基因圖位克隆的策略與途徑

1、擬南芥基因克隆的策略與途徑擬南芥（Arabidopsis thaliana）是一種模式植物，具有基因組?。?25 Mbp）、生長周期短等特點，而且基因組測序已經(jīng)完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同時，擬南芥屬十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特點，擬南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括農(nóng)作物的研究，產(chǎn)生重大的經(jīng)濟(jì)效益，特別是十字花科中還有許多重要的經(jīng)濟(jì)作物，與人類的生產(chǎn)生活密切相關(guān)，因此目前擬南芥的研究越來越多地受到國際植物學(xué)及各國政府的重視?；?gene)是遺傳物質(zhì)的最基本單位,也是所有生命活動的基礎(chǔ)。不論

2、要揭示某個基因的功能,還是要改變某個基因的功能,都必須首先將所要研究的基因克隆出來。特定基因的克隆是整個基因工程或分子生物學(xué)的起點。本文就基因克隆的幾種常用方法介紹如下。1、圖位克克隆Map-bbaseed cclonningg, aalsoo knnownn ass poosittionnal clooninng, firrst proopossed by Alaan CCoullsonn off thhe Uniiverrsitty oof CCambbriddge in 19886, Genne isoolatted by thiis mmethhod is bassed on funn

3、ctiionaal ggenees in thee geenomme hass a rellatiivelly staablee locci, in thee usse oof gennetiic llinkkagee anaalyssis or chrromoosommal abnnormmaliitiees oof ssepaaratte grooupss willl queeue intto tthe chrromoosomme of a speeciffic loccatiion, By connstrructtingg higgh-ddenssityy mollecuularr li

4、nnkagge mmap, too fiind mollecuularr maarkeers tigghtlly llinkked witth tthe aimmed genne, conntinnuedd too naarroow tthe canndiddatee reegioon andd thhen cloone thee geene andd too cllariify itss fuuncttionn andd bioocheemiccal mecchannismms.圖位 HYPERLINK /Science/Science_20070212220158.html 克隆（mmap

5、-bassed cloonigg）又稱稱 HYPERLINK /Education/Education_20070921203940.html 定位克隆隆（poosittoinnal clooninng），119866年首先先由劍橋橋大學(xué)的的Alaan CCoullsonn提出。用用該方法法分離基基因是根根據(jù)功能能基因在在 HYPERLINK /Health/Health_20070212171436.html 基因組組中都有有相對較較穩(wěn)定的的基因座座，在利利用分離離群體的的遺傳連連鎖分析析或 HYPERLINK /Health/Health_20070601005334.html 染色色體

6、HYPERLINK /Computer/Computer_20080929153854.html 異常常將基因因佇到染染色體的的1個具具體位置置的基礎(chǔ)礎(chǔ)上，通通過構(gòu)建建高密度度的分子子連鎖圖圖，找到到與目的的基因緊緊密連鎖鎖的分子子標(biāo)記，不不斷縮小小候選區(qū)區(qū)域進(jìn)而而克隆該該基因，并并闡明其功功能和生生化 HYPERLINK /Education/Education_20070615003255.html 機(jī)制制。用該方法分分離基因因是根據(jù)據(jù)目的基基因在染染色體上上的位置置進(jìn)行的的，無需需預(yù)先知知道基因因的DNNA序列列，也無無需預(yù)先先知道其其表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物的有有關(guān)信息息。它是是通過分分析突變變位點

7、與與已知分分子標(biāo)記記的連鎖鎖關(guān)系來來確定突突變表型型的遺傳傳基礎(chǔ)。近近幾年來來隨著擬擬南芥基基因組測測序工作作的完成成，各種種分子標(biāo)標(biāo)記的日日趨豐富富和各種種數(shù)據(jù)庫庫的完善善，在擬擬南芥中中克隆一一個基因因所需要要的努力力已經(jīng)大大大減少少了（圖圖1）。 目目前完成成整個擬擬南芥的的圖位克克隆過程程大約需需要一年年時間。在在這個過過程中，我我們從篩篩選突變變體開始始，逐漸漸找到和和表型相相關(guān)的基基因。這這和反向向遺傳學(xué)學(xué)（revversse ggeneeticcs）的方法法正好相相反。圖圖位克隆隆能實現(xiàn)現(xiàn)，關(guān)鍵鍵在于全全基因組組測序計計劃的完完成和各各種分子子標(biāo)記的的發(fā)現(xiàn)。這這些數(shù)據(jù)據(jù)被儲存存在

