生物信息實(shí)驗(yàn)

生物信息實(shí)驗(yàn)生物信息實(shí)驗(yàn)生物信息實(shí)驗(yàn)V:1.0精細(xì)整理，僅供參考生物信息實(shí)驗(yàn)日期：20xx年X月生物信息學(xué)實(shí)驗(yàn)講義

目錄實(shí)驗(yàn)1.計(jì)算機(jī)網(wǎng)上操作基本技能訓(xùn)練……………1實(shí)驗(yàn)2.常用分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫類型、文件格式及數(shù)據(jù)庫查詢…2實(shí)驗(yàn)3.核酸序列分析………………3實(shí)驗(yàn)4.多重序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建………5實(shí)驗(yàn)5.PCR引物設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)………7實(shí)驗(yàn)6.蛋白質(zhì)序列分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測………………9

實(shí)驗(yàn)一計(jì)算機(jī)網(wǎng)上操作基本技能訓(xùn)練【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、熟練掌握上網(wǎng)操作基本方法及技能。2、掌握利用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行資料搜集的多種方法【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】1、熟悉InternetExporer的基本使用方法及相關(guān)技巧，熟悉InternetExporer網(wǎng)絡(luò)配置。2、掌握免費(fèi)電子郵箱的申請(qǐng)方法并且能收發(fā)電子郵件。3、掌握網(wǎng)上軟件下載及安裝方法。4、用IE或netscape等瀏覽工具瀏覽、搜索各類信息5、運(yùn)用FlashGet或網(wǎng)絡(luò)螞蟻等下載工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)資料的下載以及運(yùn)用各種上傳工具上傳資料到網(wǎng)絡(luò)6、利用Winzip或Winrar等壓縮工具進(jìn)行文件的壓縮與解壓7、學(xué)習(xí)使用ftp8、在網(wǎng)上自主學(xué)習(xí)了解生物信息學(xué)知識(shí)【作業(yè)】1、在D盤建立一個(gè)以自己名字命名的文件夾。2、申請(qǐng)一個(gè)自已的免費(fèi)電子郵箱，并發(fā)一封電子郵件到liushunhui@。3、從網(wǎng)絡(luò)上下載任意一個(gè)軟件，并安裝到計(jì)算機(jī)上。4、用FTP獲取一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件比如rasmol，下載后保存到你的文件夾中，以便以后運(yùn)用其進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。5、下載一個(gè)有關(guān)生物信息學(xué)的教程，并保存到你的文件夾中，進(jìn)行參考學(xué)習(xí)。附表:相關(guān)軟件及搜索工具網(wǎng)址搜索工具或軟件名稱參考網(wǎng)站地址Winrar/index.htmwinzip/index.htm網(wǎng)絡(luò)螞蟻Netants/index.htmFlashGet/index.htmrasmolftp://ftp.dcs.ed.ac.ukGoogle搜索引擎Yahoo搜索引擎新浪搜索引擎搜狐搜索引擎

實(shí)驗(yàn)二常用數(shù)據(jù)庫類型、文件格式及數(shù)據(jù)庫查詢【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、掌握序列檢索的操作方法；2、熟悉GenBank數(shù)據(jù)庫序列格式及其主要字段的含義；3、了解EBML數(shù)據(jù)庫序列格式及其主要字段的含義；4、熟悉GenBank數(shù)據(jù)庫序列格式的FASTA序列格式顯示與保存；5、熟悉分子生物學(xué)軟件的搜索與下載?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】1、使用Entrez信息查詢系統(tǒng)檢索核酸序列BC060830和NM_000230，連接提取該序列內(nèi)容，閱讀序列格式的解釋，理解其含義；2、GenBank數(shù)據(jù)庫序列格式的FASTA序列格式顯示與保存；3、使用SRS信息查詢系統(tǒng)檢索核酸序列BC060830，連接提取該序列內(nèi)容，閱讀序列格式的解釋，理解其含義；4、使用搜索引擎搜索并下載DNAClub和BioEdit軟件?！咀鳂I(yè)】寫出核酸序列BC060830在GenBank數(shù)據(jù)庫的主要字段的含義；寫出核酸序列NM_000230在EBML數(shù)據(jù)庫的主要字段的含義

