實(shí)驗(yàn)方案的格式

實(shí)驗(yàn)方案的格式實(shí)驗(yàn)方案的格式實(shí)驗(yàn)方案的格式資料僅供參考文件編號(hào)：2022年4月實(shí)驗(yàn)方案的格式版本號(hào)：A修改號(hào)：1頁(yè)次：1.0審核：批準(zhǔn):發(fā)布日期：實(shí)驗(yàn)方案一.【實(shí)驗(yàn)題目】：土壤中細(xì)菌的分離純化實(shí)驗(yàn)二.【實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思想】：細(xì)菌是具有很高實(shí)用價(jià)值的一類微生物,世界各國(guó)對(duì)其研究與資源開發(fā)極為重視.目前,國(guó)內(nèi)有關(guān)細(xì)菌的區(qū)系調(diào)查及資源開發(fā)雖然有一些報(bào)道,但對(duì)不同作物根際細(xì)菌的研究很少.甘肅天水麥積山海拔1742m,屬黃土高原潮濕區(qū),植物生長(zhǎng)土壤區(qū)有機(jī)質(zhì)含量豐富,本次實(shí)驗(yàn)將以該地區(qū)的落葉松、馬尾松、白巖松、野豌豆等作物生長(zhǎng)地區(qū)的土壤為材料,分離鑒定其中的細(xì)菌,探討不同作物根際土壤中細(xì)菌分布數(shù)量及種類的差異,并且分析每一種菌種在植物生長(zhǎng)過程中所起的作用，最后以此為依據(jù)來推斷麥積山大片地區(qū)內(nèi)土壤中微生物的分布豐富情況和它們對(duì)植物生長(zhǎng)作出的巨大貢獻(xiàn).三.【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹浚?.學(xué)會(huì)培養(yǎng)基最基本的制備方法。2.學(xué)會(huì)最基本的微生物滅菌、接種等基本操作過程。2.掌握最基本的分離、純化微生物的一系列操作操作。四.【試驗(yàn)方法】：取天水麥積山不同植物根部的土壤作為土樣，通過對(duì)其土壤中微生物的一系列培養(yǎng)、分離、篩選最終分離出細(xì)菌得菌株，并稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行數(shù)量測(cè)定四．實(shí)驗(yàn)原理:1.菌種來源：由于各種細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需求不同，在不同地方采樣對(duì)選取所要的細(xì)菌含量和其它雜菌含量的多少直接有關(guān)，所以選擇微生物含量有可能豐富的土壤（天水麥積山植物根區(qū)）中采樣。2.培養(yǎng)基的選?。簽榱耸顾募?xì)菌能很好的生長(zhǎng)，其它微生物生長(zhǎng)受到一定的抑制，要用選擇培養(yǎng)基。還要把細(xì)菌與其他微生物相區(qū)別，還要用鑒別培養(yǎng)基。為了達(dá)到既是選擇培養(yǎng)基又是鑒別培養(yǎng)基，選取牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。3.培養(yǎng)及分離純化：通過涂布培養(yǎng)法、平板劃線法等方法達(dá)到分離純化的目的。4.保藏：通過分離純化得到的菌種，接種與斜面培養(yǎng)基上，到一定時(shí)間后進(jìn)行傳代培養(yǎng)保藏，使其不死亡、減少突變所引起的生物學(xué)性狀的改變。5.通過形態(tài)與染色鑒定：由于各種微生物有其特定的菌落形態(tài)特征和單細(xì)胞形態(tài)特征，可通過這些形態(tài)進(jìn)行鑒定。還由于細(xì)胞壁組成不同可進(jìn)行鑒別染色法進(jìn)行鑒定，也可用產(chǎn)生不產(chǎn)生芽孢進(jìn)行芽孢染色。通過以上方法可對(duì)所分離純化的菌種進(jìn)行初步的鑒定。6.通過生理生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定：各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異，如表現(xiàn)在對(duì)對(duì)大分子糖類和蛋白質(zhì)的分解能力，以及分解代謝的最終產(chǎn)物的不同，反映出他們有不同的酶系。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室允許的條件下做了糖類發(fā)酵與氧化、是否能產(chǎn)生過氧化氫酶以及是否含有細(xì)胞色素氧化酶等生理生化試驗(yàn)，進(jìn)行再次鑒定。五【.實(shí)驗(yàn)材料】：1.器材：玻璃燒杯、天平、搪瓷燒杯、三角瓶、量筒、漏斗、試管、培養(yǎng)皿、吸管、培養(yǎng)基分裝器、電爐、接種環(huán)、移液槍、PH試紙（—9）、牛角匙、牛皮紙、棉花、紗繩、高壓蒸汽滅菌鍋等。2.牛肉膏、蛋白胨、NaCl、1mol/LNaCl、1mol/LHCl。六．實(shí)驗(yàn)步驟：1.配置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：(1).配方及其配量：牛肉膏，蛋白胨1gNaCl,瓊脂粉水100ml注：—，每份如此，根據(jù)需要可改變量進(jìn)行配置。（2）.稱取藥品:按培養(yǎng)及配方與配量分別稱取藥品，取少于總量的水于燒杯中，將各個(gè)培養(yǎng)及成分（瓊脂除外）逐一加入水中待溶。（3）．加熱溶解：將玻璃被放在石棉網(wǎng)上（搪瓷燒杯可直接用文火加熱），用文火加熱并不斷攪拌，促使各藥品快速溶解，然后補(bǔ)充水分之所需培養(yǎng)基的量。（4）調(diào)節(jié)PH值：初配好的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液是微酸性的，故需用1mol/LNaOH調(diào)PH至。為避免調(diào)解時(shí)過堿，應(yīng)緩慢加入NaOH液，即要邊滴加NaOH邊攪勻培養(yǎng)液，然后用PH試紙側(cè)其酸堿度值。檢測(cè)培養(yǎng)基的pH，若pH偏酸，可滴加1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙檢測(cè)，直至達(dá)到所需pH范圍。若偏堿，則用1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。應(yīng)注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度.（5）.過濾:液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利結(jié)果的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基．此步可省略(6)分裝:披實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi)。分裝時(shí)可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上面造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1／5，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶?jī)?nèi)以不超過其容積內(nèi)一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/4為宜．