細菌內毒素檢查法干擾試驗課件

細菌(xìjūn)內毒素檢查法干擾試驗講解董光宴

湛江博康海洋生物有限公司第一頁，共三十九頁。10/18/20221細菌內毒素檢查法干擾試驗實驗(shíyàn)基本流程圖供試品限值確定(quèdìng)最大有效(yǒuxiào)稀釋倍數確定供試品干擾實驗

正式實驗結果判斷第二頁，共三十九頁。10/18/20222細菌內毒素檢查法干擾試驗供試品

新化合物或新藥建立細菌內毒素檢查方法時，常常會遇到各種各樣的困難，尤其是尚處于(chǔyú)新藥研發(fā)早期階段的藥物，由于藥物制劑、賦形劑等還不穩(wěn)定，經常會發(fā)生變化，這樣就給方法的建立帶來不同程度的影響。第三頁，共三十九頁。10/18/20223細菌內毒素檢查法干擾試驗

供試品在建立細菌內毒素檢查法之前，應盡可能多的收集有關該藥品的基本信息(xìnxī)，例如：有關樣品的溶解性信息，推薦的稀釋液，在水中的溶解度，以及最適溶劑；樣品的pH范圍；分子量大??；產品規(guī)格、體積或重量；擬用于臨床的用法和用量等等。第四頁，共三十九頁。10/18/20224細菌內毒素檢查法干擾試驗限值的確定

1、依據2010年版《中國藥典》附錄“細菌內毒素檢查用水”2010年版《中國藥典》二部附錄“化學藥品注射劑安全性檢查法應用指導(zhǐdǎo)原則”第五頁，共三十九頁。10/18/20225細菌內毒素檢查法干擾試驗干擾試驗當進行新藥的內毒素檢查試驗前，或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進行干擾試驗。當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環(huán)境(huánjìng)中發(fā)生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗?！?010版藥典

第六頁，共三十九頁。10/18/20226細菌內毒素檢查法干擾試驗干擾試驗藥典中已有規(guī)定的品種或有其他內毒素檢驗標準的品種，可直接進行內毒素檢查(jiǎnchá)，如在檢驗中出現干擾的情況需再進行干擾實驗的驗證；其他未建立內毒素檢查(jiǎnchá)的品種需先進行干擾實驗，確定不干擾濃度后再進行內毒素檢查(jiǎnchá)。——2010版《中國藥品檢驗標準操作規(guī)范》第七頁，共三十九頁。10/18/20227細菌內毒素檢查法干擾試驗干擾試驗干擾實驗的目的是確定供試品在多大的稀釋倍數或濃度下對內毒素和鱟試劑的反應不存在干擾作用，為能否使用細菌內毒素檢查法提供依據。并且驗證當供試品的配方和工藝有變化，鱟試劑來源改變或供試品陽性對照結果呈陰性時供試品是否存在干擾作用?！?010版《中國(zhōnɡɡuó)藥品檢驗標準操作規(guī)范》第八頁，共三十九頁。10/18/20228細菌內毒素檢查法干擾試驗干擾試驗由于干擾實驗檢驗的是在供試品存在的情況下內毒素與鱟試劑的反應是否正常，與所使用鱟試劑的靈敏度無關(wúguān)，因此在干擾實驗中原則上可使用任一靈敏度的鱟試劑。但建議使用較低靈敏度（如0.50或0.25EU/ml）的鱟試劑，可盡量避免供試品所含的內毒素對干擾實驗造成的陽性影響?！?010版《中國藥品檢驗標準操作規(guī)范》第九頁，共三十九頁。10/18/20229細菌內毒素檢查法干擾試驗舉例(jǔlì):1試劑和樣品鱟試劑（生產單位：湛江博康海洋生物有限公司，靈敏度：0.25EU/ml）細菌內毒素檢查用水細菌內毒素工作標準品（中檢所提供）西咪替丁氯化鈉注射液（【規(guī)格】50ml:西咪替丁0.2g與氯化鈉0.45gP258）第十頁，共三十九頁。10/18/202210細菌內毒素檢查法干擾試驗2限值的確定內毒素限值L=0.50EU/ml（2010年版《中國(zhōnɡɡuó)藥典》二部正文258頁）。

