z2.1-8第二章 基因工程(1-8)課件

1、基因工程制藥張金國歡迎大家學習生物技術制藥第二章10/14/20221Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics第二章 基因工程制藥（8學時）第一節(jié)概述第二節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的過程第三節(jié)目的基因的獲得第四節(jié)基因表達第五節(jié)基因工程菌生長代謝的特點第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性第七節(jié)基因工程菌中試第八節(jié)重組工程菌的培養(yǎng)第九節(jié)高密度發(fā)酵第十節(jié)基因工程藥物的分離純化第十一節(jié)變性蛋白的復性第十二節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制第十三節(jié)基因工程藥物的制造實例10/14/20222Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics用途：主要用于癌癥、人類免

2、疫缺陷病毒性疾病、心血管疾病、糖尿病、貧血和許多遺傳疾病的治療。獲取方式：生化提取 基因工程表達 成本高產(chǎn)量低質(zhì)量難以保證成本低產(chǎn)量高活性強性質(zhì)優(yōu)實例：人生長激素（侏儒癥）50 具新鮮尸體腦下垂體中提取采用基因工程從 12 升細菌培養(yǎng)液中提取獲得=10/14/20223Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics1982年世界上第一個基因工程藥物 重組人胰島素獲準生產(chǎn)銷售，至今已有 100 多個生物技術藥物上市;促紅細胞生成素（EPO）以全球銷售額 38 億美元的業(yè)績，居全球最暢銷 10 種藥物的第6名；美國是現(xiàn)代生物技術的發(fā)源地，一直穩(wěn)居生物技術藥物研發(fā)榜首

3、,其 2002 年產(chǎn)值和銷售額已超過 200 億美元;1989年我國第一個擁有自主知識產(chǎn)權的基因工程藥物 - 重組人干擾素（IFN1b）上市以來，目前，世界上銷售額排前 10 位的生物技術藥物我國已能生產(chǎn)8種。國內(nèi)外基因工程藥物發(fā)展現(xiàn)狀10/14/20224Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics第一節(jié) 概 述生物技術的核心就是基因工程，20世紀70年代基因工程誕生,最先應用在醫(yī)藥科學領域。傳統(tǒng)生物藥物存在問題：由于來源及制備上的困難、價格等因素的影響；制備過程易受到的病毒、衣原體、支原體等的感染。 如：生長激素抑制素 1 mg 傳統(tǒng)法：10萬只羊的下丘腦

4、，現(xiàn)：10 L大腸桿菌培養(yǎng)液，0.3美元/mg；尿激酶從男性尿中提??；胎盤丙種球蛋白從胎盤中提取。韓國從中國進口的藥物中檢查出人DNA？10/14/20225Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics利用基因工程技術生產(chǎn)藥品的優(yōu)點：（1）可以大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（如胰島素、干擾素、細胞因子等），為臨床使用提供有效的保障；（2）可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理、生化和結構進行深入的研究，從而擴大這些物質(zhì)的應用范圍；（3）利用基因工程技術可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；10/14/20227Zhang-JG Biotech

5、nological Pharmaceutics（4）內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時存在的不足之處，可通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進行改造和去除。如白細胞介素-2的半胱氨酸改為絲氨酸或丙氨酸，白細胞介素-2的活性以及熱穩(wěn)定性均有提高；（5）利用基因工程技術可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源。利用基因工程技術生產(chǎn)藥品的優(yōu)點：10/14/20228Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics基因工程藥物生產(chǎn)的上游和下游上游階段：主要指的是目的基因分離、工程菌（或細胞）構建。上游階段的工作主要在實驗室內(nèi)完成；下游階段：是從工程菌（或細胞）的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純

6、化、質(zhì)量控制等。10/14/202210Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics獲得目的基因組建重組質(zhì)粒培養(yǎng)工程菌構建基因工程菌或細胞產(chǎn)物分離純化除菌過濾半成品檢定包裝成品檢定基因工程藥物制備的一般過程(p16)10/14/202211Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics基因工程基本過程切接轉(zhuǎn)增檢10/14/202212Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics逆轉(zhuǎn)錄法的步驟 1、mRNA的純化 2、cDNA第一鏈的合成 3、cDNA第二鏈的合成 4、cDNA克隆 5、將重組體導