實(shí)驗(yàn)三核酸序列分析【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆找阎蛭粗蛄薪邮芴?hào)的核酸序列檢索的基本步驟；掌握使用BioEdit軟件進(jìn)行核酸序列的基本分析；熟悉基于核酸序列比對(duì)分析的真核基因結(jié)構(gòu)分析（內(nèi)含子/外顯子分析）；了解基因的電子表達(dá)譜分析?！緦?shí)驗(yàn)原理】針對(duì)核酸序列的分析就是在核酸序列中尋找基因，找出基因的位置和功能位點(diǎn)的位置，以及標(biāo)記已知的序列模式等過程。在此過程中，確認(rèn)一段DNA序列是一個(gè)基因需要有多個(gè)證據(jù)的支持。一般而言，在重復(fù)片段頻繁出現(xiàn)的區(qū)域里，基因編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)不太可能出現(xiàn)；如果某段DNA片段的假想產(chǎn)物與某個(gè)已知的蛋白質(zhì)或其它基因的產(chǎn)物具有較高序列相似性的話，那么這個(gè)DNA片段就非常可能屬于外顯子片段；在一段DNA序列上出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)上的規(guī)律性，即所謂的“密碼子偏好性”，也是說明這段DNA是蛋白質(zhì)編碼區(qū)的有力證據(jù)；其它的證據(jù)包括與“模板”序列的模式相匹配、簡單序列模式如TATABox等相匹配等。一般而言，確定基因的位置和結(jié)構(gòu)需要多個(gè)方法綜合運(yùn)用，而且需要遵循一定的規(guī)則：對(duì)于真核生物序列，在進(jìn)行預(yù)測之前先要進(jìn)行重復(fù)序列分析，把重復(fù)序列標(biāo)記出來并除去；選用預(yù)測程序時(shí)要注意程序的物種特異性；要弄清程序適用的是基因組序列還是cDNA序列；很多程序?qū)π蛄虚L度也有要求，有的程序只適用于長序列，而對(duì)EST這類殘缺的序列則不適用。1.重復(fù)序列分析對(duì)于真核生物的核酸序列而言，在進(jìn)行基因辨識(shí)之前都應(yīng)該把簡單的大量的重復(fù)序列標(biāo)記出來并除去，因?yàn)楹芏嗲闆r下重復(fù)序列會(huì)對(duì)預(yù)測程序產(chǎn)生很大的擾亂，尤其是涉及數(shù)據(jù)庫搜索的程序。2.數(shù)據(jù)庫搜索把未知核酸序列作為查詢序列，在數(shù)據(jù)庫里搜索與之相似的已有序列是序列分析預(yù)測的有效手段。在理論課中已經(jīng)專門介紹了序列比對(duì)和搜索的原理和技術(shù)。但值得注意的是，由相似性分析作出的結(jié)論可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的流傳；有一定比例的序列很難在數(shù)據(jù)庫里找到合適的同源伙伴。對(duì)于EST序列而言，序列搜索將是非常有效的預(yù)測手段。3.編碼區(qū)統(tǒng)計(jì)特性分析統(tǒng)計(jì)獲得的經(jīng)驗(yàn)說明，DNA中密碼子的使用頻率不是平均分布的，某些密碼子會(huì)以較高的頻率使用而另一些則較少出現(xiàn)。這樣就使得編碼區(qū)的序列呈現(xiàn)出可察覺的統(tǒng)計(jì)特異性，即所謂的“密碼子偏好性”。利用這一特性對(duì)未知序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可以發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)的粗略位置。這一類技術(shù)包括：雙密碼子計(jì)數(shù)(統(tǒng)計(jì)連續(xù)兩個(gè)密碼子的出現(xiàn)頻率)；核苷酸周期性分析(分析同一個(gè)核苷酸在3,6,9,...位置上周期性出現(xiàn)的規(guī)律)；均一/復(fù)雜性分析(長同聚物的統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù))；開放可讀框架分析等。4.啟動(dòng)子分析啟動(dòng)子是基因表達(dá)所必需的重要序列信號(hào)，識(shí)別出啟動(dòng)子對(duì)于基因辨識(shí)十分重要。有一些程序根據(jù)實(shí)驗(yàn)獲得的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合特性來描述啟動(dòng)子的序列特征，并依次作為啟動(dòng)子預(yù)測的依據(jù)，但實(shí)際的效果并不十分理想，遺漏和假陽性都比較嚴(yán)重。總的來說，啟動(dòng)子仍是值得繼續(xù)研究探索的難題。5.內(nèi)含子/外顯子剪接位點(diǎn)剪接位點(diǎn)一般具有較明顯的序列特征，但是要注意可變剪接的問題。由于可變剪接在數(shù)據(jù)庫里的注釋非常不完整，因此很難評(píng)估剪接位點(diǎn)識(shí)別程序預(yù)測剪接位點(diǎn)的敏感性和精度。如果把剪接位點(diǎn)和兩側(cè)的編碼特性結(jié)合起來分析則有助于提供剪接位點(diǎn)的識(shí)別效果。6.翻譯起始位點(diǎn)對(duì)于真核生物，如果已知轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，并且沒有內(nèi)含子打斷5'非翻譯區(qū)的話，“Kozak規(guī)則”可以在大多數(shù)情況下定位起始密碼子。原核生物一般沒有剪接過程，但在開放閱讀框中找正確的起始密碼子仍很困難。這時(shí)由于多順反操縱子的存在，啟動(dòng)子定位不象在真核生物中起關(guān)鍵作用。對(duì)于原核生物，關(guān)鍵是核糖體結(jié)合點(diǎn)的定位，可以由多個(gè)程序提供解決方案。7.翻譯終止信號(hào)PolyA和翻譯終止信號(hào)不象起始信號(hào)那么重要，但也可以輔助劃分基因的范圍。8.其它綜合基因預(yù)測工具除了上面提到的程序之外，還有許多用于基因預(yù)測的工具，它們大多把各個(gè)方面的分析綜合起來，對(duì)基因進(jìn)行整體的分析和預(yù)測。多種信息的綜合分析有助于提高預(yù)測的可靠性，但也有一些局限：物種適用范圍的局限；對(duì)多基因或部分基因，有的預(yù)測出的基因結(jié)構(gòu)不可靠；預(yù)測的精度對(duì)許多新發(fā)現(xiàn)基因比較低；對(duì)序列中的錯(cuò)誤很敏感；對(duì)可變剪接、重疊基因和啟動(dòng)子等復(fù)雜基因語法效果不佳。