8、專門門的數(shù)據(jù)據(jù)庫中（表表1）（Luukowwitzz等， 220000）。表1 擬南南芥網(wǎng)絡(luò)絡(luò)資源網(wǎng)站網(wǎng)址Suppllemeentaal mmateeriaal ffor thiis ppapeerhttp:/ccarnnegiiedppb.sstannforrd.eedu/metthodds/pppsuuppll.httmlNottiinghham Stoock Cenntree（U.KK.）http:/nnascc.noott.ac.uk/Recommbinnantt Innbreed mmap http:/nnascc.noott.ac.uk/neww_rii_maap.hhtmllOh

9、io Stoock Cennterr（U.SS.A.） http:/u/aiims/TAIR dattabaase*， hoomeppagee http:/gRecommbinnantt Innbreed mmap（mirrrorr siite） http:/g/cggi-bbin/mapps/RRiinntroomappCAPS marrkerrs http:/g/abbouttcapps.hhtmllSequeencee taablee http:/g/cggi-bbin/mapps/SSeqttablle.pplSNP ccolllecttionn http:/g/SNNPs.htmml

10、CEREOON ccolllecttionn off poolymmorpphissms http:/g/ceereoonSSLP marrkerrshttp:/ggenoome.bioo.uppennn.eddu/SSSLPP_innfo/SSLLP.hhtmllTIGR， geenomme aannootattionns http:/wwww.tiggr.oorg/tdbb/atthl/htmmls/inddex.htmmlDatabbasee off Leer ssequuencces http:/wwww.tiggr.oorg/tdbb/attgennomee/Leer.hhtmllK

11、asuzza DDNA Ressearrch Insstittutee， geenomme aannootattionns http:/wwww.kazzusaa.orr.jpp/kaaos/MIPS gennomee annnottatiionss http:/wwebssvr.mipps.bbiocchemm.mppg.dde/pprojj/thhal/SINS dattabaase of traanspposoon iinseertiionss http:/wwww.jicc.bbbsrcc.acc.ukk/saainssburry-llab/jonnathhan-jonnes/jjhh

12、omee.httm*注：Thhe AArabbidoopsiis IInfoormaatioon RResoourcce （TAIIR）在擬南芥中中的圖位位克隆，在在很大程程度上得得益于對對Coll-0生生態(tài)型測測序的完完成，因因為它是是在研究究擬南芥芥時最常常用的生生態(tài)型。實現(xiàn)基因圖位克隆的關(guān)鍵是篩選與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記。實質(zhì)上，分子標(biāo)記是一個特異的DNA片段或能夠檢出的等位基因，對其有效地利用即可達(dá)到圖位克隆基因之目的。迄今為止，已有幾十種技術(shù)可用于分子標(biāo)記的篩選（Wang等，2000）。其中最為常用的是簡單序列長度多態(tài)性（SSLPs）和單核苷酸多態(tài)性（SNPs）。SSLP是是基于PP

13、CR的的分子標(biāo)標(biāo)記，在在擬南芥芥基因組組中有較較多分布布，而且且是共顯顯性的，它它的檢測測非常直直接，但但是我們們需要設(shè)設(shè)計引物物來檢測測假定的的SSLLP標(biāo)記記；對SSNPss標(biāo)記的的檢測也也比較直直接，它它是擬南南芥不同同生態(tài)型型之間基基因組中中的單個個核苷酸酸的差別別，這些些差別的的核苷酸酸通常位位于非編碼區(qū)區(qū)域（PPeteers等等， 220033）。最最常見的的用于檢檢測SNNPs標(biāo)標(biāo)記的方方法主要要是剪切切擴(kuò)增多多態(tài)性序序列（CCAPSS），它它也是基基于PCCR的。另另外，一一種更為為有效的的方法衍衍生的CCAPSS（dCAAPS）（Naam等， 119899； Miichaae