7、入宿主細胞 6、cDNA文庫的鑒定 7、目的cDNA克隆的分離和鑒定10/14/202214Zhang-JG Biotechnological PharmaceuticscDNA克隆示意圖mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶ss-DNADNA聚合酶IKlenow片段ds-cDNAds-cDNA核酸酶S110/14/202215Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics3、cDNA第二鏈的合成除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈(堿解或RNaseH酶解)然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。由于第一鏈cDNA鏈3-末端往往形成一個發(fā)夾形結構，所以，可以從這一點開始合成cDN

8、A第二鏈(常用Klenow酶或DNA聚合酶I)切除發(fā)夾結構（核酸酶S1，專一性切除單鏈DNA）10/14/202217Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics4、cDNA克隆用于cDNA克隆的載體有三類： 細菌質(zhì)粒（如pBR322、 pUC等）插入片段10kb 動植物病毒 根據(jù)重組后插入的cDNA能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì) 非表達型載體（pBR322及gt10 ） 表達型載體（pUC及gt11 ）有利于目的基因的篩選 10/14/202218Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics5、將重組體導入宿主細胞1）轉(zhuǎn)化：指質(zhì)

9、粒DNA 或以它為載體構建的重組DNA 導入細菌的過程。 2）轉(zhuǎn)染：指病毒或以它為載體構建的重組子導入真核細胞的過程。 脂質(zhì)體介導： 原生質(zhì)體融合： 電穿孔： 顯微注射： 基因槍： 病毒介導：10/14/202219Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics6、cDNA文庫的鑒定（1）表型改變：根據(jù)重組體的表型進行篩選，抗生素抗性（抗性基因失活和菌落或噬菌斑顏色改變） （2）結構特征： DNA大小、酶切圖譜、雜交（核酸、蛋白）、PCR檢測、DNA序列分析（3）免疫化學檢測：表達產(chǎn)物分析10/14/202220Zhang-JG Biotechnological

10、 Pharmaceutics7、目的cDNA克隆的分離和鑒定從cDNA文庫中分離特異的cDNA克隆，主要采用：（1）核酸探針雜交法。 根據(jù)目的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，人工合成相應的單鏈寡核苷酸作為探針，從cDNA文庫中分離特異cDNA克隆。（2）免疫反應鑒定法。 用表達型載體構建的cDNA文庫，可用免疫學方法分組逐一鑒定各cDNA的表達產(chǎn)物，即以某種蛋白質(zhì)的抗體尋找相應的特異cDNA克隆。10/14/202221Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics分離得到含有目的基因的陽性克隆后，必須對其作進一步的驗證和鑒定（限制酶圖譜、基因測序等）。 不需合成第二鏈mR

11、NA逆轉(zhuǎn)錄酶ss-DNAPCR特異引物目的cDNA鏈 1985，PCR發(fā)明以后，RT-PCR得到了廣泛的應用。二、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應法（ RT-PCR ）10/14/202222Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics第四節(jié) 基因表達 基因表達：是指結構基因在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。 基因高效表達：將外源基因片段拼接到另一個基因表達體系中，使即獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達產(chǎn)物。 最佳的基因表達體系：生物活性高、表達產(chǎn)量高、表達產(chǎn)物穩(wěn)定、表達產(chǎn)物容易分離純化。10/14/202224Zhang-JG Biotechnological Pharm

12、aceutics一、宿主細胞的選擇 1、培養(yǎng)容易、生長快速； 2、容易獲得較高濃度的細胞； 3、能利用易得廉價原料； 4、不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素； 5、發(fā)熱量低、需氧低、適當?shù)陌l(fā)酵溫度； 6、容易進行DNA重組技術操作； 7、產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高； 8、產(chǎn)物容易提取純化。10/14/202225Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics1、原核細胞 大腸桿菌：基因工程研究中采用最多的原核表達體系。 優(yōu)點：生長快速、代謝簡單、遺傳體系清楚、容易操作、細胞破碎容易。 缺點： 不存在導向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號序列，分泌能力不足，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難； 蛋白表達后不能修飾加

13、工（糖基化等）； 產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個蛋氨酸殘基，能引起免疫反應； 內(nèi)毒素存留。 10/14/202227Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 枯草芽胞桿菌： 分泌能力強，蛋白質(zhì)不形成包含體。產(chǎn)物蛋白質(zhì)不能糖基化。有很強的胞外蛋白酶對產(chǎn)物降解。 鏈霉菌： 作為外源性基因表達受到重視。不致病、使用安全、分泌能力強、表達產(chǎn)物可糖基化。10/14/202228Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics2、真核細胞 酵母 是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。其基因組小，世代時間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒

