蛋白質(zhì)組研究技術(shù)課件

1、第三章 蛋白質(zhì)組研究方法 Chapter 3 Research Methods in Proteomics察頤堅(jiān)猙棟浴摘宅生倫紙弗湃鵲顧嘗傍紙喻夾勤毛秒撇譴喜顴盆軟陽熾題3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)第三章 蛋白質(zhì)組研究方法 Chapter 3 Res主 要 內(nèi) 容蛋白質(zhì)研究方法的概述大規(guī)模的蛋白質(zhì)分離技術(shù)高通量蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)媒窿慣旋叭侯隱眠賃輸侮餾置汐進(jìn)姐乘湯炎銅酉壩扭擰井盯負(fù)箱易彬魚掃3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)主 要 內(nèi) 容蛋白質(zhì)研究方法的概述媒窿慣旋叭侯隱眠賃輸?shù)谝还?jié) 概述瘓移瞳韭呸椅窒膀條消幟攫鄲領(lǐng)刮垛研卜挑住擋銹所敢眨歲倘陰閘哼手處3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)

2、第一節(jié) 概述瘓移瞳韭呸椅窒膀條消幟攫鄲領(lǐng)刮垛研卜挑住擋銹一、蛋白質(zhì)組的研究遠(yuǎn)比基因組的研究要復(fù)雜的多蛋白質(zhì)的數(shù)目遠(yuǎn)大于基因的數(shù)目：基因的拼接和翻譯后修飾蛋白質(zhì)是動(dòng)態(tài)/基因是相對(duì)靜態(tài)的氨基酸種類遠(yuǎn)多于核苷酸種類技術(shù)手段上：基因研究有PCR、DNA自動(dòng)測(cè)序技術(shù)、DNA微陣列技術(shù)等；蛋白質(zhì)沒有相匹配的技術(shù)臭住遞逛生桌些噴亞齲縮礫看栓成荔造擺兄產(chǎn)枝七巢盅酣編赤安氓薩寨瘸3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)一、蛋白質(zhì)組的研究遠(yuǎn)比基因組的研究要復(fù)雜的多臭住遞逛生桌些噴DNA蛋白質(zhì)檢測(cè)水平/靈敏度可用PCR技術(shù)擴(kuò)增檢測(cè)限約為30個(gè)拷貝/樣本無法被擴(kuò)增檢測(cè)方法高度特異DNA與其互補(bǔ)序列（DNA/RNA）的雜交

3、能力使得DNA很容易固相化在靶上并用熒光探針檢測(cè)。高密度陣列檢測(cè)專用的掃描儀已經(jīng)出現(xiàn)非特異蛋白質(zhì)可以用非特異的方法如蛋白染色或較特異的方法如抗體進(jìn)行檢測(cè)分子的穩(wěn)定性DNA是非常穩(wěn)定的，即使在提高溫度的情況下也不丟失生物活性蛋白質(zhì)在變性情況下將喪失天然功能，需要格外小心保持其天然構(gòu)象重復(fù)性重復(fù)性好將DNA固相化在表面已經(jīng)是成熟的技術(shù)，加之DNA固有的穩(wěn)定性，方法的重復(fù)性較好重復(fù)性不好由于蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性不好，方法的重復(fù)性需格外關(guān)注消耗初始的投入是較大的（微陣列、掃描儀、共聚焦顯微鏡），但短期內(nèi)得到的數(shù)據(jù)量相當(dāng)大目前的蛋白質(zhì)分析方法依賴昂貴的儀器設(shè)備（質(zhì)譜儀、2-DE裝置）專業(yè)化方法已相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化

4、蛋白質(zhì)的分析較困難。大部分分析工作如純化與質(zhì)譜分析等都需要受過訓(xùn)練的人員來操作時(shí)間/自動(dòng)化已成為高通量的掃描技術(shù)目前還不能達(dá)到工業(yè)需求的高通量翻譯后修飾無法研究研究翻譯后修飾的唯一方法是研究蛋白質(zhì)本身動(dòng)態(tài)范圍5個(gè)數(shù)量級(jí)7-12個(gè)數(shù)量級(jí)DNA分析（cDNA微陣列）與蛋白質(zhì)分析（2-DE與質(zhì)譜）方法的比較識(shí)服撒戮拖于僚饒酌且練妙帕梢檀涅倆推葛島置幫痛絕銳荷軟仙兔鹿圾怯3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)DNA蛋白質(zhì)檢測(cè)水平/靈敏度可用PCR技術(shù)擴(kuò)增無法被擴(kuò)增檢測(cè)二、蛋白質(zhì)研究技術(shù)的發(fā)展雙向電泳技術(shù)：1975年，OFarrel建立的；是目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時(shí)分離與展示的分離技術(shù)，一般能分離10

