羅氏實時熒光定量PCR儀分解課件

1、實時熒光定量PCR儀實時熒光定量PCR儀一、實時熒光定量PCR的原理熒光定量 PCR通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程，結合相應的軟件可以對結果進行分析，計算待測樣品的初始模板量。熒光定量 PCR儀熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀，通常配有電腦系統(tǒng)及相應的分析軟件。一、實時熒光定量PCR的原理熒光定量 PCR 定量PCR技術的產(chǎn)生1992年由Higuchi等人第一次報告：使用EB內(nèi)插染料法插至雙鏈DNA，經(jīng)改裝的帶有冷CCD的PCR儀檢測樣品的熒光強度PCR循環(huán) = 雙鏈DNA = 染料 = 熒光后來用與雙鏈DNA

2、有更強結合力的SYBR Green I取代EB 熒光定量實時PCR與普通PCR的比較實時在線監(jiān)控 對樣品擴增的整個過程進行實時監(jiān)控，能夠實時地觀察到產(chǎn)物的增加，直觀地看到反應的對數(shù)期降低反應的非特異性 使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合，提高了PCR反應的特異性增加定量的精確性 全程監(jiān)控，準確的算法進行定量結果分析更加快捷方便，無需跑膠 熒光定量實時PCR與普通PCR的比較 羅氏產(chǎn)品介紹以及與同類產(chǎn)品之間的對比 羅氏產(chǎn)品介紹以及與同類產(chǎn)品之間的對比一、LC1.5和LC2.0LightCycler熒光定量PCR系統(tǒng) LC1.5LC2.0一、LC1.5和LC2.0LightCycler熒光定量

3、PCLightcycler 1.5 結構分析以空氣加熱及冷卻迅速改變溫度帶有極高表面積/容量比例的密封20l毛細管加熱線圈可容納32個樣品的卡盤將熒光儀定位的分檔器發(fā)動機將樣品置于光學儀上的分檔器發(fā)動機熱室風扇濾器免維護的LED光源光學倍增管Lightcycler 1.5 結構分析以空氣加熱及冷卻迅速Lightcycler 2.0 結構分析空氣加熱系統(tǒng)LED激發(fā)光源PMT檢測系統(tǒng)光纖Lightcycler 2.0 結構分析空氣加熱系統(tǒng)LED激熱力學結構特點： 1、空氣加熱 2、毛細管反應體系優(yōu)點: 1、升降溫速度快（0.05 -20/秒）， 2、體系均一，不存在邊緣現(xiàn)象 3、把反應體系縮小到0

4、-20ul，節(jié)省試劑成本 實現(xiàn)快速PCR熱力學結構特點：光學結構特點：1、免維護的LED冷光源，壽命長達2萬小時以上2、光學倍增管（Rodenstock ）3、多達6通道（LC2.0）和3通道（LC1.5）實時檢 測優(yōu)點：1、毛細管光學特性將光線散射、衍射降至最低， 避免LED 功率低的問題2、免維護，帶自動檢驗功能3、輕易實現(xiàn)內(nèi)標、內(nèi)對照及多重PCR光學結構特點：LightCycler 結構分析激發(fā)光源 Rodenstock-LED（發(fā)光二極管） 冷光源，免維護，開機可以馬上進行操作。 檢測系統(tǒng)光學倍增管 (PMT)靈敏度高，寬檢驗范圍,背景低，無邊緣效應 加熱方式空氣加熱管間差小，熱傳導速

5、率20/秒，溫控變化準確（0.05-20/秒）。 反應體系 兩種石英玻璃毛細管體系 (20ul 和100ul) 光學性好，反應體系小，節(jié)約試劑成本,適合多種用途。檢測光路范圍 530nm, 555nm, 610nm, 640nm, 670nm, 710nm.六個波長，并解決相關熒光素熒光干擾問題LightCycler 結構分析激發(fā)光源 Rodenstoc LightCycler 軟件 4.0 更先進的自動定量方法全新的相對定量軟件全自動熔點曲線分組全自動熔點溫度提示簡化數(shù)據(jù)和用戶管理 LightCycler 軟件 4.0PCR領域最聰明的革新 LightCycler熒光定量PCR系統(tǒng)超高速 3