14、性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功表達。10/14/202229Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 絲狀真菌 優(yōu)點：分泌能力強，能正確進行翻譯后加工（肽剪切、糖基化）有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。 哺乳動物細胞 優(yōu)點：表達產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化細胞分泌到培養(yǎng)液中，純化容易。產(chǎn)物是糖基化的接近天然物。 缺點：生長慢，生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃度稀。10/14/202230Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics二、大腸桿菌體系中的基因表達（了解）（一）表達載體表達載體必須具備的條件（1）載體能獨立

15、地進行復制 (復制起點，ori)（2）應具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記，以利于外源基因的克隆、鑒定和篩選，且克隆位點位于啟動子序列后，以便外源基因表達。（3）應具有很強的啟動子，能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識別。10/14/202231Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics（4）應具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當誘導時才進行轉(zhuǎn)錄。 外源基因的高效表達往往會抑制宿主細胞的生長、增殖，而阻遏子可使宿主細胞免除此不良影響（5）應具有很強的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其他無關的基因，同時，很強的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為

16、穩(wěn)定。（6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，即起始密碼AUG和SD序列,以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。 如：在大腸桿菌中表達非融合蛋白的操縱子必須改建成：細菌啟動子 細菌SD序列 起始密碼子 結構基因 終止子。 10/14/202232Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體和病毒等質(zhì)粒載體質(zhì)粒（plasmid）是細菌或細胞染色質(zhì)以外的、能自主復制的、與細菌或細胞共生的遺傳成分。其特點如下： 染色質(zhì)外的雙鏈共價閉合環(huán)形DNA。自然形成超螺旋結構，不同質(zhì)粒大小在2300kb之間， 15kb的小質(zhì)粒比較容易分離純化，15kb的大質(zhì)粒則不

17、易提取。能自主復制。質(zhì)粒對宿主生存并不是必需的。10/14/202233Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics質(zhì)粒(plasmid ) 的生物學特性獨立于染色體外能夠進行自我復制的雙鏈DNA分子。10/14/202234Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics常用表達載體 pBV220系統(tǒng)啟動子多克隆位點終止子阻遏子P23復制起始位點 它已成功地表達了人白細胞介素2，干擾素和腫瘤壞死因子等外源基因。 氨芐青霉素抗性基因 限制性內(nèi)切酶 SD序列10/14/202235Zhang-JG Biotechnological

18、Pharmaceutics pBV220系統(tǒng)優(yōu)點： cIts857阻遏子基因與PL啟動子同在一個載體上，可以轉(zhuǎn)化任何菌株，以便選用蛋白酶活性較低的宿主細胞，使表達產(chǎn)物不易降解。 SD序列緊跟多克隆位點，便于插入帶起始ATG的外源基因，可表達非融合蛋白； 強的轉(zhuǎn)錄終止信號可防止出現(xiàn)“通讀”現(xiàn)象，有利于質(zhì)粒-宿主系統(tǒng)的穩(wěn)定；10/14/202236Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 整個質(zhì)粒僅為3.66kb，有利于增加其拷貝數(shù)及容量，可以插入大片段外源基因； PR和PL啟動子串聯(lián)，可以增強啟動作用； 本系統(tǒng)為溫度誘導，外源基因表達量可達細胞總蛋白的20%

19、30%；產(chǎn)物以包含體形式存在不易降解均一性好。10/14/202237Zhang-JG Biotechnological PharmaceuticsPR 和 PL啟動子 選用溫度敏感突變體 cIts857 的基因產(chǎn)物來調(diào)控 PL、PR 啟動子的轉(zhuǎn)錄。 在較低溫度（30）時以活性形式存在 在較高溫度（42）時失活脫落PL、PRcIts85710/14/202238Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics pBG-2是由pBV220系統(tǒng)衍生的便于產(chǎn)物純化的融合表達載體。 該質(zhì)粒在PRPL啟動子下游插入G蛋白中與IgG Fc段結合的結構域基因片段180個核苷酸，

