 通過(guò)3個(gè)二硫橋與折疊連接，第四個(gè)二硫橋連接N- 末端和末端,反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)暴露于溶劑中。在已鑒定 的芥菜胰蛋白酶抑制劑家族抑制劑中，活性位點(diǎn)氨基 酸表現(xiàn)出高度保守性15。6天冬氨酸蛋白酶抑制劑家族從結(jié)構(gòu)上看，天冬氨酸蛋白酶抑制劑屬于絲氨酸 蛋白酶抑制劑的

13、一個(gè)亞族4。天冬氨酸蛋白酶(APs) 存在于動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌和病毒中，這類蛋白酶的 特征是活性位點(diǎn)包含兩個(gè)天冬氨酸殘基，以及在酸性 條件下具有較高酶活性。植物中的天冬氨酸蛋白酶較 為分散，通常劃歸成不同的亞類16，與天冬氨酸蛋白 酶在自然界的廣泛分布不同，目前已檢測(cè)到的天冬氨 酸蛋白酶抑制劑數(shù)量則相當(dāng)有限，只在馬鈴薯中發(fā)現(xiàn) 了組織蛋白酶D抑制劑，在南瓜和番茄中檢測(cè)到了胃 蛋白酶抑制劑。馬鈴薯中組織蛋白酶D抑制劑生化特征已經(jīng)解析，它們的氨基酸序列和二硫橋數(shù)量、位置彼 此很相似，最早純化的兩個(gè)亞型經(jīng)過(guò)生物學(xué)鑒定，對(duì)組 織蛋白酶D和胰蛋白酶存在抑制活性。7金屬羧肽酶抑制劑家族金屬羧肽酶(MCP

14、s)是在動(dòng)物、植物和微生物中均 可檢測(cè)到的外肽酶，具有消化食物蛋白和加工生物活 性肽的功能。在植物中鑒定出一種特定的金屬羧肽酶 抑制劑，僅存在于茄科植物;在馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)的金屬羧 肽酶抑制劑在馬鈴薯塊莖和葉片傷愈組織中均存在 表達(dá)17：。馬鈴薯中的金屬羧肽酶抑制劑是由39個(gè)氨基酸 組成的球蛋白，競(jìng)爭(zhēng)性抑制來(lái)自各種哺乳動(dòng)物胰腺的 羧肽酶A和B ,其Ki值在nmol范圍，后來(lái)證實(shí)對(duì)來(lái)自 其他動(dòng)物和微生物的金屬羧肽酶也有抑制作用。它的 三維結(jié)構(gòu)以及其與羧肽酶A結(jié)合后的晶體結(jié)構(gòu)都已解 析。金屬羧肽酶抑制劑C*末端的Gly39-Gly35是金屬 羧肽酶的結(jié)合位點(diǎn)，在抑制過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用： C*末端進(jìn)入酶的活性位點(diǎn)，Gly39氨基端肽鍵斷開(kāi)后， Val38羧基與羧肽酶活性位點(diǎn)的Zn2+配位，占據(jù)了羧肽 酶底物結(jié)合空間。金屬羧肽酶抑制劑包含27個(gè)核心 殘基，并由三個(gè)二硫橋連接形成穩(wěn)定的T字支架結(jié)構(gòu)。 8結(jié)語(yǔ)PI通常抑制半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、金 屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等。更多的PI家族可以 在數(shù)據(jù)庫(kù) MEROPS( ht