6、0至40分鐘完成PCR過程實時在線監(jiān)測 收集每一循環(huán)的數(shù)據(jù)并立即顯示于聯(lián)機電腦上高靈敏 在一個基因組當量中可檢測出單基因拷貝范圍廣 可檢測101010拷貝線性范圍，無需稀釋樣品開放性 全開放，成為國內(nèi)外試劑廠家的首選開發(fā)平臺六個熒光通道 輕易實現(xiàn)內(nèi)標、內(nèi)對照或多重PCR最小化 定量反應體積降至1020ul，費用低廉靈活性 支持水解探針、雜交探針及 SYBR Green I閉管分析 消除污染風險PCR領域最聰明的革新 LightCycler熒光定量PLightcycler 的分析模式適用于所有的通用探針及染料分析模式： SYBR Green I（熒光染料）TaqMan（水解探針）Molecula

7、r beacon（分子信標）Lightcycler上開發(fā)獨有的分析模式：Hybridization Probe Format（雜交探針）SimpleProbe （單探針）Lightcycler 的分析模式適用于所有的通用探針及染料 SYBR-Green I 檢測模式 SYBR Green I能選擇性地與雙鏈DNA結合，在外界光源激發(fā)下產(chǎn)生強烈熒光。在PCR過程中， SYBR Green I可與新合成地雙鏈DNA結合，產(chǎn)生地熒光信號強度與雙鏈DNA含量成正比，熒光檢測在每一循環(huán)的延期后進行。 SYBR Green I與非特異性雙鏈DNA（如引物二聚體）結合產(chǎn)生的干擾可通過融解曲線分析而得到解決。

8、 SYBR-Green I 檢測模式 水解探針（Taqman ）檢測模式 同時標記有熒光發(fā)光分子和熒光淬滅分子的一條探針在激發(fā)光作用下，發(fā)光分子所產(chǎn)生的熒光可被淬滅分子吸收，因而檢測不到熒光。在PCR延伸時，因Taq酶具有的5，3，核酸外切酶活性，可降解熒光探針，使熒光發(fā)光分子與熒光淬滅分子分開，在外界光源激發(fā)下即可發(fā)出熒光，熒光強度與PCR擴增產(chǎn)物量有關。 水解探針（Taqman ）檢測模式 分子信標（Molecular Beacon Probe） 獨特的頸環(huán)結構，由非特異的頸和特異的環(huán)組成，探針的5端標記熒光分子，3端 標記一個吸收或淬滅熒光的分子 。自身環(huán)化時儀器檢測不到熒光，在PCR反

9、應的退火階段，探針因與模板鏈雜交而打開，使5端熒光分子與3端吸收或淬滅熒光的分子分開，儀器就會檢測到熒光信號。每一個循環(huán)，隨著PCR擴增產(chǎn)物的增加，熒光信號會增強，從而根據(jù)熒光信號的增強來計算PCR擴增產(chǎn)物的增加量。 分子信標（Molecular Beacon Prob 雜交探針（HybProbe）檢測模式 設計與檢測區(qū)互補的分別帶有不同染料標記的一對寡核苷酸（既雜交探針），在與擴增的DNA片斷雜交時，兩種染料互相接近。其中供體熒光染料受外來光源激發(fā)后，將能量傳遞給附近的受體染料，既發(fā)生熒光共振能量轉移（FRET），從而釋放出受體染料分子的發(fā)射波長熒光信號。熒光信號的強度和DNA的產(chǎn)量成正比。

10、其他非特異性產(chǎn)物由于不會與探針雜交，因而不產(chǎn)生信號干擾。 雜交探針（HybProbe）檢測模式 AnnealingElongationEnd of ElongationDenaturationFluoresceinLC Redfor sequence specific detection of DNA雜交探針檢測羅氏專利性技術 AnnealingElongationEnd of EloTemplate: Plasmid; Target: CycA; Detection Format: Hybridization ProbesStandard Calculated concentration9.