14、lss 和 Ammasiino， 19998）可可把任何何已知的的點突變變作為分分子標(biāo)記記，只要要在PCCR是引引入不配配對的引引物，使使擴(kuò)增的的序列在在一個生生態(tài)型中中具有限限制性酶酶切位點點，而在在另一生生態(tài)型中中沒有，以以形成多多態(tài)性。圖位克隆法法隨著相相關(guān)配套套技術(shù)（序序列數(shù)據(jù)據(jù)庫、分分子標(biāo)記記等）的的日漸成成熟，許許多擬南南芥及一一些農(nóng)作作物的基基因已被被成功的的克?。ū肀?）。表2 用圖圖位克隆隆方法得得到的擬擬南芥及及一些農(nóng)農(nóng)作物的的基因基因突變表型基因同源序序列AB13脫落酸不敏敏感玉米轉(zhuǎn)錄子子FID3降低亞油酸酸飽和度度細(xì)菌去飽和和酸酶AXR1生長素抗性性泛素N 端端活性酶酶

15、ETR1乙烯抗性雙因子調(diào)節(jié)節(jié)子ABI1脫落酸不敏敏感鈣調(diào)蛋白磷磷酸化酶酶DET1黃化損傷反反應(yīng)新核蛋白RPS2抗病新型富含亮亮氨酸的的蛋白酶酶RPM1抗病激酶RSW1纖維素合成成酶細(xì)胞色素PP4500 家系系ZLL調(diào)節(jié)中莖分分生細(xì)胞胚胎發(fā)發(fā)育蛋白白PRT1抑制胞間蛋蛋白降解解控制植物NN 端代代謝Tornaadoll植株短化IFL1正常的維管管束間纖纖維分化化受阻亮氨酸拉鏈鏈蛋白ARA1樹膠醛糖激激酶活性性喪失半乳糖激酶酶基因家家族VTC2維生素C合合成不足足果蠅蛋白CCG35552，線線蟲蛋白白C100F3.4（功功能未知知）AST種皮花青苷苷斑點花青苷生物物合成途途徑中的的二氫黃黃酮醇-4

16、-還還原酶本文擬對圖圖位克隆隆的研究究進(jìn)展做做一介紹紹，以期期對植物物遺傳育育種和分分子生物物學(xué)研究究有所幫幫助。2 圖位克克隆的一一般過程程因為有了擬擬南芥的的基因組組序列和和高密度度的遺傳傳標(biāo)記，圖圖位克隆隆過程就就變得相相對直接接。圖22例舉了了一種高高效的擬擬南芥圖圖位克隆隆方法。從從基于CCol-0和Ler遺傳傳背景的的突變體體出發(fā)，我我們有可可能在大大約一年年時間內(nèi)內(nèi)找出與與這個突突變相關(guān)關(guān)的基因因，這其其中主要要耗時間間的是五五個植物物（擬南南芥）的的生長周周期（我我們假定定每個周周期為兩兩個月）。作為作圖過過程的第第一步，突突變體植植株將和和另外一一個生態(tài)態(tài)型（CCol-0或者

17、者Ler）的的植株雜雜交。在在大多數(shù)數(shù)情況下下，用于于雜交的的突變體體植株是是作為父父本還是是母本是是沒有關(guān)關(guān)系的。然然后播種種F1代種種子。在在F1代植植物的生生長過程程中，我我們就有有可能來來對其表表現(xiàn)型和和基因型型進(jìn)行分分析。FF1代植植物的表表型的出出現(xiàn)或者者消失將將顯示著著我們所所研究的的突變是是顯性的的還是隱隱性的。最最好通過過對一些些標(biāo)記的的分析來來確認(rèn)FF1代植植物是雜雜合體，而而且在雜雜交過程程中我們們沒有犯犯錯誤。當(dāng)當(dāng)然也有有必要確確認(rèn)原來來的生態(tài)態(tài)型背景景。圖2 圖位位克隆過過程示意意圖（JJandder等等， 220022）F1代植物物自交得得到F22代種子子，大約約播