第十一頁，共三十九頁。10/18/202211細菌內毒素檢查法干擾試驗3干擾試驗濃度的計算按照(ànzhào)中國藥典2005年版提供的公式計算最大有效稀釋倍數，計算方法如下：3.1選用靈敏度為：0.25EU/ml時：MVD=CL/λ=1×0.5/0.25=2倍3.2選用靈敏度為：0.125EU/ml時：MVD=CL/λ=1×0.5/0.125=4倍第十二頁，共三十九頁。10/18/202212細菌內毒素檢查法干擾試驗4預試驗4.1目的初步確定供試品的最大不干擾濃度（當限值以EU/mg或EU/U表示）或最小不干擾稀釋倍數（當限值以EU/ml表示）,為正式干擾試驗提供(tígōng)依據。優(yōu)點：減少摸索過程、節(jié)省成本第十三頁，共三十九頁。10/18/202213細菌內毒素檢查法干擾試驗4.2操作方法由于干擾試驗檢驗的是在供試品存在的情況下內毒素與鱟試劑的反應是否正常，與所用鱟試劑的靈敏度無關(wúguān)，因此在干擾試驗的預試驗中原則上可使用任一靈敏度的鱟試劑。但建議使用較低靈敏度（0.5或0.25EU/ml）的鱟試劑，可盡量避免供試品所含的內毒素對干擾試驗造成的陽性影響。第十四頁，共三十九頁。10/18/202214細菌內毒素檢查法干擾試驗將供試品溶液進行一系列倍數(bèishù)的稀釋，但最大的稀釋倍數(bèishù)不得超過MVD=CL/λ0.03使用鱟試劑對每一稀釋倍數進行檢驗。每一稀釋倍數下做2支供試品管和2支供試品陽性對照（即含2.0λ濃度標準內毒素的該濃度的供試品稀釋液）。另做2支陰性對照，和2支陽性對照。第十五頁，共三十九頁。10/18/202215細菌內毒素檢查法干擾試驗4.3結果判斷當陰性對照為陰性，陽性對照為陽性時，實驗為有效。當系列濃度中出現供試品溶液2管為陰性，供試品陽性對照2管為陽性時，認為供試品在該濃度下可能無干擾，可選擇(xuǎnzé)該稀釋倍數進行正式干擾實驗。第十六頁，共三十九頁。10/18/202216細菌內毒素檢查法干擾試驗樣品信息結果2倍4倍8倍0.25EU/ml0.25EU/ml0.25EU/mlPPC++++++樣品管------PC++NC--4.4結果(jiēguǒ)記錄第十七頁，共三十九頁。10/18/202217細菌內毒素檢查法干擾試驗

預試驗結果，樣品西咪替丁氯化鈉注射液在2-8倍稀釋范圍內不存在明顯(míngxiǎn)的增強和抑制作用，可選用其中任一濃度做該樣品的細菌內毒素干擾試驗。第十八頁，共三十九頁。10/18/202218細菌內毒素檢查法干擾試驗5干擾(gānrǎo)試驗溶液的制備溶液名稱WSE/被加入內毒素的溶液稀釋用液倍數WSE管數供試品無/供試品溶液———2Et

2λ/供試品溶液供試品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444ES

2λ/BETBET12482λ1λ0.5λ0.25λ4444NC無/BET———2第十九頁，共三十九頁。10/18/202219細菌內毒素檢查法干擾試驗5.1供試品溶液樣品西咪替丁氯化鈉注射液的稀釋：用細菌內毒素檢查用水將其稀釋到2倍和4倍稀釋液備用。操作過程必須嚴格遵守無菌操作規(guī)程，保證無外源物質(wùzhì)的干擾。第二十頁，共三十九頁。10/18/202220細菌內毒素檢查法干擾試驗西咪替丁氯化鈉注射液原液2倍稀釋液4倍稀釋液2.0ml2.0ml0.5ml0.5ml圖示第二十一頁，共三十九頁。10/18/202221細菌內毒素檢查法干擾試驗5.2鱟試劑(shìjì)靈敏度的對照系列根據鱟試劑靈敏度的標示值（λ），將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水1ml溶解，在旋渦混合器上混合15分鐘，然后制備成1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml和0.03EU/ml等6個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混合30秒鐘。