11、522E+91.024E+99.433E+71.127E+71.029E+69.902E+41.021E+49.217E+29.276E+11.085E+1H2O1.0E+101.0E+91.0E+81.0E+71.0E+61.0E+51.0E+41.0E+31.0E+21.0E+1H2O雜交探針的優(yōu)點：1.靈敏度高2.寬動力學范圍3.特異性高4.可用于突變分析Monitoring of PCR with the LightCyclerUsing Hybridization ProbesTemplate: Plasmid; Target: Cy 專用于SNP基因分型和突變檢測的 SimpleP

12、robe SimpleProbe作為一種獨特的雜交探針只含有一條寡核苷酸探針，能夠特異性的與目的基因上含有SNP位點的靶序列結合。探針與靶序列結合后，釋放出能夠被檢測到的熒光信號，通過對熔點曲線分析中探針釋放的熒光信號強度的分析，可以得到對目的基因的多態(tài)位點的準確分析結果。 專用于SNP基因分型和突變檢測的 Denaturation phase: SimpleProbe free in solution; emission of reporter dye is quenchedAnnealing phase: Fluorescence from reporter dye increases w

13、hen probe is annealed to its complementary target53-pQR35primer53-pQRNew Probe Format : SimpleProbe Format-高效低成本的新型探針R = Reporter (Fluorescein)Q = QuencherDenaturation phase: Annealing 熒光定量PCR儀的部分應用醫(yī)學相關研究 疾病的臨床早期診斷病原體的含量檢測合理用藥分子水平的療效研究 疾病的發(fā)病監(jiān)控研究 腫瘤相關基因腫瘤、耐藥基因的檢測研究組織或培養(yǎng)細胞中mRNA的表達水平 各種處理對細胞mRNA含量變化的影響

14、 比較染病組織與正常組織中各種mRNA含量差異DNA或RNA的轉染量與實驗結果關系的研究基因分型及SNP分析轉基因動物及植物研究熒光定量PCR儀的部分應用醫(yī)學相關研究 重點問題說明 超高速的熱循環(huán) 由于采用空氣迅速改變溫度，以及利用有高表面積/體積比的光學玻璃毛細管模式，使升降溫速度最高可達20/秒，溫控0.2 ， 每2030分鐘便能完成3040個循環(huán)。 升降溫數(shù)率唯一可調可以根據(jù)實驗的需要調整升降溫速率的系統(tǒng)0.0520 /秒，優(yōu)化實驗。 重點問題說明 超高速的熱循環(huán) 由于采用空氣迅 配套功能強大的分析軟件： （1）絕對定量（具“單點定標”功能） （2）相對定量（可進行效率校正） （3）自動

15、基因分型（SNP） （4） 顏色干擾校正 獨特的熔點曲線分析功能，可進一步作PCR后分析： - 檢測非特異擴增并作矯正 - 鑒別基因型而又無需采用測序凝膠 - 檢測點突變，并可利用雙色檢測及顏色補償軟 件在同 一反應中分析較復雜的突變 配套功能強大的分析軟件： 為什么使用DNase-Free & RNase-Free 的光學玻璃 毛細管? 玻璃反應管可加快熱傳導速率. 毛細管增加表面積/體積比，確?？諝夂头磻煞种g的 溫度迅速平衡，溫度均一. 縮短了PCR反應時間，特別是熒光激發(fā)的時間，保證了 反應成分的穩(wěn)定性，尤其是熒光染料的穩(wěn)定性。 縮小反應體系， 降低檢測成本。 光學玻璃毛細管的材料適