20、下游是多克隆位點，引入了剪切融合蛋白的切點，具有與IgG結合的活性，可用親和層析。簡化下游工藝。pBG-210/14/202239Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics（二）影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素 外源基因表達產(chǎn)量與細胞濃度和單個細胞平均表達產(chǎn)量呈正相關。單個細胞產(chǎn)量取決于：外源基因的劑量（拷貝數(shù)）質(zhì)粒的擴增過程通常發(fā)生在受體細胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時正是細菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達勢必會影響受體細胞的生長代謝，進而導致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達水平的下降解決上述難題的一種有效策略是將重組

21、質(zhì)粒的擴增納入可控制的軌道10/14/202240Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 外源基因的表達效率外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理 啟動子 終止子 核糖體結合位點 密碼子 轉(zhuǎn)錄翻譯10/14/202241Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 啟動子和終止子的強弱； 大腸桿菌高效表達需要強的啟動子和終止子。 外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即 RNA 聚合酶滑過終止子結構繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的 DNA 序列，形成長短不一的 mRNA 混合物過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的

22、表達。 對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結構，以增強其轉(zhuǎn)錄終止作用。 10/14/202242Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與 mRNA 的翻譯起始效率密切相關。 mRNA 翻譯的起始效率主要由其 5 端的結構序列（消除二級結構）所決定，稱為核糖體結合位點（RBS）。 核糖體結合位點的有效性10/14/202243Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics SD 序列與翻譯起始密碼子之間的距離 SD序

23、列與起始密碼子AUG之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子 AUG 正好處于核糖體復合物結構中的 P 位，這是翻譯啟動的前提條件。在很多情況下，SD 序列位于 AUG 之前大約7個堿基處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均會導致翻譯起始效率不同程度的降低。 10/14/202244Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics生物體對密碼子的偏愛性由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。 一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密

24、碼子在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達： 外源基因全合成 同步表達相關 tRNA 編碼基因密碼子組成10/14/202245Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性 組建融合蛋白； 利用大腸桿菌的信號肽或真核多肽中自身的信號肽； 采用位點突變的方法； 選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細胞，可能會減弱表達產(chǎn)物的降解。10/14/202246Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics細胞代謝負荷外源基因的表達產(chǎn)物屬于異己物質(zhì)，并可能對宿主細胞有毒性。調(diào)節(jié)表達物質(zhì)的積累與細胞的生長和代謝之間的平衡有利于外源基因的高效

25、表達。另外通過將細胞的生長和外源基因的表達分成兩個階段，或?qū)⑺拗骷毎纳L與重組質(zhì)粒的復制分開兩種手段也可以減輕細胞代謝的負荷。形成不溶性的包含體可以降低表達產(chǎn)物對宿主細胞的毒害作用10/14/202247Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics工程菌的培養(yǎng)條件 除宿主、載體和克隆基因三者之間的關系影響外源基因的高水平表達外，培養(yǎng)條件亦是非常值得研究的因素。以后會對其進行詳細的介紹。10/14/202248Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics（三）真核基因在大腸桿菌中的表達形式 以融合蛋白的形式表達藥物基因 以原核

26、多肽和真核蛋白結合在一起稱融合蛋白。 優(yōu)點：操作簡便，表達蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實現(xiàn)高效表達； 缺點：只能作抗原用。10/14/202249Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 以非融合蛋白的形式表達藥物基因 非融合蛋白指在大腸桿菌中表達的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細菌多肽序列。 優(yōu)點：保持原有蛋白活性； 缺點：易被蛋白酶破壞。10/14/202250Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 分泌型表達蛋白藥物基因 優(yōu)點：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含蛋氨酸殘基； 缺點：產(chǎn)量不高， 信號肽不

27、被切割。10/14/202251Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics三、酵母中的基因表達（了解）（一）表達載體 酵母載體是可以攜帶外源基因在酵母細胞內(nèi)保存和復制，并隨酵母分裂傳遞到子代細胞的DNA或RNA單位。1.載體的復制序列 酵母附加體質(zhì)粒（yeast episomal plasmid， Yep類） 酵母復制型質(zhì)粒（yeast replication plasmid， Ypp類）酵母著絲粒質(zhì)粒（yeast centromeric plasmid， YCp類）酵母整合型質(zhì)粒（yeast inteegrative plasmid， YIp類） 10/1

28、4/202252Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics (1) 克隆載體 從大腸桿菌中制備質(zhì)粒比從酵母中容易得多，因此酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過大腸桿菌進行的，只有在最后階段才轉(zhuǎn)入酵母中，這就要求酵母載體也同時具有在大腸桿菌中復制和增殖的能力。 (2) 表達載體 將酵母菌的啟動子和終止子等有關控制序列引入載體的適當位點后，就構成了酵母菌的表達載體。 10/14/202253Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 普通表達載體，只能方便地引入外源基因并進行表達，對表達產(chǎn)物的組成，特別是對其N末端氨基酸是否增減并