9.tRNA基因識(shí)別tRNA基因識(shí)別比編碼蛋白質(zhì)的基因識(shí)別簡單，目前基本已經(jīng)解決了用理論方法預(yù)測tRNA基因的問題。tRNAscan-SE工具中綜合了多個(gè)識(shí)別和分析程序，通過分析啟動(dòng)子元件的保守序列模式、tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析、轉(zhuǎn)錄控制元件分析和除去絕大多數(shù)假陽性的篩選過程，據(jù)稱能識(shí)別99%的真tRNA基因。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】1、使用Entrez或SRS信息查詢系統(tǒng)檢索人瘦素(leptin)的mRNA、基因組DNA、外顯子和5’調(diào)控區(qū)(promoter)等核酸序列，連接提取該序列內(nèi)容，閱讀序列格式的解釋，理解其含義；2、使用BioEdit軟件對(duì)上述核酸序列進(jìn)行分子質(zhì)量、堿基組成、堿基分布、序列變換以及限制性酶切分析等基本分析，并從BioEdit軟件的“help”欄了解該軟件的其它功能；3、使用BioEdit軟件對(duì)人瘦素(leptin)的mRNA序列進(jìn)行可讀框架分析；4、使用NCBI查詢系統(tǒng)進(jìn)行人瘦素(leptin)的基因組序列分析和基因的電子表達(dá)譜分析；5、使用Blast2進(jìn)行人瘦素(leptin)mRNA序列與其外顯子或基因組序列的比對(duì)分析。【實(shí)驗(yàn)方法】1、調(diào)用Internet瀏覽器，并在其地址欄輸入Entrez網(wǎng)址：/Entrez；2、在Search后的選擇欄中選擇nucleotide；3、在輸入欄輸入homosapiensleptin;4、點(diǎn)擊go后顯示序列接受號(hào)及序列名稱等;5、查找人leptin(obesityhomolog,mouse)mRNA序列（提示：NM_000230），點(diǎn)擊序列接受號(hào)后顯示序列詳細(xì)信息；6、將序列轉(zhuǎn)為FASTA格式保存7、根據(jù)從NM_000230了解的基因定位信息查找人瘦素的基因組DNA(Contig)的序列接受號(hào)及序列識(shí)別號(hào)，點(diǎn)擊序列接受號(hào)顯示序列詳細(xì)信息；8、在輸入欄輸入homosapiensleptinexon查找人瘦素外顯子序列；9、在輸入欄輸入homosapiensleptinpromoter查找人瘦素5’調(diào)控區(qū)序列;10、按上述步驟用SRS信息查詢系統(tǒng)檢索人瘦素(leptin)的mRNA、基因組DNA、外顯子和5’調(diào)控區(qū)(promoter)等核酸序列；11、將上述核酸序列輸入BioEdit和DNAClub軟件進(jìn)行序列基本分析；12、打開BioEdit軟件，點(diǎn)擊“help”欄，閱讀“contents”；13、將人瘦素(leptin)的mRNA序列輸入BioEdit軟件進(jìn)行可讀框架分析：打開BioEdit軟件→將人瘦素(leptin)mRNA的FASTA格式序列輸入分析框→點(diǎn)擊左側(cè)序列說明框中的序列說明→點(diǎn)擊sequence欄→選擇nucleicacid→點(diǎn)擊findnextORF→查看起始密碼位置和編碼區(qū)范圍（57→557）；14、參照教材使用NCBI查詢系統(tǒng)進(jìn)行人瘦素(leptin)的基因組序列分析和基因的電子表達(dá)譜分析；15、人瘦素(leptin)mRNA序列與其外顯子或基因組序列的比對(duì)分析：調(diào)用Internet瀏覽器并在其地址欄輸入Blast2網(wǎng)址(/Entrezgorf/bl2/html)→將人瘦素(leptin)mRNA和外顯子的FASTA格式序列分別輸入sequence2和sequence1分析框或?qū)⑷耸菟?leptin)mRNA和基因組序列的GI版本號(hào)輸入sequence2和sequence1的GI版本號(hào)框→點(diǎn)擊Align后顯示兩序列比對(duì)的詳細(xì)信息→查找mRNA序列上各外顯子的位置。【作業(yè)】1、歸納對(duì)人瘦素(leptin)的核酸序列分析的結(jié)果，列出主要的分析結(jié)果；2、總結(jié)核酸序列分析的基本步驟，相互對(duì)比結(jié)果，指出應(yīng)注意的事項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)四多重序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、熟悉構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)生樹的基本過程，獲得使用不同建樹方法、建樹材料和建樹參數(shù)對(duì)建樹結(jié)果影響的正確認(rèn)識(shí)；2、掌握使用Clustalx進(jìn)行序列多重比對(duì)的操作方法；3、掌握使用Phylip軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的操作方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】在現(xiàn)代分子進(jìn)化研究中，根據(jù)現(xiàn)有生物基因或物種多樣性來重建生物的進(jìn)化史是一個(gè)非常重要的問題。一個(gè)可靠的系統(tǒng)發(fā)生的推斷，將揭示出有關(guān)生物進(jìn)化過程的順序，有助于我們了解生物進(jìn)化的歷史和進(jìn)化機(jī)制。對(duì)于一個(gè)完整的進(jìn)化樹分析需要以下幾個(gè)步驟：=1\*GB2⑴要對(duì)所分析的多序列目標(biāo)進(jìn)行比對(duì)（alignment）。