滅菌后垂直待凝。(7).加棉塞試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞，棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利透氣的作用。要使棉塞總長(zhǎng)約3／5塞人試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的透氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時(shí)也可用試管帽或塑料蓋代替棉塞。(8)包扎:加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報(bào)紙，以防滅菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)先把試管扎成捆后，再于棉塞外包—層牛皮紙。然后用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。(9)滅菌:將上述培養(yǎng)基于121℃濕熱滅菌20min。如因特殊情況沒能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放人冰箱內(nèi)暫時(shí)保存.（10）．?dāng)[斜面滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻至50—60℃，然后制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長(zhǎng)木條上,并調(diào)整斜度,使斜面長(zhǎng)度不超過試管總長(zhǎng)的一半.（11）.無菌檢查:將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)24-48h,無菌生長(zhǎng)時(shí)可以使用,或放置在冰箱或清潔的櫥內(nèi),備用.2.配置無菌生理鹽水：稱NaCl至盛有100ml蒸餾水的三角瓶中，塞上棉塞，塞外包上一層牛皮紙，至加壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)在121℃下滅菌20min即為無菌生理鹽水。3取樣并制備土壤稀釋液：（1）.土壤前處理;取出采集的土樣，去除其中較大的雜質(zhì)，將其攆碎、攆細(xì)待用。（2）制土液：稱出10克于帶有無菌玻璃珠的250ml錐形瓶中，用已滅菌的量筒量取90ml無菌水溶解，振搖約20分鐘，使土樣與水充分混勻。點(diǎn)燃酒精燈在火焰附近，用無菌移液槍從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌移液槍從此試管中吸取1ml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的土壤溶液。4.涂布接種：將上述9個(gè)平板分別貼上標(biāo)簽10-4、10-5、10-6各三個(gè)，然后用無菌移液槍分別由10-4、10-5、10-6三管土壤稀釋液中各吸取對(duì)號(hào)放入已寫好稀釋度的平板中，用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕的涂布均勻，室溫下靜置5到10分鐘，使菌液吸附進(jìn)培養(yǎng)基?！咀⒁猓核械慕臃N工作必須在無菌室里面進(jìn)行，在接種之前必須先進(jìn)行滅菌】5．培養(yǎng)。30攝氏度恒溫室中培養(yǎng)3天6.觀察并進(jìn)一步分離純化。觀察菌落特征，并記錄。再倒兩個(gè)平板。點(diǎn)燃的酒精燈附近，從稀釋度合適的培養(yǎng)平板上挑取帶有溶磷圈的菌落，在新制的平板上劃線分離，30攝氏度恒溫室中培養(yǎng)3天7．斜面培養(yǎng)放置斜面。挑取單個(gè)菌落接種到3個(gè)斜面上培養(yǎng)。置于28～30℃恒溫箱中培養(yǎng)７２h.與此同時(shí)，用單菌落進(jìn)行以下鑒定試驗(yàn)革蘭氏染色涂片常規(guī)涂片法初染滴加結(jié)晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)于涂片上，染色1～2min，傾去染色液，細(xì)水沖洗至洗出液為無色。媒染用碘液媒染約lmin，水洗。脫色用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時(shí)，立即水洗，終止脫色，干燥。復(fù)染在涂片上滴加番紅液復(fù)染約2～3min，水洗，然后用吸水紙吸干。鏡檢干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應(yīng)性。菌體被染成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽(yáng)性菌（G+），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。清潔顯微鏡。先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯擦去鏡頭上的殘留油跡，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。芽孢染色(1）將培養(yǎng)的菌，作涂片、干燥、固定。（2）滴加3—5滴孔雀綠染液于已固定的涂片上。（3）用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時(shí)可添加少許染液。加熱時(shí)間從染液冒蒸汽時(shí)開始計(jì)算約4—5分鐘。這一步也可不加熱，改用飽和的孔雀綠水溶液（約7．6％）染10分鐘。（4）傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。（5）用番紅水溶液復(fù)染1分鐘，水洗。（6）待干燥后，置油鏡觀察，七.計(jì)數(shù)：常用的有平板菌落計(jì)數(shù)法，是根據(jù)每個(gè)活的細(xì)菌能長(zhǎng)出一個(gè)菌落的原理設(shè)計(jì)的。取一定容量的菌懸液，作一系列的倍比稀釋，然后將定量的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，可算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù)。此法靈敏度高，是一種檢測(cè)污染活菌數(shù)的方法，也是目前國(guó)際上許多國(guó)家所采用的方法。使用該法應(yīng)注意：①一般選取菌落數(shù)在30～300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，過多或過少均不準(zhǔn)確；②為了防止菌落蔓延，影響計(jì)數(shù)，可在培養(yǎng)基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物另活菌計(jì)數(shù)法，其原理是每個(gè)活細(xì)菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長(zhǎng)條件下可以通過生長(zhǎng)形成菌落。將待測(cè)樣品經(jīng)一系列10倍稀釋，然后選擇三個(gè)稀釋度的菌液，分別取放入無菌平皿，再倒入適量的已熔化并冷至45℃