實(shí)驗(yàn)二堿裂解法小量制備質(zhì)粒

堿裂解法小量制備質(zhì)粒王歡歡二零一二.九實(shí)驗(yàn)二堿裂解法小量制備質(zhì)粒第1頁質(zhì)粒plasmid質(zhì)粒結(jié)構(gòu)非常簡單，只能在寄主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立增殖。

質(zhì)粒是細(xì)胞內(nèi)一個環(huán)狀小分子DNA，是進(jìn)行DNA重組慣用載體。作為一個含有本身復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制單位獨(dú)立于細(xì)胞主染色體之外，質(zhì)粒DNA上攜帶了部分基因信息，經(jīng)過基因表示后使其宿主細(xì)胞表現(xiàn)對應(yīng)性狀。F質(zhì)粒：F因子。使寄主染色體上基因與其一起轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞R質(zhì)粒：抗藥性因子，編碼一個或各種抗菌素抗性基因Col質(zhì)粒：編碼有控制大腸桿菌素合成基因

天然質(zhì)粒大小在1～200kb不等，但用作載體質(zhì)粒通常很小，普通為2～10kb，均以天然質(zhì)粒為基礎(chǔ)，經(jīng)過人工改造構(gòu)建而成。實(shí)驗(yàn)二堿裂解法小量制備質(zhì)粒第2頁大腸桿菌質(zhì)粒分子結(jié)構(gòu)環(huán)形染色體DNAE.coli質(zhì)粒Plasmid控制質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移基因細(xì)菌染色體外能夠自我復(fù)制環(huán)形雙鏈DNA分子抗菌素抗性基因?qū)嶒?yàn)二堿裂解法小量制備質(zhì)粒第3頁專用質(zhì)粒載體在天然質(zhì)粒基礎(chǔ)上，進(jìn)行人工改造和構(gòu)建質(zhì)粒載體，含有各種不一樣功效特征。不一樣質(zhì)粒DNA分子量差異顯著，可相差數(shù)百倍，有適于用作基因克隆載體，有則不適用。低拷貝質(zhì)粒：1~3份拷貝，“嚴(yán)緊型”stringentplasmid高拷貝質(zhì)粒：10~60份拷貝“松弛型”relaxedplasmid質(zhì)粒載體必須具備條件：含有復(fù)制起點(diǎn)含有抗菌素抗性基因含有若干限制酶單一識別位點(diǎn)含有較小分子量和較高拷貝數(shù)實(shí)驗(yàn)二堿裂解法小量制備質(zhì)粒第4頁質(zhì)粒構(gòu)型從細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA時，質(zhì)粒DNA通常會展現(xiàn)超螺旋構(gòu)型（SC構(gòu)型），另外也會有開環(huán)DNA存在（OC構(gòu)型)。在瓊脂糖凝膠電泳中，不一樣構(gòu)型同一個質(zhì)粒DNA含有不一樣電泳遷移率，走在前沿是SC構(gòu)型，OC構(gòu)型位于凝膠最終面，經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒之后產(chǎn)生L構(gòu)型，其位置則介于SC和OC構(gòu)型之間質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳圖A.從細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNAB.經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶切割后線性質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)二堿裂解法小量制備質(zhì)粒第5頁質(zhì)粒DNA分離與純化應(yīng)用質(zhì)粒作為基因克隆載體分子，主要條件是要取得批量純化質(zhì)粒DNA分子。寄主細(xì)胞裂解是關(guān)鍵，細(xì)胞破裂能使質(zhì)粒DNA分離，但又不污染過多染色體DNA。氯化銫密度梯度離心法堿變性法微量堿變性法

當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠快速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。實(shí)驗(yàn)二堿裂解法小量制備質(zhì)粒第6頁堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒溶液I懸浮--吸取1ml菌液于Eppendorf管中，12000r/min離心1min，棄盡上清。加入100μl冰預(yù)冷的solutionI，渦旋振蕩30s后置于冰上3min；溶液II裂解—加入200μlsolutionII，快速上下顛倒試管4-5次（切勿振蕩），置于冰上3-5min；溶液III沉淀DNA--加入150μl冰預(yù)冷的solutionIII，上下小心顛倒5-6次，置于冰上3-5min；抽提酚/氯仿/異戊醇---12000r/min離心5min。取上清（約450μl），加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25:24:1），混勻；醇沉無水乙醇---12000r/min離心10min。取上清（約400μl），加入2倍體積冰預(yù)冷的無水乙醇，-20°C靜置2h或O/N；漂洗70%乙醇--12000r/min離心5min，去上清，沉淀用400μl冰預(yù)冷70%乙醇洗2-3次，吹干沉淀；溶水RNA酶--加入30μl含0.5URNA酶

的ddH2O溶解沉淀，37°C靜置30min，-20°C保存。實(shí)驗(yàn)二堿裂解法小量制備質(zhì)粒第7頁注意關(guān)鍵點(diǎn)影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量原因：寄主菌株遺傳背景：使用endA基因突變大腸桿菌寄生菌株，使其失去了合成含有功效活性核酸內(nèi)切酶I能力，促進(jìn)質(zhì)粒DNA分子穩(wěn)定性質(zhì)粒拷貝數(shù)及分子大小溶液II要現(xiàn)用現(xiàn)配，NaOH與空氣中CO2反應(yīng)，SDS也會析出加溶液II后菌液澄清，并有拉絲現(xiàn)象，時間不能太長，也不能振蕩，防止基因組DNA斷裂，要上下顛倒混合。抽提要充分，如