16、合熒光訊號的測定，類似光纖 的形狀，保證熒光訊號的準確捕獲。沒有邊緣效應. 為什么使用DNase-Free & RNase-Free LightCycler / 毛細管 / 試劑的成本核算 儀器的維護費用 LightCycler是免維護的儀器,采用的光源是普通的發(fā)光二極管，壽命長達20000小時以上，非常穩(wěn)定，價格低廉。而鹵素燈光源，壽命20000小時。鹵素燈。壽命短，需預熱，壽命2000小時。LED（發(fā)光二極管）,每一個孔位一個獨立的激發(fā)光源和檢測裝置 。LightCycler光源無需定期更換，穩(wěn)定方便，光路相同，樣本誤差最小，節(jié)約成本。加熱方式 空氣加熱，溫控變化準確（0.4）半導體加熱制

17、冷（溫控0.5）半導體加熱制冷（溫控0.5）LightCycler變溫速度快，溫控精確 。升降溫速度熱傳導速率20/秒，（0.05-20/秒) 熱傳導速率2.5/秒 熱傳導速率2.5/秒 LightCycler升降溫速度快，并可調節(jié) 運行時間 3040分鐘 23小時 1 .52 .5小時 LightCycler檢測時間短，快速出結果，應用最靈活 單點定標功能軟件可支持單點定標功能 無 無 LightCycler每次實驗節(jié)約反應管和反應試劑45份，且單點擬合確保實驗結果 反應管反應體系(定量)石英玻璃毛細管10-20ul薄壁塑料管50ul100 ul專用薄壁塑料管50ul100 ul石英玻璃管熒

18、光檢測靈敏度好，導熱快,試劑用量省 LC1.5與同質產(chǎn)品的對比項 目 RO項 目 ROCHE LightCycler 1.5 ABI ABI 7300 MJ OPTICON I 備 注 光路波長及熒光接收模式530nm,640nm,710nm.并解決相關熒光素熒光干擾問題，光電雜合模式 4通道，無顏色補償功能,CCD鏡頭模式(需使用Rox染料進行校正,占用一個通道,實際只有3個通道可用)1通道，無顏色補償功能,96個LED光源分別檢測LightCycler檢測波長經(jīng)過優(yōu)化，檢測范圍廣泛，通道間相距較遠，干擾最小，而且通過顏色補償功能可將干擾降到最低程度檢測方式 實時檢測在線觀測（每一循環(huán)光強度

19、變化，溫度變化，反應時間均可觀測）實時檢測在線觀測實時檢測在線觀測LightCycler可實時檢測整個PCR過程，也能在PCR運行中根據(jù)試驗需要進行實驗條件的調節(jié),使用靈活.試劑定量方法Hybridizationprobes(雜交探針):(定量和熔點曲線分析，擴增范圍100-1000bp）TaqMan 探針SYBRGREEN I分子航標TaqMan探針（定量，解鏈曲線分析,擴增范圍50-150bpSYBRGREEN I分子航標TaqMan探針（定量，解鏈曲線分析,擴增范圍50-150bpSYBRGREEN I分子航標LightCycler使用的熒光檢測模式最多，對于各種臨床檢測和科研實驗，應用

20、最為廣泛 動力學范圍10X 7X 7X LightCycler檢測線性范圍廣泛，無需特別處理樣本 項 目 ROCHE ABI LC2.0與同質產(chǎn)品的對比項 目 ROCHE LightCycler 2.0 ABI ABI 7500 MJ OPTICON 備 注 反應管反應體系(定量)石英玻璃毛細管10-100ul薄壁塑料管50ul100 ul專用薄壁塑料管50ul100 ul石英玻璃管熒光檢測靈敏度好，導熱快,試劑用量省 光路波長及熒光接收模式六通道，530nm,560nm,610nm,640nm,670nm,710nm.并解決相關熒光素熒光干擾問題，光電雜合模式五通道，無顏色補償功能,CCD鏡