=2\*GB2⑵要構(gòu)建一個(gè)進(jìn)化樹（phyligenetictree）。構(gòu)建進(jìn)化樹的算法主要分為兩類：獨(dú)立元素法（discretecharactermethods）和距離依靠法（distancemethods）。所謂獨(dú)立元素法是指進(jìn)化樹的拓?fù)湫螤钍怯尚蛄猩系拿總€(gè)堿基/氨基酸的狀態(tài)決定的（例如：一個(gè)序列上可能包含很多的酶切位點(diǎn)，而每個(gè)酶切位點(diǎn)的存在與否是由幾個(gè)堿基的狀態(tài)決定的，也就是說一個(gè)序列堿基的狀態(tài)決定著它的酶切位點(diǎn)狀態(tài)，當(dāng)多個(gè)序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析時(shí)，進(jìn)化樹的拓?fù)湫螤钜簿陀蛇@些堿基的狀態(tài)決定了）。而距離依靠法是指進(jìn)化樹的拓?fù)湫螤钣蓛蓛尚蛄械倪M(jìn)化距離決定的。進(jìn)化樹枝條的長度代表著進(jìn)化距離。獨(dú)立元素法包括最大簡約性法（MaximumParsimonymethods）和最大可能性法（MaximumLikelihoodmethods）；距離依靠法包括除權(quán)配對(duì)法（UPGMAM）和鄰位相連法（Neighbor-joining）。=3\*GB2⑶對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行評(píng)估，主要采用Bootstraping法。進(jìn)化樹的構(gòu)建是一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)問題，我們所構(gòu)建出來的進(jìn)化樹只是對(duì)真實(shí)的進(jìn)化關(guān)系的評(píng)估或者模擬。如果我們采用了一個(gè)適當(dāng)?shù)姆椒?，那么所?gòu)建的進(jìn)化樹就會(huì)接近真實(shí)的“進(jìn)化樹”。模擬的進(jìn)化樹需要一種數(shù)學(xué)方法來對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。不同的算法有不同的適用目標(biāo)。一般來說，最大簡約性法適用于符合以下條件的多序列：=1\*romani所要比較的序列的堿基差別小，=2\*romanii對(duì)于序列上的每一個(gè)堿基有近似相等的變異率，=3\*romaniii沒有過多的顛換/轉(zhuǎn)換的傾向，=4\*romaniv所檢驗(yàn)的序列的堿基數(shù)目較多（大于幾千個(gè)堿基）；用最大可能性法分析序列則不需以上的諸多條件，但是此種方法計(jì)算極其耗時(shí)。如果分析的序列較多，有可能要花上幾天的時(shí)間才能計(jì)算完畢。UPGMAM（Unweightedpairgroupmethodwitharithmeticmean）假設(shè)在進(jìn)化過程中所有核苷酸/氨基酸都有相同的變異率，也就是存在著一個(gè)分子鐘。這種算法得到的進(jìn)化樹相對(duì)來說不是很準(zhǔn)確，現(xiàn)在已經(jīng)很少使用。鄰位相連法是一個(gè)經(jīng)常被使用的算法，它構(gòu)建的進(jìn)化樹相對(duì)準(zhǔn)確，而且計(jì)算快捷。其缺點(diǎn)是序列上的所有位點(diǎn)都被同等對(duì)待，而且，所分析的序列的進(jìn)化距離不能太大。另外，需要特別指出的是對(duì)于一些特定多序列對(duì)象來說可能沒有任何一個(gè)現(xiàn)存算法非常適合它。CLUSTALX和PHYLIP軟件能夠?qū)崿F(xiàn)上述的建樹步驟。CLUSTALX是Windows界面下的多重序列比對(duì)軟件。PHYLIP是多個(gè)軟件的壓縮包，功能極其強(qiáng)大，主要包括五個(gè)方面的功能軟件：=1\*romani，DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)的分析軟件。=2\*romanii，序列數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變成距離數(shù)據(jù)后，對(duì)距離數(shù)據(jù)分析的軟件。=3\*romaniii，對(duì)基因頻率和連續(xù)的元素分析的軟件。=4\*romaniv，把序列的每個(gè)堿基/氨基酸獨(dú)立看待（堿基/氨基酸只有0和1的狀態(tài)）時(shí)，對(duì)序列進(jìn)行分析的軟件。=5\*romanv，按照DOLLO簡約性算法對(duì)序列進(jìn)行分析的軟件。=6\*romanvi，繪制和修改進(jìn)化樹的軟件?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】1、使用CLUSTALX軟件對(duì)已知八條DNA序列（如下）進(jìn)行多重序列比對(duì)；M._mulattaAAGCTTTTCTGGCGCAACCATCCTCATGATTGCTCACGGACTCACCTCTTM._fascicuAAGCTTCTCCGGCGCAACCACCCTTATAATCGCCCACGGGCTCACCTCTTM._sylvanuAAGCTTCTCCGGTGCAACTATCCTTATAGTTGCCCATGGACTCACCTCTTHomo_sapieAAGCTTCACCGGCGCAGTCATTCTCATAATCGCCCACGGGCTTACATCCTGorillaAAGCTTCACCGGCGCAGTTGTTCTTATAATTGCCCACGGACTTACATCATPongoAAGCTTCACCGGCGCAACCACCCTCATGATTGCCCATGGACTCACATCCTSaimiri_scAAGCTTCACCGGCGCAATGATCCTAATAATCGCTCACGGGTTTACTTCGTLemur_cattAAGCTTCATAGGAGCAACCATTCTAATAATCGCACATGGCCTTACATCAT2、使用PHYLIP軟件包構(gòu)建上述DNA分子系統(tǒng)發(fā)生樹。