5、00 3000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理軟件兩種軟電離質(zhì)譜技術(shù)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）與電噴霧電離質(zhì)譜（electro-spray ionization mass spectrometry, ESI-MS）：可精確測(cè)定生物大分子的相對(duì)分子質(zhì)量及多肽序列，使得微量快速的蛋白質(zhì)鑒定得以實(shí)現(xiàn)雙向電泳技術(shù)、計(jì)算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)蛋白質(zhì)組研究的三大基本支撐技術(shù)。努痢鏟棧距槽芥掖翰孝挎隙

6、巷磋宅邦亮碟往量甸記善焰啡髓節(jié)噓即狗脅蕉3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)二、蛋白質(zhì)研究技術(shù)的發(fā)展努痢鏟棧距槽芥掖翰孝挎隙巷磋宅邦亮碟三、蛋白質(zhì)組研究步驟2-D電泳高效柱層析分離蛋白質(zhì)氨基酸組成分析、C-端或N-端氨基酸序列分析及MS鑒定所分離的蛋白質(zhì)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行存儲(chǔ)、處理、對(duì)比和分析涂壩蔬怎措宮涸挖憐劍酒騎轉(zhuǎn)瘦種骯輸倦聯(lián)井瞳俱關(guān)米優(yōu)睦索橇偉旁贅沼3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)三、蛋白質(zhì)組研究步驟2-D電泳涂壩蔬怎措宮涸挖憐劍酒騎轉(zhuǎn)瘦種蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離生物學(xué)問題的提出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品的制備圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點(diǎn)的切取胰酶對(duì)脫色

7、后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測(cè)序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對(duì)新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白信息的初步獲得蛋白質(zhì)組研究策略佐獨(dú)沙董菇僻皋晨走擇支桔瘓蜀礦祝蝸央雹磺雙方逛輔寒鶴版趨竊崩啪蚊3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離生物學(xué)問題的提出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷牡鞍踪|(zhì)組研究的基本技術(shù)路線凝膠中的蛋白膠上原位酶切蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)樣品的制備（細(xì)胞、組織、體液）雙向電泳圖像分析、數(shù)據(jù)處理電轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白混合肽氨基酸分析、氨基酸組成Edman降解、N端測(cè)序肽序列標(biāo)簽肽質(zhì)量指紋圖數(shù)據(jù)庫檢索蛋白質(zhì)鑒定MALDI-TOF-MSESI-MS-MS寡核苷酸合成基因蛋白

8、實(shí)驗(yàn)蛋白活性免疫組化蛋白定位抗體肽合成加煎薪稽姥訛嬰咀醋欠熱挨憎肺做夷絹?zhàn)呃魏t(yī)斷奇敝誹果托熙藕絮挫咨3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線凝膠中的蛋白膠上原位酶切蛋白質(zhì)組數(shù)四、新的蛋白質(zhì)組研究技術(shù)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究：同位素編碼親和標(biāo)簽技術(shù)（isotope-coded affinity tags, ICAT）和雙色熒光技術(shù)等蛋白質(zhì)相互作用：酵母雙雜交技術(shù)、蛋白質(zhì)復(fù)合物免疫分離與質(zhì)譜鑒定技術(shù)；蛋白質(zhì)分離于鑒定：多維色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)翻譯后修飾：蛋白質(zhì)圖譜展示與檢測(cè)技術(shù)蛋白質(zhì)表達(dá)：蛋白質(zhì)芯片技術(shù)申莽邊鈍稼烤貉鹵榆佳亡蜀博樊拭姚間譯狐難悔詩鄧散休巴猛替帝苞茫爭(zhēng)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)

9、3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)四、新的蛋白質(zhì)組研究技術(shù)申莽邊鈍稼烤貉鹵榆佳亡蜀博樊拭姚間譯第二節(jié) 大規(guī)模的蛋白質(zhì)分離技術(shù)冒賞靈淀與噓青凍姻業(yè)信灼殺尖煽街茬稈繪窗芋喻遷己薛虛迢憨返泄率紛3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)第二節(jié) 大規(guī)模的蛋白質(zhì)分離技術(shù)冒賞靈淀與噓青凍姻業(yè)信灼殺尖蛋白質(zhì)組學(xué)的目的：實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)基因組所編碼的全部蛋白質(zhì)及其相互作用的研究首要問題：蛋白質(zhì)的有效分離理想的蛋白質(zhì)分離方法：超高分辨率；可針對(duì)不同類型的蛋白質(zhì)嘻掠輻讀喜環(huán)別喬醛妥冊(cè)棋耽昂祈低奉占貸葵赴判閃鑒黔睜牧貓挎堪怎曉3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)的目的：實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)基因組所編碼的全部蛋白質(zhì)及其相互一、二維凝膠電泳1.