21、頭模式(使用的探針染料增加 )2通道，無顏色補償功能,96個LED光源分別檢測LightCycler檢測波長經(jīng)過優(yōu)化，檢測范圍廣泛，通道間相距較遠，干擾最小，而且通過顏色補償功能可將干擾降到最低程度 LC2.0與同質產(chǎn)品的對比項 目 二、LC480LightCycler480實時熒光定量PCR系統(tǒng) 二、LC480LightCycler480實時熒光定量PC高靈敏 可檢測單拷貝基因動力學范圍廣 可檢測101010個拷貝高重復性 重復性高，CV0.3高分辨率 輕松區(qū)分1000拷貝以下2倍濃度差異高速 40分鐘完成40個PCR循環(huán)技術創(chuàng)新 采用Therma-BaseTM熱循環(huán)專利技術 和先進的光學檢

22、測系 統(tǒng)，徹底消除邊緣效應，保持穩(wěn)定優(yōu)異的檢測結果。靈活 分析模式多樣，絕對定量，相對定量，融解曲線分析等幾乎 適用所有的檢測模式（SYBR Green ，Taqman Probe， Hybprobe，SimpleProbe等）模塊化 可互換的96孔，384孔加熱模塊，用戶可以自助更換模塊， 不需要工程師到場自動化平臺 配以LIMS系統(tǒng)及自動進樣機械臂，可實現(xiàn)遠程操作及全 自動化運作用戶界面友好 軟件直觀簡潔，易操作LightCycler480系統(tǒng)主要特點高靈敏 可檢測單拷貝基因動力LightCycler480系統(tǒng)主要參數(shù)溫度控制3795 最大升溫速率4.8 最大降溫速率2.5 激發(fā)光源標準氙

23、燈檢測裝置冷CCD濾鏡激發(fā)波長（nm）：450，483，523，558，615 發(fā)射波長（nm）：500，533，568，610，640，670軟件功能絕對定量、Tm calling、含效率校正的相對定量、基因分型、產(chǎn)物鑒定等。LightCycler480系統(tǒng)主要參數(shù)溫度控制379 創(chuàng)新的PCR熱循環(huán)模塊設計Therma-BaseTM 是一個內(nèi)壁布滿燈芯狀毛細管結構的腔體，通過一系列的冷凝合蒸發(fā)，Therma-BaseTM 高效地傳遞熱量，從而實現(xiàn)整板最大的溫度均一性。Therma-BaseTM核心優(yōu)勢 優(yōu)異的空間溫度均一性 快速、準確的溫度調控 40個循環(huán)40分鐘(384孔板) 創(chuàng)新的PCR

24、熱循環(huán)模塊設計Therma-BaseTM羅氏實時熒光定量PCR儀分解課件先進獨特的光學系統(tǒng) LC480系統(tǒng)使用寬光譜、高強度的氙燈作為光源。激發(fā)光經(jīng)過多次反射后形成與孔板大小相同、光強均一的光柱，有效消除邊緣效應。激發(fā)波長和發(fā)射波長的任意組合，使得多種熒光染料和檢測模式可用于目前所有的實時熒光定量PCR實驗。 LC480光學系統(tǒng)的核心優(yōu)勢： 最靈活地選擇熒光染料及檢測模式 整板數(shù)據(jù)的精確捕獲 強大的多重PCR能力先進獨特的光學系統(tǒng) LC480系統(tǒng)使用 多檢測通道支持所有的檢測模式 LightCycler 480系統(tǒng)支持目前所有檢測模式的使用，包括雜交探針、SYBR Green I DNA結合染

