基因敲除小鼠技術(shù)

精品文檔轉(zhuǎn)基因、基因敲入/敲除動物技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)感謝閱讀歷史，經(jīng)典技術(shù)如原核顯微注射、胚胎干細胞顯微注射技術(shù)一直以來經(jīng)久感謝閱讀感謝閱讀一、技術(shù)介紹與研究進展轉(zhuǎn)/敲除動物技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)感謝閱讀十年代誕生以來，至今已有近四十年的歷史，經(jīng)典技術(shù)如原核顯微注射、且如同剪切酶和抗體等常規(guī)分子生物學(xué)試劑的制備技術(shù)一樣，逐漸從基礎(chǔ)研究藥物和數(shù)以千計的優(yōu)秀文章。盡管如此，傳統(tǒng)技術(shù)仍然存在一些難以克服的缺陷，如步驟繁瑣、周期漫長、成功率低、費用高昂等，而ZFN和等新技術(shù)的出現(xiàn)，或有可能將這一局面徹底改變。感謝閱讀二、同源重組技術(shù)原理基因敲除鼠技術(shù)是上世紀(jì)年代中后期基于同源重組的原理發(fā)展起來的，Capecchi和Smithies在1987年根據(jù)同源重組（homologousrecombination）

的原理，首次實現(xiàn)了ES的外源基因的定點整合（targetedintegration），這一

技術(shù)稱為基因打靶（genetargeting）或基因敲除（geneknockout），利用

這種ESKOMice:knockoutmice;

由于這一工作，Capecchi和Smithies于2007年與Evans分享了諾貝爾醫(yī)學(xué)

獎。精品文檔放心下載homologousrecombinationsister

chromatin)之間或同一染色體上含有同源序列的分子之間或分子之內(nèi)的重

有相同片段的重組載體，將重組載體導(dǎo)入到胚胎干細胞后外源的重組載體與胚胎干細胞中相同的片段會發(fā)生同源重組，如圖1所示：精品文檔放心下載1歡迎下載。精品文檔圖1.基因敲除鼠制作同源重組原理示意圖三、制作流程圖2.基因敲除鼠制作過程示意圖1.Knockout載體設(shè)計與構(gòu)建根據(jù)研究項目具體情況和要求把目的基因和與細胞內(nèi)靶基因特異片段同源的片段都重組到帶有標(biāo)記基因(如基因，TK)的載體上，成為重組的Knockout載體。精品文檔放心下載2歡迎下載。精品文檔2.KnockoutES細胞篩選Knockout載體測序驗證正確后，將載體線性化，然后電轉(zhuǎn)入ES細胞，通過載體

上的正負篩選基因獲得陽性的KnockoutESPCR鑒定打靶載體正確

插入的ES用于SouthernBlotSouthernBlot鑒定的

Knockout精品文檔放心下載ES擴大培養(yǎng)并液氮保存。謝謝閱讀3.KnockoutES細胞囊胚注射得到嵌合體小鼠精品文檔放心下載擴增經(jīng)鑒定插入或置換片段位置正確的KnockoutES方式將一定數(shù)量的KnockoutES到假孕的小鼠子宮中。待后代小鼠出生后，通過小鼠的毛色中來源于ES細胞

毛色的比例判斷嵌合程度的高低，以及該小鼠的后代中可能獲得生殖系傳遞能力。謝謝閱讀4.由嵌合體小鼠繁殖出生殖遺傳系Knockout小鼠感謝閱讀PCR鼠是否含有打靶序列。如有，則該小鼠為具備生殖遺傳能力的Knockout小鼠(F1

代鼠)。感謝閱讀5.Knockout小鼠生殖系傳遞鑒定PCR基因型鑒定謝謝閱讀的方法驗證嵌合體小鼠生殖系傳遞能力。四、基因敲除常見方法一、常規(guī)基因敲除鼠（ConventionalKnockout）精品文檔放心下載3歡迎下載。精品文檔感謝閱讀區(qū)域用Cassette替換掉。這樣的小鼠其全身所有的組織和細胞中都不表達響，而且這個基因沒有胚胎致死性。精品文檔放心下載二、條件性基因敲除小鼠（Knockout）精品文檔放心下載條件性基因敲除小鼠是通過基因打靶，把兩個位點放到目的基因一個或幾

CreCre胞中敲除該基因，而該基因在其他組織或細胞表達正常。謝謝閱讀）用于研究該基精品文檔放心下載因在特定的組織或細胞中的生理病理功能。三、基因敲入小鼠（Knockin）4歡迎下載。精品文檔感謝閱讀用小鼠的表達調(diào)控元件指導(dǎo)目的基因表達。此類基因敲入鼠一般用于藥物的篩選，信號通路的研究等。精品文檔放心下載獲得嵌合體及之后品系純化詳細流程：5歡迎下載。精品文檔五、基因敲除其他方法一、ZFN技術(shù)制作基因敲除鼠ZFN能夠識別并結(jié)合指定的基因序列位點，并高效精確地切斷。隨后細胞利用天然的修復(fù)過程來實現(xiàn)DNA所自然發(fā)生的同源重組，其效率只有百萬分之一，而ZFN的基因敲除效率能

