專題-序列分析和引物設(shè)計課件

序列分析及引物設(shè)計專題郭志富2012年11月21日測序序列如何確定是否為目的序列？如何去除載體序列？如何轉(zhuǎn)換成有義鏈？如何找到序列起始和終止位置？一、序列分析部分第一步：BLAST輸入測序序列選擇物種選擇比對類型去除序列中此數(shù)字之前的序列，一般前50-80bp要么是載體序列，要么是測序不準(zhǔn)確的端部一般序列較短時，開始比出來的有可能是載體序列，此時需在測序序列中去掉比對數(shù)字之后的序列，也就是去除和載體序列一致的序列。把目的序列重新輸入進(jìn)行比對。第二步：序列整理與分析---DNAman軟件的應(yīng)用粘貼待分析序列序列的不同顯示類型（互補(bǔ)、反向、反向互補(bǔ)等）去除此部分后保存，即得到反轉(zhuǎn)后的有義鏈此圖對于設(shè)計體外表達(dá)引物或轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建引物十分重要。原則為：設(shè)計引物添加酶切位點必須是目的基因中沒有的酶切位點。多序列比對應(yīng)用：簡并引物設(shè)計差異位點分析（SNP或氨基酸差異等）進(jìn)化樹的構(gòu)建保守區(qū)DNAMAN1形式DNAMAN2形式GCG形式GDE形式選擇某區(qū)段引物設(shè)計專題分子生物學(xué)實驗基礎(chǔ)之生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院郭志富2011年11月8日簡并引物設(shè)計：基于保守區(qū)設(shè)計，用于保守區(qū)片段（或中間片段）獲得定量引物設(shè)計：用于半定量和實時熒光定量PCR標(biāo)記引物設(shè)計：基于特異區(qū)設(shè)計，用于標(biāo)記特異基因或特異物種材料。表達(dá)引物設(shè)計：用于原核體外表達(dá)、真核表達(dá)（轉(zhuǎn)基因）SNP引物設(shè)計：用于單核苷酸突變鑒定RACE及染色體步移引物設(shè)計：基于已知序列，用于獲取未知序列區(qū)段甲基化引物設(shè)計：用于檢測基因甲基化情況。。。。。。引物設(shè)計分類ＰＲＩＭＥＲ５.０的常規(guī)應(yīng)用結(jié)合ＤＮＡＭＡＮ激活軟件？獲取激活碼“Ctrl+V”輸入序列也可以把上下游引物分別設(shè)在序列的某一特定位置界定產(chǎn)物長度界定引物長度在55-65之間調(diào)整簡并性引物的設(shè)計1.基于保守性的簡并位置選擇（3‘端盡量不設(shè)置簡并）2.用Primer5.0檢測大致的評分（主要看Tm值和發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體情況）復(fù)制同源克隆---基于不同物種（范圍較廣）相應(yīng)序列保守區(qū)的引物設(shè)計---通過已知序列信息釣取未知的同源基因“Ctrl+V”輸入引物序列上游引物下游引物簡并引物的確定（上游）5-CA(A/G)AAGAT(C/G/T)GA(G/A)AT(C/A)TT(C/T)AAATC-3如確定該位置為下游引物3-GT(T/C)TTCTA(G/C/A)CT(C/T)TA(G/T)AA(G/A)TTTAG-5表達(dá)引物的設(shè)計ATGTGACCATGCATGCAGTTCGGACGAAGCCGTACGTAC-------------------------------------------------------------------------------------GCAGTGCAGTCATGCAAAGCGTACGTACGTAGAAGTAGAATCC起始信號肽編碼區(qū)N端編碼區(qū)終止ATGTGACCATGCATGCAGTTCGGACGAAGCCGTACGTAC-------------------------------------------------------------------------------------GCAGTGCAGTCATGCAAAGCGTACGTACGTAGAAGTAGAATCCATGTCGGACGAAGCCGTACGTA上游引物的設(shè)計添加ATG起始密碼子5-GCGAATTCATGTCGGACGAAGCCGTACGTA-3添加酶切位點1.編碼區(qū)內(nèi)不含該位點2.5’端添加保護(hù)堿基2-3個（網(wǎng)上有規(guī)律表）3.不能造成下游的移碼去除信號肽編碼區(qū)部分1.位置必須選擇含終止密碼子子位置或終止密碼子之后不遠(yuǎn)的一部分序列，2.記得要是有義鏈的反向互補(bǔ)鏈，3.同樣加酶切位點和保護(hù)堿基下游引物的設(shè)計定量引物的設(shè)計擴(kuò)增長度：100-300bp范圍即可以mRNA為模板進(jìn)行設(shè)計盡量避免引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等的出現(xiàn)引物設(shè)計避免DNA污染可能帶來的干擾，最好跨外顯子接頭區(qū)

Tm值在58-62度內(nèi)參引物設(shè)計：選取持家基因，如18SRNA、actin等長度與特異基因有所差異設(shè)計范圍在編碼區(qū)內(nèi)界定產(chǎn)物長度在100-300bp應(yīng)用Primer5.0軟件常規(guī)應(yīng)用功能即可標(biāo)記引物的設(shè)計（特異性）選擇非保守區(qū)段，特異性的位置設(shè)計在3‘末端；（SSR等特征序列的兩側(cè)）特異區(qū)段RACE及染色體步移引物設(shè)計：基于已知序列，用于獲取未知序列區(qū)段RACE引物的設(shè)計如果基因是多拷貝或為多基因家族，須在所得不同片段特異區(qū)設(shè)計與接頭引物Tm值相差不宜過大產(chǎn)生嵌套引物，位置合理SNP引物的設(shè)計何謂SNP？SNP位點設(shè)置在3‘最后一個堿基倒數(shù)第三個堿基人為引入突變----保證引物特異性5-CTAGGTACTGGATTAGT-3甲基化引物的設(shè)計何謂甲基化？----亞硫酸氫鹽----C變T準(zhǔn)確尋找甲基化位點，至少一個，多多益善設(shè)計野生型對照CpG位置盡量靠3‘端一段基因組的序列是：5-GAGGGGCGGCCGCACCGGG-3

甲基化引物：5-GAGGGGCGGTCGTATCGGG-3非甲基化引物：5-GAGGGGTGGTTGTATTGGG-33.MEGA3.1軟件的應(yīng)用第一步:點擊file,選擇”converttoMEGAformat”點擊選擇保存過的CLUSTAL