【實(shí)驗(yàn)方法】一、用CLUSTALX軟件對(duì)已知DNA序列做多序列比對(duì)。操作步驟：1、以FASTA格式準(zhǔn)備8個(gè)DNA序列test.seq（或txt）文件。2、雙擊進(jìn)入CLUSTALX程序，點(diǎn)FILE進(jìn)入LOADSEQUENCE，打開test.seq（或txt）文件。3、點(diǎn)ALIGNMENT，在默認(rèn)alignmentparameters下，點(diǎn)擊DocompleteAlignment。在新出現(xiàn)的窗口中點(diǎn)擊ALIGN進(jìn)行比對(duì)，這時(shí)輸出兩個(gè)文件（默認(rèn)輸出文件格式為Clustal格式）：比對(duì)文件test.aln和向?qū)湮募est.dnd。4、點(diǎn)FILE進(jìn)入Savesequenceas,在format框中選PHYLIP，文件在PHYLIP軟件目錄下以test.phy存在，點(diǎn)擊OK。5、將PHYLIP軟件目錄下的test.phy文件拷貝到EXE文件夾中。用計(jì)事本方式打開的test.phy文件的部分序列如下：二、用PHYLIP軟件推導(dǎo)進(jìn)化樹。1、進(jìn)入EXE文件夾，點(diǎn)擊SEQBOOT軟件輸入test.phy文件名，回車。圖中的D、J、R、I、O、1、2代表可選擇的選項(xiàng)，鍵入這些字母，程序的條件就會(huì)發(fā)生改變。D選項(xiàng)無須改變。J選項(xiàng)有三種條件可以選擇，分別是Bootstrap、Jackknife和Permute。文章上面提到用Bootstraping法對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行評(píng)估，所謂Bootstraping法就是從整個(gè)序列的堿基（氨基酸）中任意選取一半，剩下的一半序列隨機(jī)補(bǔ)齊組成一個(gè)新的序列。這樣，一個(gè)序列就可以變成了許多序列。一個(gè)多序列組也就可以變成許多個(gè)多序列組。根據(jù)某種算法（最大簡約性法、最大可能性法、除權(quán)配對(duì)法或鄰位相連法）每個(gè)多序列組都可以生成一個(gè)進(jìn)化樹。將生成的許多進(jìn)化樹進(jìn)行比較，按照多數(shù)規(guī)則（majority-rule）我們就會(huì)得到一個(gè)最“逼真”的進(jìn)化樹。Jackknife則是另外一種隨機(jī)選取序列的方法。它與Bootstrap法的區(qū)別是不將剩下的一半序列補(bǔ)齊，只生成一個(gè)縮短了一半的新序列。Permute是另外一種取樣方法，其目的與Bootstrap和Jackknife法不同，這里不再介紹。R選項(xiàng)讓使用者輸入republicate的數(shù)目。所謂republicate就是用Bootstrap法生成的一個(gè)多序列組。根據(jù)多序列中所含的序列的數(shù)目的不同可以選取不同的republicate，此處選200，輸入Y確認(rèn)參數(shù)并在Randomnumberseed(mustbeodd)

的下面輸入一個(gè)奇數(shù)（比如3）。當(dāng)我們?cè)O(shè)置好條件后按回車，程序開始運(yùn)行，并在EXE文件夾中產(chǎn)生一個(gè)文件outfile。文件outfile改為infile。點(diǎn)擊DNADIST程序。選項(xiàng)M是輸入剛才設(shè)置的republicate的數(shù)目，輸入D選擇datasets，輸入200。設(shè)置好條件后，輸入Y確認(rèn)參數(shù)。程序開始運(yùn)行，并在EXE文件夾中產(chǎn)生outfile，將outfile文件名改為infile，為避免與原先infile文件重復(fù)，將原先文件名改為infile1。3、EXE文件夾中選擇通過距離矩陣推測進(jìn)化樹的算法，點(diǎn)擊NEIGHBOR程序。輸入M更改參數(shù)，輸入D選擇datasets。輸入200。輸入奇數(shù)種子3。輸Y確認(rèn)參數(shù)。程序開始運(yùn)行，并在EXE文件夾中產(chǎn)生outfile和outtree兩個(gè)結(jié)果輸出。outtree文件是一個(gè)樹文件，可以用treeview等軟件打開。outfile是一個(gè)分析結(jié)果的輸出報(bào)告，包括了樹和其他一些分析報(bào)告，可以用記事本直接打開。部分內(nèi)容如下：4、將outtree文件名改為intree，點(diǎn)擊DRAWTREE程序，輸入font1文件名，作為參數(shù)。輸Y確認(rèn)參數(shù)。程序開始運(yùn)行，并出現(xiàn)TreePreview圖。5、點(diǎn)擊DRAWGRAM程序，輸入font1文件名，作為參數(shù)。輸Y確認(rèn)參數(shù)。程序開始運(yùn)行，并出現(xiàn)TreePreview圖。6、將EXE文件夾中的outfile文件名改為outfile1，以避免被新生成的outfile文件覆蓋。點(diǎn)擊CONSENSE程序。輸入Y確認(rèn)設(shè)置。EXE文件夾中新生成outfile和outtree。Outfile文件用記事本打開， 7

、將EXE文件夾中的intree文件名改為intree1，將outtree改intree。點(diǎn)擊DRAWTREE程序，輸入font1文件名，作為參數(shù)。輸Y確認(rèn)參數(shù)。程序開始運(yùn)行，并出現(xiàn)TreePreview圖。8、點(diǎn)擊DRAWGRAM程序，輸入font1文件名，作為參數(shù)。輸Y確認(rèn)參數(shù)。程序開始運(yùn)行，并出現(xiàn)TreePreview圖?！咀鳂I(yè)】1、提交使用CLUSTALX及PHYLIP軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果；2、總結(jié)多重序列比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的關(guān)鍵事項(xiàng)。