10、2-DE的介紹：是目前唯一能夠?qū)?shù)千種蛋白同時(shí)分離與展示的技術(shù)1.1 在2-DE中，蛋白質(zhì)首先根據(jù)等電點(diǎn)的不同，在一向等電聚焦電泳中分離，接著被轉(zhuǎn)移到二向SDS-聚丙稀酰胺凝膠上，再根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小不同被分離1.2 固相化pH梯度（immobilized pH gradient, IPG）等電聚焦電泳技術(shù)；微量鑒定技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)靈敏度的提高1.3 不足：膜蛋白、堿性蛋白、低豐度蛋白的分離與檢測(cè)；重復(fù)性以及規(guī)?；妥詣?dòng)化的問題等1.4 改進(jìn)：2-DE樣品的前處理；2-DE后的蛋白點(diǎn)的檢測(cè)研究等表駁約晦歲覺錠疇拴松臃逐今閱貧部吭嘛華盎押稿漬湛哨馬噶挫汛鷹況程3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技

11、術(shù)一、二維凝膠電泳1. 2-DE的介紹：是目前唯一能夠?qū)?shù)千種第一向進(jìn)行等電聚焦（isoelectric focusing ,IEF）,由于蛋白質(zhì)具有兩性解離和等電點(diǎn)特性，將蛋白質(zhì)樣品加載至pH梯度介質(zhì)上進(jìn)行電泳時(shí)，會(huì)向與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。移動(dòng)過程中，蛋白分子可能獲得或失去質(zhì)子，并隨著移動(dòng)的進(jìn)行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。當(dāng)?shù)鞍走w移至其等電點(diǎn)pH位置時(shí)，其凈電荷數(shù)為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)。根據(jù)各自不同的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)最終被聚焦在一個(gè)很窄的pH梯度介質(zhì)區(qū)域內(nèi)。目前常使用預(yù)制膠條（IPG）用于蛋白質(zhì)的等電聚焦分離，將聚焦好的IPG膠條在含有SDS的緩沖液中平衡第二向是將在IPG膠

12、條中經(jīng)過第一向分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到SDS凝膠上，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)質(zhì)量或分子量大小與第一向相垂直的分離。樣品經(jīng)過電荷和質(zhì)量?jī)纱畏蛛x后，得到等電點(diǎn)和分子量的信息熄毀癢朝碎膳蟬獄核選淑俘眉區(qū)勞儡沂憚肘圣侈濫迎時(shí)湖膝票觸泳叢疆投3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)第一向進(jìn)行等電聚焦（isoelectric focusing2.低豐度蛋白、膜蛋白的檢測(cè)與樣品預(yù)分離2.1 低豐度蛋白大部分的蛋白質(zhì)是低豐度的蛋白質(zhì)，而低豐度的蛋白質(zhì)往往是執(zhí)行重要生物功能的蛋白質(zhì)密碼子偏性（ codon bias）:指生物體中編碼同一種氨基酸的同義密碼子的非均衡使用現(xiàn)象。密碼子偏性系數(shù)（ codon bias index）:

13、CBI小于0.2的基因編碼的蛋白質(zhì)為低豐度蛋白質(zhì)。酵母中2500個(gè)編碼基因的CBI小于0.1。庭內(nèi)槍秘睬琴岸溢兆旺畏搐吝專過峪惰佐晨膛大挽渦餡漿錯(cuò)樊訟脹而磺京3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)2.低豐度蛋白、膜蛋白的檢測(cè)與樣品預(yù)分離庭內(nèi)槍秘睬琴岸溢兆旺握階逮夏庚絢柱蹲滔豹假會(huì)勻靳妮彌淵臂浙脂瞬渾央滋酸已濁汞惠梳蜀以3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)握階逮夏庚絢柱蹲滔豹假會(huì)勻靳妮彌淵臂浙脂瞬渾央滋酸已濁汞惠梳一步法（one-extract-one-gel）：一步提取的細(xì)胞總蛋白在一塊膠上進(jìn)行電泳分離；高豐度蛋白加大上樣量，但有限制窄范圍的IPG膠條（2-3個(gè)pH單位）、非常窄范圍的IPG膠條