18、種6600個個個體以以進(jìn)行突突變基因因的粗定定位（ffirsst-ppasss maappiing，圖圖2）。在在其生長長過程中中，我們們可確定定其表型型，大約約有1550個個個體被認(rèn)認(rèn)為是純純合體（在在隱性突突變的情情況下是是純合突突變體，在在顯性突突變的情情況下是是純合野野生型）。然然后從這這1500個個體體的葉子子或者其其它組織織中制備備DNAA用于基基因型分分析。起起先用分分布于擬擬南芥五五條染色色體上的的25個標(biāo)標(biāo)記（相相鄰的兩兩個標(biāo)記記之間大大約相距距20 cM）進(jìn)進(jìn)行分析析，確定定突變基基因是和和哪個或或者哪幾幾個標(biāo)記記是連鎖鎖的，然然后用三三點測交交的方法法來定義義一個包包含突

19、變變基因的的大約220 ccM的遺遺傳間隔隔。一旦旦這樣的的一個遺遺傳間隔隔被定義義之后，接接下來的的工作就就是引入入新的標(biāo)標(biāo)記把這這個間隔隔縮小到到大約44 cMM。一般般來說，利利用1550個F2代個個體是在在很大程程度上能能找到這這樣一個個遺傳間間隔的，距距離突變變基因最最近的兩兩個分子子標(biāo)記將將作為側(cè)側(cè)面標(biāo)記記而用于于下面的的進(jìn)一步步分析。下一步我們們將播種種一個更更大的FF2代群群體用于于突變基基因的精精細(xì)定位位（fiine-ressoluutioon mmapppingg，圖2）。最最終目標(biāo)標(biāo)是將包包含突變變基因的的遺傳間間隔縮小小到400 Kbb甚至更更?。ㄟ@這在擬南南芥中大大約

20、是00.166 cMM）。顯顯然用于于作圖的的F2代植植物越多多，就越越能精確確地定位位突變基基因。一一般需要要30000440000個F2代植植物個體體（包括括粗定位位時的6600個個F2代植植物個體體）來精精確地定定位突變變基因。但但是也有有很多圖圖位克隆隆過程用用了少于于30000個F2代植植物個體體就成功功地定位位了突變變基因（Lukowitz等， 2000）。但是這往往要冒因為作圖群體不夠大再一次種植F2代植物而延長整個作圖過程的時間的風(fēng)險。在這個大約約4 ccM的遺遺傳間隔隔內(nèi)找到到與突變變更緊密密連鎖的的分子標(biāo)標(biāo)記，一一般情況況下能在在突變兩兩側(cè)找到到相距小小于400 Kbb的兩

21、個個分子標(biāo)標(biāo)記。一一旦這樣樣的兩個個分子標(biāo)標(biāo)記被找找到之后后，就可可以通過過測序來來找到突突變基因因。一種種有效的的方法是是設(shè)計PPCR引引物來擴(kuò)擴(kuò)增覆蓋蓋這400 Kbb的多個個重疊的的5000 bpp的片段段。將這這些片段段測序后后拼接起起來以得得到整個個40 Kb的的序列，然然后將它它與野生生型植物物（Cool-00或者Ler）的的序列進(jìn)進(jìn)行比對對，這就就可以找找到這個個區(qū)域中中的多個個基因。從從一系列列侯選基基因中鑒鑒定基因因是定位位克隆技技術(shù)的最最后一個個關(guān)鍵環(huán)環(huán)節(jié)?，F(xiàn)現(xiàn)在最常常用的方方法是用用含有目目標(biāo)基因因的大片片段克隆隆如BAAC克隆隆或YAAC克隆隆去篩選選cDNNA文庫庫，