實(shí)驗(yàn)五PCR引物設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、掌握引物設(shè)計(jì)的基本要求，并熟悉使用Primerpremier5.0軟件進(jìn)行引物搜索。2、掌握使用軟件oligo6.0對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。【實(shí)驗(yàn)原理】一、引物設(shè)計(jì)原則聚合梅鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）即PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱基因的體外擴(kuò)增法。PCR技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究中使用最多，最廣泛的手段之一，而引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)，使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗：表現(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等?，F(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行，可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件。引物設(shè)計(jì)原則如下：1、引物應(yīng)在序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)并具有特異性。引物序列應(yīng)位于基因組DNA的高度保守區(qū)，且與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。這樣可以減少引物與基因組的非特異結(jié)合，提高反應(yīng)的特異性；2、引物的長度一般為15-30bp。常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)；3、引物不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高(超過4.5kcal/mol)易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行；4、引物序列的GC含量一般為40-60%。過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大；5、引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)；6、引物5'端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。可根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。7、引物3’端不可修飾。引物3'端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3'端使用堿基A8、引物序列自身或者引物之間不能在出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加；9、G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3'端G值較低（絕對(duì)值不超過9），而5’端和中間G值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的G值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)；值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低，在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。二、引物設(shè)計(jì)軟件Primerpremier5.0及oligo6.0“Premier”的主要功能分四大塊，其中有三種功能比較常用，即引物設(shè)計(jì)、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析和DNA基元(motif)查找?！癙remier”還具有同源性分析功能，但并非其特長，在此略過。此外，該軟件還有一些特殊功能，其中最重要的是設(shè)計(jì)簡并引物，另外還有序列“朗讀”、DNA與蛋白序列的互換、語音提示鍵盤輸入等等。有時(shí)需要根據(jù)一段氨基酸序列反推到DNA來設(shè)計(jì)引物，由于大多數(shù)氨基酸（20種常見結(jié)構(gòu)氨基酸中的18種）的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推DNA序列時(shí)，會(huì)遇到部分堿基的不確定性。這樣設(shè)計(jì)并合成的引物實(shí)際上是多個(gè)序列的混和物，它們的序列組成大部分相同，但在某些位點(diǎn)有所變化，稱之為簡并引物。遺傳密碼規(guī)則因物種或細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的不同而異，比如在線粒體內(nèi)的遺傳密碼與細(xì)胞核是不一樣的?！