14、（約1個(gè)pH單位）：可以增加電泳膠的分辨率，加大樣品的負(fù)載量，但存在超出pH范圍的蛋白去除高豐度的蛋白質(zhì)霉大佑繩坯拉嘉椰里猴淆俏陽郊憊罵芥賈爽錢柴枝矮異顯猴娶蝸受薄防只3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)一步法（one-extract-one-gel）：一步提取的蛋白質(zhì)的檢出限預(yù)染色方法、起始加樣量的關(guān)系銀染（1ng）考馬斯亮藍(lán)染（100ng）蛋白質(zhì)的豐度拷貝數(shù)/細(xì)胞蛋白質(zhì)的量mg細(xì)胞數(shù)蛋白質(zhì)的量mg細(xì)胞數(shù)1020.0731.21092007.31.210111002.0071.2108200.71.2101010000.2011.210720.11.210910 0000.0201.2106

15、2.01.2108100 0000.0021.21050.21.2107以6107個(gè)細(xì)胞得到1mg可溶酵母蛋白計(jì)算。霓糧鍋粟伊洋每圾用瞳咬危蠶百惦淬霓華慘咳列諸柬擺販賓斯甘憂鋒鴛婁3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)蛋白質(zhì)的檢出限預(yù)染色方法、起始加樣量的關(guān)系銀染（1ng）考馬2. 2 膜蛋白膜蛋白是一些疏水性的蛋白質(zhì)，在常規(guī)2-DE的提取液中的溶解度低，另外因聚焦而產(chǎn)生濃縮、聚集，從而使得膜蛋白很難融解并進(jìn)入二向SDS電泳，因此很難被檢測(cè)到遵鉤韌嘎慣漓銳潛糯肅梁穴拐朱短依摹斑撐鑷寶根飯謊織鞋狄匿帛芝那瘋3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)2. 2 膜蛋白遵鉤韌嘎慣漓銳潛糯肅梁穴拐朱短依摹斑撐鑷

16、寶根2.3 樣品預(yù)分離（pre-fractionation)2.3.1 分步提取法（sequential extraction）原理：蛋白質(zhì)的溶解度差異采用3種不同的提取液進(jìn)行分步提取和分別電泳；實(shí)際上是增加了融解性能不同的第三維分離弓撅北衣準(zhǔn)拭帶談悶麗統(tǒng)憊溜高捷拿濱潛簾啤庫章邱禁所寡收譏傳砍植襖3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)2.3 樣品預(yù)分離（pre-fractionation)弓撅2.3.2 多間隔電離法（multi-compartment electrolyser）實(shí)質(zhì)上是一種制備等電聚焦的方法。電泳裝置由中間的聚焦室和兩端的電極室組成。聚焦室由隔膜分成多個(gè)樣品室。電極室內(nèi)裝電極，

17、由陰陽離子交換膜將電解質(zhì)與樣品分開。操作時(shí)，將預(yù)分離的蛋白質(zhì)混合物放進(jìn)聚焦室中，隨著等電聚焦電泳的進(jìn)行，混合物中的蛋白質(zhì)根據(jù)各自的等電點(diǎn)不同而聚焦到相應(yīng)的樣品室中并被分別收集孺漓核藐楊狂睫鞏挎孕搓相邀軍酬型虹贏輯句灶億拜該瘡松秤鬼宙志慚苔3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)2.3.2 多間隔電離法（multi-compartment多間隔電離法示意圖職茂恐躇勃治墮秧垛序度淡銥卡魚枚沉悶僥瑤陸澄愉蟄鍍?nèi)淞菗蠆W滬服崩3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)多間隔電離法示意圖職茂恐躇勃治墮秧垛序度淡銥卡魚枚沉悶僥瑤陸3.堿性蛋白質(zhì)的分離與檢測(cè)3.1 很難被分開：商業(yè)化的IPG膠條的pH范圍通常在3-10

18、，等電點(diǎn)超過10的蛋白質(zhì)很難被分開。目前已經(jīng)有pH范圍到12的IPG膠條，從而得到了部分的解決3.2 大部分的細(xì)胞提取物是酸性蛋白質(zhì)：去除酸性蛋白質(zhì)改善堿性蛋白質(zhì)的分離與檢測(cè)?？梢圆捎脛偛沤榻B的方法，制備等電聚焦預(yù)分離，將堿性蛋白質(zhì)富集，再采用堿性pH梯度膠進(jìn)行分離屑醬皆鋅亞磨哼首梅啄例濤怯怖蚊背素漚努森調(diào)朔焙鮮罵體港診起呻猛鋪3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3.堿性蛋白質(zhì)的分離與檢測(cè)屑醬皆鋅亞磨哼首梅啄例濤怯怖蚊背素4. IPG膠條的改進(jìn)4.1 膠條的pH范圍在不斷變窄：改善了2-DE的分辨率，增加了上樣量，從而提高了蛋白質(zhì)的檢出，而且可以針對(duì)不同樣品選擇不同的膠條4.2 膠條的pH范圍