29、無嚴格要求。 精確表達載體，要求在啟動子或信號肽編碼序列的適當部位有內(nèi)切酶點，以利于接入外源基因，并使他在表達后加工后N末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基酸。10/14/202254Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics影響目的基因在酵母菌中表達的因素 外源基因的劑量 高穩(wěn)定的高拷貝數(shù)的質(zhì)粒可使外源基因高效表達，但高拷貝數(shù)通常會引起細胞生長量的降低；而單拷貝數(shù)的質(zhì)粒對細胞的最大生長沒有影響，因而也能達到高效表達。 外源基因的表達效率 啟動子(組成型和誘導型)分泌信號的效率終止序列的影響 外源基因表達產(chǎn)量與細胞濃度和單個細胞平均

30、表達產(chǎn)量呈正相關。單個細胞產(chǎn)量取決于：10/14/202255Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 外源蛋白的糖基化 外源蛋白經(jīng)釀酒酵母糖基化后，可靠有效地以活性型分泌到培養(yǎng)基中；某些蛋白質(zhì)糖基化后更加穩(wěn)定，便于分離精制。 宿主菌株的影響菌體生長力強 菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱 菌體性能穩(wěn)定 常用的幾乎是突變株，避免使用回復突變率高的不穩(wěn)定體系；最好使用二倍體或多倍體菌株；分泌能力強(5) 培養(yǎng)條件10/14/202256Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics主要基因工程表達體系比較表達體系 產(chǎn) 物 產(chǎn)生部位 培養(yǎng)方式

31、 提 純 產(chǎn)物活性 潛在危性大腸桿菌 多肽蛋白質(zhì) 菌體內(nèi) 容易 一般 對原核好 不大 融合蛋白質(zhì) 部分高產(chǎn) 對真核差 酵 母 多肽蛋白質(zhì) 菌體內(nèi) 容易 菌體內(nèi) 真核的接近 不大 糖基化蛋白 外分泌 可高產(chǎn) 稍復雜 天然產(chǎn)物 哺乳動物 完 整 外分泌 較難成本高 簡單 可達天然 需注意 糖基化蛋白 可高產(chǎn) 產(chǎn)物 致癌10/14/202257Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics第五節(jié) 基因工程菌生長代謝的特點菌體生長是菌體各成分尤其是生物大分子核酸和蛋白質(zhì)合成的綜合表現(xiàn)，通常用比生長速率表示。 比生長速率:每小時單位質(zhì)量的菌體所增加的菌體量稱為菌體比生長速

32、率。它是表征微生物生長速率的一個參數(shù)，也是發(fā)酵動力學中的一個重要參數(shù)。工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源、控制補料和稀釋速率等方法來控制菌體的生長。 控制菌體的生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物積累、提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義。10/14/202258Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics一、菌體的生長與能量的關系碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。碳源物質(zhì)為細胞提供能量，當菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時，菌體會產(chǎn)生乙酸，導致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長。適當提高pH，可減少乙酸的抑制作用10/14/202259Zhang-JG Bi

33、otechnological Pharmaceutics 分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。 加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。10/14/202260Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的透明顫菌血紅蛋白（VHB蛋白）的基因可提高菌體生長速率。 采用磷酸乙?；溉毕葜曜鳛樗拗骷毎柚挂阴］o酶A 乙酸產(chǎn)生，可提高產(chǎn)量。10/14/202261Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics二、菌體生長與前

34、體供應的關系 在基礎培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體蛋白合成增加，比生長率提高。 基因工程菌質(zhì)粒的表達需與宿主細胞競爭共同的前體和催化結構，致工程菌生長速率降低。10/14/202262Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響： 中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關的酶增加，其質(zhì)粒對工程菌的生長影響不大。 高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝），生長速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程菌大量前體被利用引起前體不足，從而產(chǎn)生“嚴緊反應”有關。 10/14/202263Zhang-JG Biotechnological P