25、色、單探針、水解探針和分子信標等等。多色熒光檢測系統(tǒng)，提供五色激發(fā)通道（450 nm, 483 nm, 523 nm, 558 nm, 615 nm）和六色熒光檢測通道（ 500 nm, 533 nm, 568 nm, 610 nm, 640 nm, 670 nm）,并具有顏色補償功能；可自由選擇，輕松實現(xiàn)多重或多色PCR。 多檢測通道支持所有的檢測模式 公認的性能獨特的軟件 基于用戶公認的LC480軟件，新的LC480軟件采用羅氏獨特的算法來進行高度精確、自動化的數(shù)據(jù)分析。而且，新軟件還提供了許多新的的特性，讓用戶能夠輕松、省時地處理高通量的實驗數(shù)據(jù)。 LC480軟件設計宗旨是為了用戶需求量

26、身定做。支持絕對定量、融解曲線分析、相對定量和自動基因分型等功能。 LC480軟件的核心優(yōu)勢：采用公認的優(yōu)秀算法來分析數(shù)據(jù)友好的用戶界面，簡單的快捷方式，便于進行高通量樣品編輯及數(shù)據(jù)處理。軟件模塊化，用戶可根據(jù)自己的研究情況選擇性安裝。 公認的性能獨特的軟件 基于用戶公認的LC羅氏實時熒光定量PCR儀分解課件模塊系統(tǒng)概念 LightCycler 480在系統(tǒng)初始配置的基礎上，還可根據(jù)客戶的特別要求，通過在系統(tǒng)中添加各種先進的軟件分析模塊進行系統(tǒng)升級，滿足用戶不同階段的研究需求。目前可提供的系統(tǒng)模塊包括： 定性檢測 絕對定量分析 相對定量分析 統(tǒng)計分析工具 基因分型研究模塊系統(tǒng)概念 LightC

27、ycler 480在系統(tǒng)初良好的兼容性 LightCycler 480可順利實現(xiàn)與現(xiàn)有實驗室系統(tǒng)聯(lián)結，包括LIMS或是與自動裝載微孔板的工作站聯(lián)用實現(xiàn)全流程的自動化操作。 LightCycler 480系統(tǒng)增強流程管理及數(shù)據(jù)管理的能力：實現(xiàn)真正的自動化流程現(xiàn)代化的軟件設計思路，可與LIMS連接兼容性符合數(shù)據(jù)管理要求（21 CFR-11條款）良好的兼容性 LightCycler 48 LightCycler 480系統(tǒng)自動化裝板過程 LightCycler 480系統(tǒng)自動化裝板過程 LightCycler480 與ABI 7900 HT 對比LightCycler480ABI 7900 HTPC

28、R專利 Roche擁有臨床和科研領域PCR專利 ABI從Roche僅獲得科研領域PCR使用授權 光源 氙光源，光源發(fā)光波長更廣范，強度更強，使得靈敏度達到最大化，通過折疊光路系統(tǒng)，激發(fā)光垂直射入每個反應孔位，使各孔位光強均一化，解決邊緣效應。氬離子激光光源，頂部激發(fā)光，各孔位有光程差，具有邊緣效應，需加入校正試劑光路波長 450nm、483nm、523nm、558nm、615nm五色熒光488nm（單一激發(fā)光波長，對很多熒光素不適用）檢測系統(tǒng) CCD成像系統(tǒng)，500nm、533nm、568 nm、610nm、640nm、670nm六個檢測通道，具有顏色補償功能，解決熒光素干擾問題。CCD 成像系統(tǒng)，通過光柵在500660nm連續(xù)檢測。無顏色補償功能。（采用普通TaqMan探針技術只能進行雙色或三色實驗）加熱方式 采用therma-base專利技術的半導體加熱，解決模塊加熱的邊緣效應，保證每個孔位受熱的均一性。半導體加熱，熱傳導最高速率3/秒，加熱模塊具有邊緣效應，中心與周邊孔位受熱不均一加熱模式 *96孔/384孔模塊式加熱。*加熱模塊更換簡便，樣本加熱模塊與相應 熱蓋成套更換，溫控效果更佳，無需進行熒 光素校正。