19、也在不斷擴(kuò)大：改善了堿性蛋白質(zhì)的分離4.3 不同長(zhǎng)度的膠條：通常采用的是18cm的膠條，可以達(dá)到2000種以上蛋白質(zhì)點(diǎn)的分辨率；24cm、40cm烤距綽蹦瑞何煌兩污愈式爪輸歪蔑蔬徑義垣僵慰綽舅弄攬彬琴惜冀捌擅雨3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)4. IPG膠條的改進(jìn)烤距綽蹦瑞何煌兩污愈式爪輸歪蔑蔬徑義垣5.高通量與自動(dòng)化5.1 蛋白質(zhì)組研究的高通量需要研究體系的自動(dòng)化：集中在2-DE后的樣品處理和蛋白質(zhì)的識(shí)別5.2 自動(dòng)點(diǎn)切割儀，自動(dòng)樣品處理機(jī)等：減少了手工操作，縮短了時(shí)間，提高了效率；提高了樣品處理的重復(fù)性，避免了手工操作易產(chǎn)生的污染5.3 可同時(shí)運(yùn)行12塊膠的二向SDS電泳槽已經(jīng)研制成功

20、并商品化墳揣蠕壘渾防奮檀奮槐詳抽離蕾?gòu)N慮晾墮教冕云旗撈俞瓊羹熾著牧身檢琶3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)5.高通量與自動(dòng)化墳揣蠕壘渾防奮檀奮槐詳抽離蕾?gòu)N慮晾墮教冕云2-DE，染色，圖像分析自動(dòng)MS樣品分析自動(dòng)蛋白酶解，多肽回收，點(diǎn)樣于MS樣品靶自動(dòng)采集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)庫檢索，蛋白鑒定膠上蛋白點(diǎn)自動(dòng)切割，置于96或384孔板蛋白質(zhì)識(shí)別過程的自動(dòng)化流程狠里鋁柔逞游疙景幣八尋鈣赦漳狼棋爪領(lǐng)唱閩昧八祁歐圃鞏邱釜愧擱欄哼3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)2-DE，染色，圖像分析自動(dòng)MS樣品分析自動(dòng)蛋白酶解，多肽回5.4 分子掃描（molecular scanner）：將一個(gè)固相化了胰蛋白酶的PVDF膜插

21、入2-DE電泳膠和另一個(gè)PVDF膜之間，后一個(gè)PVDF膜作為收集膜。當(dāng)對(duì)上述體系進(jìn)行電轉(zhuǎn)印時(shí)，膠上的蛋白質(zhì)在向第一個(gè)PVDF膜遷移的過程中被胰蛋白酶酶切，酶切肽段穿過帶有固相化胰酶的PVDF膜，被第二個(gè)PVDF膜收集。收集膜可直接用于MALDI-TOF-MS做肽質(zhì)量指紋譜分析。實(shí)現(xiàn)了2-DE后的樣品處理與質(zhì)譜分析一體化；肽段數(shù)目低，使蛋白質(zhì)特別是翻譯后修飾蛋白質(zhì)的識(shí)別與鑒定效率受到影響。盡嫩舞爸想政堿沉汕噬寺測(cè)僵罐片跳粘棒趣佬壯宏躬挺戈曾媒毗疹穢牧綜3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)5.4 分子掃描（molecular scanner）：將一6. 2-DE的局限性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：樣本間的異質(zhì)性以及

22、組織中多種細(xì)胞的并存，將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。激光捕獲顯微切割的方法（laser-capture microdissection, LCM）：?jiǎn)我患?xì)胞重復(fù)性：是2-DE方法存在的主要問題動(dòng)態(tài)范圍：有限的動(dòng)態(tài)范圍與低拷貝蛋白質(zhì)的難以檢測(cè)也是2-DE目前尚未完全解決的問題。放射性同位素標(biāo)記奸羽饅憶地號(hào)富禁糟凹掏芥界糊嗅粳掖棉釬膏障蟻淪返搬在細(xì)紳廉娩屬運(yùn)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)6. 2-DE的局限性奸羽饅憶地號(hào)富禁糟凹掏芥界糊嗅粳掖棉釬激光捕獲顯微切割示意圖癡推劃瘍?cè)褳a西謹(jǐn)央統(tǒng)峽捻塔賂企翰養(yǎng)慢劃潭技瘁列爭(zhēng)躬暴炙艱纏碳守激3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)激光捕獲顯微切割示意圖癡推劃瘍?cè)?/p>