35、harmaceutics嚴緊反應 “嚴緊反應”是當氨酰tRNA不足時,核糖體在密碼子上停留,并合成被稱為魔點的ppGpp的結果。 ppGpp（鳥苷四磷酸；3，5各自連接兩個磷酸),）是一個重要的調(diào)控分子。它通過影響RNA鏈的延深過程減少轉(zhuǎn)錄。10/14/202264Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 基因工程菌的不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：一、質(zhì)粒的不穩(wěn)定性 分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。 結構不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。第六節(jié) 基因工程

36、菌的不穩(wěn)定性10/14/202265Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics影響質(zhì)粒分裂不穩(wěn)定的因素：含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率； 這兩種菌比生長速度率差異的大小。 10/14/202266Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1.選擇合適的宿主菌受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組 DNA 分子的降解2.選擇合適的載體低拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率高，增加工程菌質(zhì)?？截悢?shù)可提高穩(wěn)定性；高拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率低，但如果提高質(zhì)?？截悢?shù)，可能抑制菌體生長，對穩(wěn)定性不利。

37、提高生長速率，拷貝數(shù)下降，質(zhì)粒穩(wěn)定性提高。10/14/202267Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics3.施加選擇壓力 根據(jù)載體上的抗藥性標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應的抗生素 加入大量的抗生素會使生產(chǎn)成本增加 加一些容易被水解失活的抗生素，只能維持一定時間 添加抗生素選擇壓力對質(zhì)粒結構不穩(wěn)定無能為力 載體上的營養(yǎng)缺陷型標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應的營養(yǎng)組份：培養(yǎng)基復雜，成本較高10/14/202268Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics4.分階段控制培養(yǎng) 因外源基因表達造成質(zhì)粒不穩(wěn)定時，可以考慮將發(fā)酵過程分階段控制

38、。 在生長階段使外源基因處于阻遏狀態(tài)，避免因表達造成不穩(wěn)定性問題的發(fā)生；在獲得需要的菌體密度后，再去阻遏或誘導外源基因表達。 連續(xù)培養(yǎng)時可以考慮采用多級培養(yǎng)，如在第一級進行生長，維持菌體的穩(wěn)定性，在第二級進行表達。10/14/202269Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics5.控制培養(yǎng)條件 工程菌的培養(yǎng)條件對其質(zhì)粒的穩(wěn)定性和表達效率影響很大 可調(diào)控的環(huán)境參數(shù)為：培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)溫度、pH 和溶解氧濃度。有些含質(zhì)粒的菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反應慢，因而采用間隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌的比生長速率，從而改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性。通過間隙供氧的方法和

39、通過改變稀釋速率的方法都可提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。 培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定 培養(yǎng)溫度： 較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定10/14/202270Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 6. 固定化 固定化可以提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性 基因重組大腸桿菌進行固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及目的產(chǎn)物的表達率都有了很大提高。 在游離重組菌系統(tǒng)中常用抗生素，氨基酸等選擇性壓力穩(wěn)定質(zhì)粒的手段，往往在大規(guī)模生產(chǎn)中難以應用。而采用固定化方法后，這種選擇壓力則可被省去。 不同的宿主菌及質(zhì)粒在固定化系統(tǒng)中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。10/14/202271Zhan

40、g-JG Biotechnological Pharmaceutics 中試是上游技術與工業(yè)化生產(chǎn)的連接環(huán)節(jié)，其目的在于考察一個上游構建成功的重組菌種是否適合未來的產(chǎn)業(yè)化。 另外，通過中試還可以獲得大量的產(chǎn)品供臨床試驗，同時中試所得的相關培養(yǎng)、發(fā)酵、純化等工藝參數(shù)可以做為生產(chǎn)設計時的參考。第七節(jié) 基因工程菌的中試10/14/202272Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics中試應考慮的問題：工程菌是否適宜商品化發(fā)酵反應器設計反應過程選擇發(fā)酵培養(yǎng)條件生產(chǎn)工藝最佳方法優(yōu)化工藝監(jiān)測方法工藝控制方法工藝自動化使用方法生物催化劑使用方法（如果有的話）產(chǎn)品提取方法分

41、離精制技術等。10/14/202273Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics一、工程菌選擇： 用于中試的工程菌需具備的條件： 1、能用一般基因重組技術獲得 2、有高產(chǎn)潛力 3、能以工業(yè)原料為培養(yǎng)基，主要是碳源 4、生產(chǎn)工藝不復雜 5、能產(chǎn)生和分泌蛋白質(zhì)（細胞外分泌） 6、不致病、無毒性 7、能安全生產(chǎn)、符合國家衛(wèi)生部門規(guī)定 8、代謝可控性，產(chǎn)品有特異性 9、發(fā)酵液粘度小等10/14/202274Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics二、反應器（發(fā)酵罐）設計 符合生物反應和化學工程需要。 設計基礎：5種生物數(shù)據(jù)：培養(yǎng)