癙remier”可以針對(duì)模板DNA的來源以相應(yīng)的遺傳密碼規(guī)則轉(zhuǎn)換DNA和氨基酸序列。軟件共給出八種生物亞結(jié)構(gòu)的不同遺傳密碼規(guī)則供用戶選擇，有纖毛蟲大核（CiliateMacronuclear）、無脊椎動(dòng)物線粒體（InvertebrateMitochondrion）、支原體（Mycoplasma）、植物線粒體（PlantMitochondrion）、原生動(dòng)物線粒體（ProtozoanMitochondrion）、一般標(biāo)準(zhǔn)（Standard）、脊椎動(dòng)物線粒體（VertebrateMito-chondrion）和酵母線粒體（YeastMitochondrion）。對(duì)引物進(jìn)行分析評(píng)價(jià)的的軟件中，“oligo”是最著名的。它的使用并不十分復(fù)雜，Oligo6.0的界面是三個(gè)圖，Tm圖、ΔG圖和Frq圖。“Oligo”的功能比“Premier”還要單一，就是引物設(shè)計(jì)。但它的引物分析功能如此強(qiáng)大以至于能風(fēng)靡全世界。所以引物設(shè)計(jì)的最佳搭配是“Premier”進(jìn)行引物搜索“Oligo”對(duì)引物分析評(píng)價(jià)?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】1、使用Primerpremier5.0軟件進(jìn)行人瘦素(leptin)mRNA引物的設(shè)計(jì)。2、使用oligo6.0對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。

【實(shí)驗(yàn)方法】一、引物搜索1、打開Primerpremier5.0軟件，調(diào)入人瘦素(leptin)基因序列：點(diǎn)擊“file”“open”“DNAsequence”；或者直接點(diǎn)擊“file”“new”“DNAsequence”，彈出一對(duì)話框如下圖，然后將序列人瘦素(leptin)基因復(fù)制在空白框。2、序列文件顯示如圖，點(diǎn)擊“Primer”；3、進(jìn)一步點(diǎn)擊“search”按鈕，出現(xiàn)“searchcriteria”窗口，有多種參數(shù)可以調(diào)整。搜索目的（SeachFor）有三種選項(xiàng)，PCR引物（PCRPrimers），測序引物（SequencingPrimers），雜交探針（HybridizationProbes）。搜索類型(SearchType)可選擇分別或同時(shí)查找上、下游引物（Sense/Anti-sensePrimer，或Both），或者成對(duì)查找（Pairs），或者分別以適合上、下游引物為主（CompatiblewithSense/Anti-sensePrimer）。另外還可改變選擇區(qū)域（SearchRanges），引物長度（PrimerLength），選擇方式（SearchMode），參數(shù)選擇（SearchParameters）等等。使用者可根據(jù)自己的需要設(shè)定各項(xiàng)參數(shù)。我們將ProductSize設(shè)置300－350，其他參數(shù)使用默認(rèn)值。然后點(diǎn)擊“OK”，隨之出現(xiàn)的SearchProgress窗口中顯示SearchCompleted時(shí)，再點(diǎn)擊“OK”。4、這時(shí)搜索結(jié)果以表格的形式出現(xiàn)，有三種顯示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成對(duì)顯示(Pairs)。默認(rèn)顯示為成對(duì)方式，并按優(yōu)劣次序（Rating）排列，滿分為100，即各指標(biāo)基本都能達(dá)標(biāo)（如下圖）。5、按照搜尋結(jié)果顯示，在主窗口中檢查該引物對(duì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)情況，逐條分析，依次篩選。下面進(jìn)行序列篩選：點(diǎn)擊其中一對(duì)引物，如第21#引物，在“PeimerPremier”主窗口，如圖所示：該圖分三部分，最上面是圖示PCR模板及產(chǎn)物位置，中間是所選的上下游引物的一些性質(zhì)，最下面是四種重要指標(biāo)的分析，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin），二聚體（Dimer），錯(cuò)誤引發(fā)情況（FalsePriming），及上下游引物之間二聚體形成情況（CrossDimer）。當(dāng)所分析的引物有這四種結(jié)構(gòu)的形成可能時(shí)，按鈕由“None”變成“Found”，點(diǎn)擊該按鈕，在左下角的窗口中就會(huì)出現(xiàn)該結(jié)構(gòu)的形成情況。一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有“Found”，只有“None”。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的最佳退火溫度，可參考應(yīng)用。二、引物分析1、打開oligo的頁面如下：2、單擊file菜單再點(diǎn)open或點(diǎn)擊“打開”快捷圖標(biāo)或者用快捷鍵“CTrl＋O”可彈出一對(duì)話框，然后選擇序列人瘦素(leptin)基因。出現(xiàn)以下窗口。