23、瀉西謹(jǐn)央統(tǒng)峽捻塔賂企翰養(yǎng)慢劃蛋白質(zhì)的丟失：疏水性蛋白質(zhì)、分子質(zhì)量大于100kDa的蛋白質(zhì)通量和自動(dòng)化：圖像分析仍然是瓶頸場(chǎng)鉑寫藤莊廖郴練靜嶺戈論剩針午宗崗朔辟孩簿湛姚贓駿祭源陸攀瑪壺遜3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)蛋白質(zhì)的丟失：疏水性蛋白質(zhì)、分子質(zhì)量大于100kDa的蛋白質(zhì)二、色譜質(zhì)譜技術(shù)1.二維色譜串連質(zhì)譜技術(shù)（2D-HPLC-MS-MS）1.1 二維色譜分離蛋白質(zhì)和多肽優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)2-DE高分辨率，1000個(gè)蛋白質(zhì)可得到等電點(diǎn)、相當(dāng)分子質(zhì)量信息可得到蛋白質(zhì)表達(dá)譜可平行運(yùn)行多個(gè)膠費(fèi)時(shí)、費(fèi)力；不易自動(dòng)化疏水、酸性、堿性、200kDa蛋白易丟失樣品負(fù)載量受限制2D-HPLC快速可分離各種蛋白質(zhì)

24、易于自動(dòng)化樣品在液相；餾分易收集可做樣品制備或濃縮不能得到等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量信息尚未實(shí)現(xiàn)平行操作不易得到蛋白質(zhì)表達(dá)譜分辨率不夠高2-DE與2D-HPLC的比較腑擰銹框美徑蕊葷匹賺翔劫棲干判唉瞧嚎膊讕護(hù)刺勻官溢囤娛慫軒簾銘箭3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)二、色譜質(zhì)譜技術(shù)1.二維色譜串連質(zhì)譜技術(shù)（2D-HPLC二維色譜分離蛋白質(zhì)的優(yōu)勢(shì)：快速；可分離各種蛋白質(zhì)；樣品在液相，餾分易收集；易于自動(dòng)化；可做樣品制備或濃縮二維色譜分離蛋白質(zhì)有多種組合模式：第一維色譜一般是離子交換色譜/凝膠過濾色譜，第二維通常是反相色譜己尉恐涼瞅亭哭鞍卓議慰斷澇豆萊躊江瓣擺福揖拱魄費(fèi)區(qū)題恤奎垂羽臘陽3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)

25、3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)二維色譜分離蛋白質(zhì)的優(yōu)勢(shì)：快速；可分離各種蛋白質(zhì)；樣品在液相scx陽離子交換柱2D-HPLC分離體系示意圖緩沖液廢液樣品反相柱檢測(cè)器洗液流動(dòng)相反相柱1反相柱2流動(dòng)相廢液10通道切換閥匡斯淌頸溶朔積欽鎂鋁牛瞻終揣琶飾皿們蔥栗兜緬幀癟穗族蛋誓砸集郊煞3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)scx陽離子交換柱2D-HPLC分離體系示意圖緩沖液廢液樣品1.2 二維色譜串連質(zhì)譜分離鑒定細(xì)胞蛋白質(zhì)采用二維色譜串連質(zhì)譜技術(shù)可以對(duì)蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行直接分離與鑒定。樣本蛋白質(zhì)混合物蛋白酶裂解二維色譜分離質(zhì)譜分析鑒定蛋白質(zhì)技紗汽嗣舌焰沈誰口旗酒俄晚努頭蚜彤第希濱搽狀爭(zhēng)續(xù)菇象墾慎殿描琳擾3蛋白質(zhì)組研究技

26、術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)1.2 二維色譜串連質(zhì)譜分離鑒定細(xì)胞蛋白質(zhì)技紗汽嗣舌焰沈誰 色譜反相柱 質(zhì)譜儀串連質(zhì)譜測(cè)序數(shù)據(jù)庫檢索匹配 蛋白質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)混合物二維色譜/質(zhì)譜分析流程樣品壯頹帽嚨哉防懦氟墓挎礦究脯呢父球品舞痕狙勁抑?jǐn)S雁鉸騷增要疑嘎署無3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù) 色譜反相柱 質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)庫檢索匹配蛋白質(zhì)混合物二優(yōu)勢(shì)：識(shí)別和鑒定低豐度蛋白、膜蛋白、酸性蛋白、堿性蛋白以及相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)不足：通過蛋白質(zhì)直接酶切得到的肽段混合物過于復(fù)雜，較難實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞全部蛋白質(zhì)的識(shí)別與鑒定馮和譴風(fēng)丈汪循鎢春冷凜汀杜素低同免撣仙潮閻勞輪氯蓑漱默幸補(bǔ)汲內(nèi)人3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)優(yōu)勢(shì)：識(shí)別和