達到。利用這些技術(shù)進行小鼠基因的定點敲除和敲入，可以把時間從一年

縮短到幾個月。謝謝閱讀這項技術(shù)中設(shè)計特異性的ZFN法設(shè)計高特異性的ZFN，但ZFN的脫靶（off），也就是把不該切的地方切

ZFN技術(shù)進行小鼠的基因修

飾還無法完全取代傳統(tǒng)技術(shù)。謝謝閱讀二、TALEN技術(shù)制作基因敲除鼠TALEN技術(shù)是一種嶄新的分子生物學(xué)工具?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)，來自一種植物細菌的

TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應(yīng)關(guān)系。

利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任意序列的模塊化蛋白，從而達

到靶向操作內(nèi)源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能識別任意目標(biāo)基因序

列，以及識別序相等或更好的靈

活性，TALEN

技術(shù)進行小鼠的基因修飾仍然無法取代傳統(tǒng)技術(shù)。謝謝閱讀6歡迎下載。精品文檔六、常見問題與解答什么是ES細胞顯微注射？體小鼠的組織，將同時含有來源于囊胚的細胞和胚胎干細胞。嵌合體小鼠必須

靶基因（來源于胚胎干細胞）穩(wěn)定的生殖系傳遞的小鼠。一般情況下，大約能獲得繼承了目的基因的后代。精品文檔放心下載嵌合體感謝閱讀機體身上有兩種或兩種以上染色體組成不同的細胞系同時存在,彼此能夠耐受,

不產(chǎn)生排斥反應(yīng),謝謝閱讀精品文檔放心下載精品文檔放心下載7歡迎下載。精品文檔生的個體也叫嵌合體，即該生物體中嵌合了兩種不同遺傳結(jié)構(gòu)的細胞（一種是謝謝閱讀基因型被改變了的細胞，另一種是原來的基因型的細胞）。感謝閱讀3.條件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系統(tǒng)是源于P1噬菌體的一個重組體系,由Cre酶和相應(yīng)的位點組成,它能導(dǎo)致重組發(fā)生在特定的序列處(LoxP位點),該系統(tǒng)可以將外

源基因定點整合到染色體上或?qū)⑻囟ㄆ蝿h除?；贑re-LoxP的基因打

靶的基因組中引入謝謝閱讀精品文檔放心下載Cre介導(dǎo)的重

組來實現(xiàn)靶基因的遺傳修飾或改變。Cre-LoxP系統(tǒng)既可以在細胞水平上用

Cre重組酶表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶細胞，通過識別LoxP位點將抗性標(biāo)記基因切除，又可

以在個體水平上將重組雜合子小鼠與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，篩選子代小鼠就

可得到刪除外源標(biāo)記基因的條件性敲除小鼠。謝謝閱讀4.如何鑒定和挑選嵌合體？謝謝閱讀根據(jù)毛色去鑒定。注射的ES和囊胚來源不同的小鼠品系。它們的毛色不同。因精品文檔放心下載此可以根據(jù)毛色的嵌合率來鑒定和挑選嵌合體。5.ROSA26與定點插入？答：利用同源重組技術(shù)，把外面的片段或者其他片段，定點插入到

ROSA26位置。ROSA26是一個安全區(qū)域，外源性的基因定點插入這個位點不會影

響其他基因的表達。精品文檔放心下載謝謝閱讀七、Farms,Inc.成立于年，是位于紐約哈得孫河谷地區(qū)的一家家族企業(yè)。自成立以來，公司一直精品文檔放心下載是世界上最大的實驗室嚙齒動物供應(yīng)商之一，在持續(xù)生產(chǎn)高品質(zhì)、定義明確的謝謝閱讀Taconic在轉(zhuǎn)基因小鼠的定制設(shè)計和生產(chǎn)、小感謝閱讀鼠和大鼠育種、屏障系統(tǒng)、基因和動物健康方面的專業(yè)經(jīng)驗為利用活體模型開展藥物開發(fā)的研究人員提供支持。在美國和歐洲設(shè)有六個育種工廠和三個服務(wù)實驗室，員工人數(shù)超過名，致力于從謝謝閱讀8歡迎下載。精品文檔賽業(yè)生物科技是目前國內(nèi)探生網(wǎng)提醒：最大的轉(zhuǎn)基因/基因敲除鼠技術(shù)服務(wù)供應(yīng)商，旗下的

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