CRISPR-Cas9-基因編輯技術(shù)簡介

基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas91可編輯ppt1987年，日本大阪大學(xué)（OsakaUniversity）在對一種細(xì)菌編碼的堿性磷酸酶基因進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，但一直不清楚功能。后來的研究發(fā)現(xiàn)，這種重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中。2002年才正式命名為成簇的規(guī)律間隔性短回文重復(fù)序列CRISPR(Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats).2013年之后，研究者們在《science》和《nature》等國際著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR/Cas9系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的基因修飾。1.CRISPR/Cas系統(tǒng)概述2可編輯ppt已測序的接近90%的古細(xì)菌和40%的細(xì)菌的基因組或是質(zhì)粒中至少存在CRISPR

基因座。根據(jù)Cas基因核心元件序列的不用，CRISPR/Cas免疫體統(tǒng)分為3中類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)需要多個(gè)Cas蛋白形成復(fù)合體切割DNA雙鏈，而Ⅱ型CRISPR/Cas9免疫系統(tǒng)只需要一個(gè)Cas9蛋白來切割DNA雙鏈，目前Ⅱ型系統(tǒng)是被改造的最成功的人工核酸內(nèi)切酶。1.CRISPR/Cas系統(tǒng)概述1.1CRISPR的分布與分類：3可編輯pptCRISPR/Cas系統(tǒng)是很多細(xì)菌和大部分古細(xì)菌的天然免疫系統(tǒng)，通過對入侵的病毒和核酸進(jìn)行特異性的識別，利用Cas蛋白進(jìn)行切割，從而達(dá)到對自身的免疫。1.2CRISPR系統(tǒng)獲得：1.CRISPR/Cas系統(tǒng)概述4可編輯ppt2.CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)2.1CRISPR/Cas主要由兩部分組成：5可編輯ppt2.2CRISPR結(jié)構(gòu)：CRISPR是一種特殊的DNA重復(fù)序列家族，廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。CRISPR位點(diǎn)通常由短的高度保守的重復(fù)序列(repeats)組成，重復(fù)序列的長度通常為21--48bp，重復(fù)序列之間被26--72bp間隔序列(spacer)隔開。CIRSPR通過這些間隔序列(spacer)與靶基因進(jìn)行識別。2.CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)6可編輯ppt2.3Cas家族：Cas(CRISPRassociated)存在于CRISPR位點(diǎn)附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guideRNA引導(dǎo)下對靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與fokI酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。2.CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)7可編輯pptCRISPR基因座的表達(dá)（包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的成熟加工）當(dāng)該噬菌體再次入侵細(xì)菌時(shí)，CRISPR簇首先轉(zhuǎn)錄為長的crRNA前體，然后逐步加工成小的成熟的crRNA.CRISPR/Cas系統(tǒng)活性的發(fā)揮或外源遺傳物質(zhì)的干擾crRNA結(jié)合相關(guān)的Cas蛋白后，形成crRNA-Cas蛋白復(fù)合體，通過堿基互補(bǔ)配對精確地與目標(biāo)DNA相結(jié)合，隨后Cas蛋白對目標(biāo)DNA進(jìn)行斷裂和降解。3.CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用機(jī)制8可編輯ppt4.CRISPR/Cas9系統(tǒng)TypeⅡ因其簡單性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具--CRISPR/Cas9。現(xiàn)在廣泛使用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)來源于釀膿鏈球菌。TypeII系統(tǒng)具有以下特點(diǎn)：在CRISPR/Cas基因座上游會(huì)表達(dá)tracrRNA;tracrRNA會(huì)參與crRNA的加工，這個(gè)工程亦需要RNaseIII的參與；tracrRNA會(huì)與crRNA形成二聚體指導(dǎo)Cas對雙鏈DNA的切割。9可編輯pptCas9是一種核酸內(nèi)切酶,其具有：RuvC和HNH兩個(gè)內(nèi)切酶活性中心Jinek等發(fā)現(xiàn)Cas9在細(xì)菌和試管里對雙鏈DNA具有強(qiáng)烈的切割能力,但是這種切割能力需要的crRNA和tracrRNA介導(dǎo)。4.CRISPR/Cas9系統(tǒng)10可編輯pptJinek等創(chuàng)造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一條嵌合的RNA鏈,使其同時(shí)具有crRNA和tracrRNA的特性,隨后的切割實(shí)驗(yàn)表明,這條嵌合的RNA同樣可以引導(dǎo)Cas9切割目標(biāo)DNA。現(xiàn)在普遍使用的都是crRNA和全長tracrRNA融合體,簡稱sgRNA(singleguideRNA)4.CRISPR/Cas9系統(tǒng)11可編輯ppt4.CRISPR/Cas9系統(tǒng)釀膿鏈球菌12可編輯ppt4.CRISPR/Cas9系統(tǒng)13可編輯pptCRISPRDesignTool:/E-CRISPR:ZiFiT:/Cas9Design:http://cas9./index.jspCas-OFFinder:/cas-offinder/CCTop:http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/4.CRISPR/Cas9系統(tǒng)gRNA在線設(shè)計(jì)工具：14可編輯ppt4.CRISPR/Cas9系統(tǒng)15可編輯ppt基因敲除或者敲入；基因修復(fù)；基因調(diào)控；文庫篩選。4.CRISPR/Cas9系統(tǒng)CRISPR/Cas作用：16可編輯ppt5.CRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)2013年，研究者們發(fā)表多篇文章介紹CRISPR/Cas9系統(tǒng)，但CRISPR/Cas9目前仍存在一個(gè)很嚴(yán)重且無法避免的問題，即潛在的脫靶效應(yīng)不可消除。CRISPR/Cas9與靶位點(diǎn)識別的特異性主要依賴于gRNA與靠近PAM處10-12bp堿基的配對，而其余遠(yuǎn)離PAM處8-10bp堿基的錯(cuò)配對靶位點(diǎn)的識別影響不大。Cas9蛋白不具特異性17可編輯ppt沈彬，20156.降低脫靶效應(yīng)Cas9切口酶通過點(diǎn)突變的方法，使Cas9只有單鏈切割活性，類似于切口酶18可編輯pptYuHisanoetal.20146.降低脫靶效應(yīng)添加同源臂(homologyarm,HR)19可編輯pptNicolasWyvekensetal.2015FoKI-dCas96.降低脫靶效應(yīng)20可編輯pptFengZhangetal.20156.降低脫靶效應(yīng)CRISPR/Cpf1系統(tǒng)Cpf1系統(tǒng)更簡單一些，它只需要一條RNA。Cpf1酶也比標(biāo)準(zhǔn)SpCas9要小，使得它更易于傳送至細(xì)胞和組織內(nèi)。Cpf1以一種不同于Cas9的方式切割DNA。Cas9切割留下“平端”（bluntends）。Cpf1復(fù)合物生成的兩條鏈切口是偏移的，在裸露端留下了短懸端（overhang）。這預(yù)計(jì)有助于精確插入。Cpf1切口遠(yuǎn)離識別位點(diǎn)。Cpf1IsaSingleRNA-GuidedEndonucleaseofaClass2CRISPR