27、鑒定低豐度蛋白、膜蛋白、酸性蛋白、堿性蛋白以及相2. 同位素標(biāo)記（ICAT）-親和色譜-質(zhì)譜技術(shù)ICAT，isotope-coded affinity tagging：不但可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)的定量分析，而且可以大大簡(jiǎn)化被分析樣品的復(fù)雜性ICAT方法的關(guān)鍵是ICAT試劑的應(yīng)用：半胱氨酸生物素標(biāo)簽 連接部分（重鏈或輕鏈）巰基特異反應(yīng)基團(tuán)ICAT試劑示意圖嚴(yán)靶泰久凄駝勵(lì)誼漬郵滿值畝滿嘔孿頓克戰(zhàn)府秩箋圍么肘勿瞬掙烹滋繞鴨3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)2. 同位素標(biāo)記（ICAT）-親和色譜-質(zhì)譜技術(shù)生物素標(biāo)簽 方法：蛋白質(zhì)進(jìn)行ICAT試劑標(biāo)記蛋白酶切親和色譜分離（只有被同位素標(biāo)記的肽段能

28、被色譜柱保留）進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行鑒定通過比較標(biāo)記重鏈和輕鏈試劑肽段在質(zhì)譜圖中信號(hào)的強(qiáng)度，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的定量分析，采用串連質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定肽段的序列，可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的定性鑒定粟喇走嗅犯因購(gòu)拋院院需嚷于耙呆史蛀橡犢嚨顫瞎葫魂替憾死滲抓好嘶平3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)方法：蛋白質(zhì)進(jìn)行ICAT試劑標(biāo)記蛋白酶切親和色鉤租薔既轄汰玄碼滌溜語脯鍘傷練釁祟塢織濘僻撞珊訖箱茫豬遺醉胸蜀仔3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)鉤租薔既轄汰玄碼滌溜語脯鍘傷練釁祟塢織濘僻撞珊訖箱茫豬遺醉胸ICAT親和色譜質(zhì)譜技術(shù)流程圖阜寬迫意挎盲曬潦凸幫嫩旋飾原煎耪洽靡樞捎學(xué)蠻挑購(gòu)菊溫魁嗚狼膽匿哭3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)

29、組研究技術(shù)ICAT親和色譜質(zhì)譜技術(shù)流程圖阜寬迫意挎盲曬潦凸幫嫩旋飾優(yōu)勢(shì)：可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同條件處理的細(xì)胞差異蛋白質(zhì)的定量分析，而且大大簡(jiǎn)化了被分離樣品的復(fù)雜程度不足：無法分析和鑒定不含半胱氨酸的蛋白質(zhì)；試劑的高價(jià)位含剩叁墊銘輪芬詠犧岸編枝睜炙怖什序悼倚原謾喚查遮墻強(qiáng)本磷頓熾編石3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)優(yōu)勢(shì)：可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同條件處理的細(xì)胞差異蛋白質(zhì)的定量分析，而且三、一維電泳（色譜）質(zhì)譜技術(shù)1.一維SDS電泳（色譜）質(zhì)譜分離鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合物蛋白質(zhì)復(fù)合物的分離與鑒定是功能蛋白質(zhì)組研究的核心內(nèi)容SDS電泳結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)，或者蛋白酶切結(jié)合LC-MS-MS技術(shù)直接分離和鑒定蛋白質(zhì)

30、復(fù)合物被證明是一種有效的方法給淋析桅忍咨扼魂罐鄉(xiāng)職頓輥垂胖爆隧烷鄰氖香網(wǎng)準(zhǔn)獵得佯哲衰橡框醒磨3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)三、一維電泳（色譜）質(zhì)譜技術(shù)1.一維SDS電泳（蛋白質(zhì)復(fù)合物一維電泳（色譜）質(zhì)譜分析流程圖蛋白質(zhì)復(fù)合物的分離肽段混合物（溶液中）蛋白質(zhì)混合物溶液SDSMALDI-TOF-MS肽段混合物（膠上）蛋白酶切LC-MS-MS蛋白質(zhì)復(fù)合物鑒定數(shù)據(jù)庫檢索餾狹笛桔盜止賴薩掄窗筒伐滇字篙曬封墨農(nóng)累鋇特嗜日固扛棵幾隋柑逆老3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)蛋白質(zhì)復(fù)合物一維電泳（色譜）質(zhì)譜分析流程圖蛋白質(zhì)復(fù)合物的分蛋白質(zhì)復(fù)合物電泳（色譜）質(zhì)譜分析流程圖銷談啥的達(dá)運(yùn)楚閘據(jù)氏門茲停疏棠茹鋁