42、細胞系特性、細胞生長率、發(fā)酵罐消毒方法、溫度pH溶氧二氧化碳及代謝產(chǎn)物、后處理效果。 設計中應考慮的問題：根據(jù)實驗條件需要，能連續(xù)發(fā)酵（也可分批發(fā)酵），并附有加料管取料管及測量儀表，易安裝及移動，儀表所得數(shù)據(jù)可靠，數(shù)據(jù)重復性好，可任意安裝附件，罐體材質(zhì)好并打光，避免殘渣積存。10/14/202275Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics三、發(fā)酵培養(yǎng)基組成： 1、化學元素：細胞生長必需的碳、氮、氧、氫、磷及一些微量元素和金屬離子。 2、特殊營養(yǎng)源：氨基酸、維生素等。 3、能源：葡萄糖等。 4、代謝控制物：生物活性物質(zhì)，或者改變溫度、pH值、誘導菌種改變生長

43、速度或代謝途徑等，目的為增加產(chǎn)量。注意：工業(yè)化生產(chǎn)用培養(yǎng)基以工業(yè)原料為主，以降低生產(chǎn)成本，所以中試時就要進行培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件探索。10/14/202276Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics四、工藝最佳化與參數(shù)監(jiān)測控制 1、工藝最佳化：指最快周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)量、最低能耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果、最佳化速度、最低失敗率等。 只有在掌握菌種生物特性和發(fā)酵工藝參數(shù)了如指掌，才能設計出最佳生產(chǎn)工藝。 2、參數(shù)監(jiān)測控制：四種需要監(jiān)測的參數(shù) 主要參數(shù)：pH、溫度、溶氧、二氧化碳 生物量：渾濁度、細胞組分、總氮量及菌絲干重。 碳源：糖、有機酸、乙醇、

44、淀粉、脂質(zhì) 產(chǎn)品：形成時間、形式、性狀等 全自動化控制 10/14/202277Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics五、計算機的應用：全自動化控制的基礎 熱電耦電極溫度 離子敏感電極離子 pH電極pH 氧化還原電極還原電位 熱量計熱平衡 可以儲存于計算機通過計算機計算、對比、優(yōu)化選擇提高產(chǎn)品產(chǎn)量與質(zhì)量、降低原材料與能源消耗、降低成本最終模擬出一個高產(chǎn)、高質(zhì)、低成本生產(chǎn)工藝最佳化的控制微生物數(shù)學公式并實際運用。10/14/202278Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 培養(yǎng)工藝是發(fā)酵工藝的重要組成部分，對外源蛋

45、白的表達至關重要，直接影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，從而影響產(chǎn)品成本及市場競爭力。 最佳的培養(yǎng)工藝還要考慮對純化工藝的影響。第八節(jié) 基因工程菌的培養(yǎng)10/14/202279Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics菌種 一級種子搖瓶 二級種子罐培養(yǎng) 擴大培養(yǎng) 原料 發(fā)酵培養(yǎng) 滅菌 發(fā)酵生產(chǎn) 代謝產(chǎn)物分離 基配制 微生物工業(yè)發(fā)酵過程簡圖10/14/202280Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics基因工程菌的發(fā)酵工藝 傳統(tǒng)微生物發(fā)酵工藝 材料 含有帶外源基因重組載體的微生物 不含外源基因的微生物目的 使外源基因高效表達，盡量減少

46、 自身基因表達所產(chǎn)生 宿主本身蛋白的污染 初級或次級代謝產(chǎn)物10/14/202281Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics一、基因工程菌的培養(yǎng)方式： 1、分批培養(yǎng)：培養(yǎng)基的量一次性加入，產(chǎn)品一次性收獲,分批培養(yǎng)操作簡單，但因不能控制生長，獲得的菌體密度也有限。 2、補料分批培養(yǎng)：在一次投料發(fā)酵的基礎上，流加一定量的營養(yǎng)，使細胞進一步的生長，可得到更多的代謝產(chǎn)物。 3、連續(xù)培養(yǎng)：不斷地流加營養(yǎng)，并不斷地取出發(fā)酵液。連續(xù)培養(yǎng)則多用于動力學特性和穩(wěn)定性等研究。 4、透析培養(yǎng)： 5、固定化培養(yǎng)：10/14/202282Zhang-JG Biotechnologi