22、并查查詢生物物數(shù)據(jù)信信息庫，待待找出侯侯選基因因后，把把這些侯侯選基因因進(jìn)行下下列分析析以確定定目標(biāo)基基因：（1）精確確定位法法檢查ccDNAA是否與與目標(biāo)基基因共分分離；（2）檢查cDNA時空表達(dá)特點是否與表型一致；（3）測定cDNA序列，查詢數(shù)據(jù)庫，以了解該基因的功能；（4）篩選突變體文庫，找出DNA序列上的變化及與功能的關(guān)系；（5）進(jìn)行功能互補(bǔ)實驗，通過轉(zhuǎn)化突變體觀察突變體表型是否恢復(fù)正?；虬l(fā)生預(yù)期的表型變化。功能互補(bǔ)實驗是最直接、最終鑒定基因的方法。利用新興的RNA干擾（RNAi）也可有效地確定目的基因。同源克?。荷锏牡姆N、屬屬之間編編碼基因因序列的的同源性性高于非非編碼區(qū)區(qū)的序列列

23、，基于于此原理理，在其其他種屬屬同源基基因被克克隆的前前提下，構(gòu)構(gòu)建cDDNA文文庫或基基因組文文庫，然然后用已已知分子子高保守守序列制制備同源源探針，經(jīng)經(jīng)標(biāo)記后后從相應(yīng)應(yīng)的文庫庫中篩選選陽性克克隆，并并經(jīng)核酸酸序列分分析鑒定定所克隆隆的基因因，當(dāng)然然在沒有有全同源源探針的的情況下下，可以以使用部部分同源源探針來來篩選與與探針序序列相關(guān)關(guān)但不完完全相同同的基因因。圖位克隆同源克隆轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽簽 表達(dá)序列列標(biāo)簽(exppresssedd seequeencee taags, ESST)是是從一個個隨機(jī)選選擇的ccDNAA克隆進(jìn)進(jìn)行5端和3端單一一次測序序獲得的的短的ccDNAA部分序序列, 代表一

24、一個完整整基因的的一部分分。DbESTT，daatabbasee ESST 表表達(dá)序列列標(biāo)簽數(shù)數(shù)據(jù)庫。1951年年Barrbarra MMcliintoock首首先在玉玉米中發(fā)發(fā)現(xiàn)了控控制元件件，后來來命名為為轉(zhuǎn)座元元件或轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座子(traanspposoon)。轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座子是是基因組組中一段段可移動動的DNNA序列列，可以以通過切切割、重重新整合合等一系系列過程程從基因因組的一一個位置置“跳躍躍”到另另一個位位置。這這一元件件不僅可可用于分分析生物物遺傳進(jìn)進(jìn)化上分分子作用用引起的的一些現(xiàn)現(xiàn)象，還還為基因因工程和和分子生生物學(xué)研研究提供供了強(qiáng)有有力的工工具，可可以在不不了解基基因產(chǎn)物物的生化化性質(zhì)和

25、和表達(dá)模模式的情情況下，分分離克隆隆植物基基因，即即轉(zhuǎn)座子子標(biāo)簽(traanspposoon ttagggingg)，又又稱為轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座子示示蹤法。其其原理是是利用轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座子的的插入造造成基因因突變，以以轉(zhuǎn)座子子序列為為基礎(chǔ)，從從突變株株的基因因文庫中中篩選出出帶有此此轉(zhuǎn)座子子的克隆隆，它必必定含有有與轉(zhuǎn)座座子序列列相鄰的的突變基基因的部部分序列列，再利利用這部部分序列列從野生生型基因因文庫中中獲得完完整的基基因11。119844年，用用轉(zhuǎn)座子子標(biāo)簽法法首先在在玉米中中分離了了broonzee基因，該該基因編編碼了玉玉米花色色素合成成途徑的的關(guān)鍵酶酶UUDP-葡萄糖糖類黃33-O-葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移移酶22。此此后還利利用轉(zhuǎn)座座子標(biāo)簽簽技術(shù)分分離了許許多植物物基因。 轉(zhuǎn)座子可以以分為兩兩大類：以DNNA-DDNA方方式轉(zhuǎn)座座的轉(zhuǎn)座座子和反反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座子(rettrottrannspoosonn)。第第一類轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座子可可以通過過