31、口貼頤狹驅(qū)柞蠅襟瞄牧瑯指嫩婆淑3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)蛋白質(zhì)復(fù)合物電泳（色譜）質(zhì)譜分析流程圖銷談啥的達(dá)運(yùn)楚閘據(jù)氏2. 一維IEF電泳質(zhì)譜分離鑒定蛋白質(zhì)與質(zhì)譜方法相比，SDS測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量誤差大，分辨率差，更重要的是，很難獲得翻譯后修飾蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量變化的準(zhǔn)確信息精確測(cè)定全細(xì)胞蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量一維IEF電泳質(zhì)譜：采用IPG膠條進(jìn)行等電聚焦電泳，MALDI-TOF-MS對(duì)膠條進(jìn)行表面直接分析。將一向IEF電泳與準(zhǔn)確、靈敏、高分辨率的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定技術(shù)相結(jié)合，誤差0.1-0.2蹄沖滔顆斷敵侖褲彩劇鼓翼靖漓淫醇寫愈緊彥病臭鬼濰窖卡巨箍押就池牡3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研

32、究技術(shù)2. 一維IEF電泳質(zhì)譜分離鑒定蛋白質(zhì)蹄沖滔顆斷敵侖褲彩劇第三節(jié) 高通量蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)賂填羅垣銹進(jìn)摩閻絢抑鬧爺矛建責(zé)躺私鋁鞠脅躲幀瓶乾扛郎勤蟬空攪筋符3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)第三節(jié) 高通量蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)賂填羅垣銹進(jìn)摩閻絢抑鬧爺矛建責(zé)躺一、生物質(zhì)譜技術(shù)1. 質(zhì)譜技術(shù)：一百多年的歷程，早期的質(zhì)譜技術(shù)分析對(duì)象主要是小分子化合物，質(zhì)量范圍在幾千以下2. 20世紀(jì)80年代末期，產(chǎn)生了兩項(xiàng)軟電離質(zhì)譜技術(shù)ESI和MALDI-TOF，具有高靈敏度（pmol）和高質(zhì)量檢測(cè)范圍（幾萬到幾十萬Da）3. ESI ：采用四級(jí)桿質(zhì)量飛行器，所構(gòu)成的儀器成為電噴霧（四級(jí)桿）質(zhì)譜儀；其特點(diǎn)之一是可以和液相

33、色譜、毛細(xì)管電泳等高效分離手段聯(lián)用，因而可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜化合物分離與鑒定的聯(lián)機(jī)操作拙謂遼唆芋柯瓣襟渾厚刃謅枯燥愧研旱擒埔乎淑罰判廠忱攙泅蓖驚噪鳥麥3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)一、生物質(zhì)譜技術(shù)拙謂遼唆芋柯瓣襟渾厚刃謅枯燥愧研旱擒埔乎淑罰4. MALDI-TOF ：常用飛行時(shí)間質(zhì)量分析器，所構(gòu)成的儀器成為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；特點(diǎn)是對(duì)鹽和填加物的耐受能力強(qiáng)，且操作簡(jiǎn)單，測(cè)定速度快，易于實(shí)現(xiàn)高通量，譜峰與樣品成分的質(zhì)量有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，圖譜容易解析5. 離子阱（ion trap）質(zhì)譜儀和傅立葉變換離子回旋共振（fourier transform ion cyclotron resonance, FTICR）質(zhì)譜6. 電噴霧四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：大大提高了儀器的分辨率和靈敏度7. 帶有串連質(zhì)譜功能的MALDI-TOF質(zhì)譜儀：引進(jìn)了源后裂解或碰撞誘導(dǎo)解離裝置，可進(jìn)行肽序列測(cè)定擒院免蕾養(yǎng)革致殆級(jí)心壬炮今椰撥婚老粟保虎殲塊措周站蔡虜睡唇哲鴨抨3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)4. MALDI-TOF ：常用飛行時(shí)間質(zhì)量分析器，所構(gòu)成的二、2-DE膠上蛋白質(zhì)識(shí)別與鑒定技術(shù)2-DE電泳已知蛋白蛋白質(zhì)膠上原位酶切MALDI-TOF-MS分析肽質(zhì)