47、cal Pharmaceutics補料分批培養(yǎng) 補料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應器中進行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的培養(yǎng)方法。 在分批培養(yǎng)中，為保持基因工程菌生長所需的良好微環(huán)境，延長其生長對數(shù)期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和流加補料措施結合起來，根據(jù)基因工程菌的生長規(guī)律來調(diào)節(jié)補料的流加速率。基因工程菌培養(yǎng)方式10/14/202283Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics連續(xù)培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達到一定程度后，開動進料和出料蠕動泵，以一定稀釋率進行不間斷培養(yǎng)。 但是由于基因工

48、程菌的不穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)比較困難。為了解決這一問題，人們將工程菌的生長階段和基因表達階段分開，進行兩階段連續(xù)培養(yǎng)?；蚬こ叹囵B(yǎng)方式10/14/202284Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics透析培養(yǎng) 透析培養(yǎng)技術是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，其主要目的是通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響。發(fā)酵液透析過的發(fā)酵液透析膜乙酸養(yǎng)分代謝產(chǎn)物基因工程菌培養(yǎng)方式10/14/202285Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics固定化培養(yǎng) 基因工程菌培養(yǎng)的一大難題是如何維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。有人將固定化技

49、術應用到這一領域，發(fā)現(xiàn)基因工程菌經(jīng)固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對分泌型菌更為有利。由于這一優(yōu)點，基因工程菌固定化培養(yǎng)研究已得到迅速開展?；蚬こ叹囵B(yǎng)方式10/14/202286Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics二、基因工程菌的發(fā)酵工藝影響基因工程菌的培養(yǎng)因素：1、培養(yǎng)基：選擇好2、接種量的影響：確定接種量是否優(yōu)化；3、溫度：選擇適當?shù)臏囟?、溶解氧的影響5、誘導時機的選擇6、誘導表達程序的影響7、pH的影響10/14/202287Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics1.培養(yǎng)基的影

50、響培養(yǎng)基的組成既要能提高工程菌的生長速率，又要保持重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性，使外源基因能夠高效表達。 碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。 氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿和 氨水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等。 其它：無機鹽、微量元素、維生素、生物素等。 二、基因工程菌的培養(yǎng)工藝10/14/202288Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長速率，又要保持工程菌的穩(wěn)定性，使外源基因高效表達。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、氨水、

51、硫酸銨、氯化銨等。還有無機鹽、維生素等。10/14/202289Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics不同的碳源對菌體的生長和外源基因表達有較大的影響。使用葡萄糖和甘油對菌體比生長速率及呼吸強度相差不大。但使用甘油菌體得率較大，而使用葡萄糖菌體產(chǎn)生的副產(chǎn)品較多。葡萄糖對lac啟動子有阻遏作用。乳糖對lac啟動子有利。10/14/202290Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics在氮源中，酪蛋白水解物有利于產(chǎn)物的合成與分泌。色氨酸對trp啟動子控制的基因有影響。無機磷在許多代謝反應中是一個效應因子，磷濃度不同，影響菌

52、體生長。10/14/202291Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics接種量的影響接種量是指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。接種量小，菌體延遲期較長，使菌齡老化，不利于外源基因表達。10/14/202292Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics接種量大，可縮短生長延遲期，菌體迅速繁衍，很快進入對數(shù)生長期，適于表達外源基因。接種量過高，使菌體生長過快，代謝物積累過多，反而會抑制后期菌體的生長。10/14/202293Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 溫度的影響 溫度對基因表達的調(diào)控作用發(fā)生在復制轉(zhuǎn)錄翻譯和小分子調(diào)節(jié)分子的合成等水平上。溫度對發(fā)酵過程的影響是多方面的。它影響各種酶的反應速度，改變菌體代謝產(chǎn)物的反應方向，影響代謝調(diào)控機制。10/14/202294Zhang-JG Biotechnological Pharmaceutics 適宜的發(fā)酵溫度是既適合菌體的生長，又適合代謝產(chǎn)物合成的溫度。高溫或低溫都會使發(fā)酵異常，影響終產(chǎn)物的形成并導致減產(chǎn)。溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成