第二十二頁，共三十九頁。10/18/202222細菌內毒素檢查法干擾試驗150EU/ml15EU/ml2EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.125EU/ml0.25EU/ml0.06EU/ml0.2ml0.3ml1.8ml1.95ml1.2ml1.2ml1.2ml1.2ml0.3ml1.2ml1.2ml0.3ml1.2ml1.2ml圖示第二十三頁，共三十九頁。10/18/202223細菌內毒素檢查法干擾試驗5.3干擾(gānrǎo)試驗系列的制備方法①、鱟試劑為0.25EU/ml樣品濃度為2倍稀釋的干擾試驗系列溶液的制備：取西咪替丁氯化鈉注射液的原液0.6ml加入試管中，然后吸取相同體積的內毒素標準溶液（濃度為1.0EU/ml）加入同一試管中，混合均勻即得到含內毒素為0.50EU/ml并同時含樣品西咪替丁氯化鈉注射液的2倍稀釋的混合液。第二十四頁，共三十九頁。10/18/202224細菌內毒素檢查法干擾試驗然后用樣品西咪替丁氯化鈉注射液的2倍稀釋液稀釋該混合液，稀釋倍數依次為2、4和8倍，將這三支管混合均勻連同該混合液即可得到(dédào)含內毒素分別為0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.06EU/ml，含樣品西咪替丁氯化鈉注射液濃度為2倍稀釋液的標準內毒素對照溶液（干擾試驗系列）。第二十五頁，共三十九頁。10/18/202225細菌內毒素檢查法干擾試驗樣品(yàngpǐn)原液內毒素1.0EU/ml圖示0.6ml0.6ml0.6ml0.6ml0.3ml樣品(yàngpǐn)2倍0.3ml0.6ml0.6ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.50EU/ml第二十六頁，共三十九頁。10/18/202226細菌內毒素檢查法干擾試驗②、鱟試劑為0.125EU/ml樣品濃度為4倍稀釋的干擾試驗系列溶液(róngyè)的制備：取西咪替丁氯化鈉注射液的的2倍稀釋液0.6ml加入試管中，然后吸取相同體積的內毒素標準溶液（濃度為0.5EU/ml）加入同一試管中，混合均勻即得到含內毒素為0.25EU/ml并同時含樣品西咪替丁氯化鈉注射液的4倍稀釋的混合液。第二十七頁，共三十九頁。10/18/202227細菌內毒素檢查法干擾試驗然后用樣品西咪替丁氯化鈉注射液的4倍稀釋(xīshì)液稀釋(xīshì)該混合液，稀釋(xīshì)倍數依次為2、4和8倍，將這三支管混合均勻連同該混合液即可得到含內毒素分別為0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml和0.03EU/ml，含樣品西咪替丁氯化鈉注射液濃度為4倍稀釋(xīshì)液的標準內毒素對照溶液（干擾試驗系列）。第二十八頁，共三十九頁。10/18/202228細菌內毒素檢查法干擾試驗樣品(yàngpǐn)2倍內毒素0.5EU/ml圖示0.6ml0.6ml0.6ml0.6ml0.3ml樣品(yàngpǐn)4倍0.3ml0.6ml0.6ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/ml0.25EU/ml第二十九頁，共三十九頁。10/18/202229細菌內毒素檢查法干擾試驗6干擾(gānrǎo)試驗加樣

WSE對照名稱2λλ0.5λ0.25λNCESET第三十頁，共三十九頁。10/18/202230細菌內毒素檢查法干擾試驗

7干擾試驗判斷的標準當Es在0.5λ—2.0λ(包括(bāokuò)0.5λ和2.0λ)時，且當Et在0.5Es—2.0Es(包括(bāokuò)0.5Es和2.0Es)時，則認為供試品在該濃度下無干擾作用。第三十一頁，共三十九頁。10/18/202231細菌內毒素檢查法干擾試驗7.1如所用鱟試劑(shìjì)靈敏度為0.25EU/ml，供試品為XX注射液（稀釋4倍）WSE對照名稱0.50.250.1250.06NC結果ES++++++++------0.25ET++++++++++++-----0.125

Es在0.5λ—2.0λ，且Et在0.5Es—2.0Es(包括(bāokuò)0.5Es和2.0Es)，認為供試品在該濃度下無干擾作用。第三十二頁，共三十九頁。10/18/202232細菌內毒素檢查法干擾試驗7.2如所用鱟試劑(shìjì)靈敏度為0.25EU/ml，供試品為XX注射液（稀釋4倍）WSE對照名稱0.50.250.1250.06NC結果ES++++++++++++----0.125ET+++++-----------0.42

雖然Es在0.5λ—2.0λ范圍內，Et不在0.5Es—2.0Es范圍內，供試品在該濃度下有干擾(gānrǎo)作用，需進行適當處理后重做試驗。

第三十三頁，共三十九頁。10/18/202233細菌內毒素檢查法干擾試驗7.3如所用(suǒyònɡ)鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，供試品為XX注射液（稀釋4倍）WSE對照名稱0.50.250.1250.06NC結果ES+++++++++++++----0.10ET++++++++--------0.25

Es不在0.5λ—2.0λ范圍(fànwéi)內，試驗無效。第三十四頁，共三十九頁。10/18/202234細菌內毒素檢查法干擾試