3、點(diǎn)擊“window”再點(diǎn)擊“Tile”，出現(xiàn)以下窗口，圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)分別為Tm、ΔG和Frq，因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，起動(dòng)窗口的cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為tile方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個(gè)指標(biāo)。?G值反映了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度，最好引物的?G值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對(duì)低（如圖：）Tm值曲線以選取72℃附近為佳，5’到3’的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq曲線為“Oligo6”新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo)，揭示了序列片段存在的重復(fù)機(jī)率大小。選取引物時(shí)，宜選用3’端Frq值相對(duì)較低的片段。4、在設(shè)計(jì)時(shí)，可依據(jù)圖上三種指標(biāo)的信息選取序列，如果覺得合適，可點(diǎn)擊Tm圖塊上左下角的Upper按鈕，選好上游引物，此時(shí)該按鈕變成紅色，表示上游引物已選取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成Lower。5、當(dāng)上下游引物全選好以后，需要對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)?？梢杂谩癆nalyse”菜單分析你的引物：比如有無引物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等等。首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（crossdimer）。二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測（非克隆）性PCR，對(duì)引物位置、產(chǎn)物大小要求較低，因而應(yīng)盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。一般來說，這兩項(xiàng)結(jié)構(gòu)的能值以不超過4.5為好。當(dāng)然，在設(shè)計(jì)克隆目的的PCR引物時(shí)，引物兩端一般都添加酶切位點(diǎn)，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且能值不會(huì)太低。這種PCR需要通過靈活調(diào)控退火溫度以達(dá)到最好效果，對(duì)引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測就不應(yīng)要求太高。第三項(xiàng)檢查為GC含量，以45-55％為宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不能被控制在上述范圍內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火溫度的選擇。當(dāng)我們結(jié)束以上三項(xiàng)檢測，按Alt+P鍵彈出PCR窗口，其中總結(jié)性地顯示該引物的位置、產(chǎn)物大小、Tm值等參數(shù)，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡單的評(píng)價(jià)?！咀鳂I(yè)】1、提交使用Primerpremier5.0及oligo6.0軟件進(jìn)行人瘦素(leptin)mRNA引物的設(shè)計(jì)結(jié)果；2、總結(jié)引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意的關(guān)鍵事項(xiàng)。

實(shí)驗(yàn)六蛋白質(zhì)序列分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、掌握蛋白質(zhì)序列檢索的操作方法；2、熟悉蛋白質(zhì)基本性質(zhì)分析；3、熟悉基于序列同源性分析的蛋白質(zhì)功能預(yù)測，了解基于motif、結(jié)構(gòu)位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)功能域數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)功能預(yù)測；4、了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】1、使用Entrez或SRS信息查詢系統(tǒng)檢索人脂聯(lián)素(adiponectin)蛋白質(zhì)序列；2、使用BioEdit軟件對(duì)上述蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分子質(zhì)量、氨基酸組成、和疏水性等基本性質(zhì)分析；3、對(duì)人脂聯(lián)素蛋白質(zhì)序列進(jìn)行基于NCBI/Blast軟件的蛋白質(zhì)同源性分析；4、對(duì)人脂聯(lián)素蛋白質(zhì)序列進(jìn)行motif結(jié)構(gòu)分析；5、對(duì)人脂聯(lián)素蛋白質(zhì)序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測?！緦?shí)驗(yàn)方法】1、人脂聯(lián)素蛋白質(zhì)序列的檢索：（1）調(diào)用Internet瀏覽器并在其地址欄輸入Entrez網(wǎng)址(/Entrez)；（2）在Search后的選擇欄中選擇protein；（3）在輸入欄輸入homosapiensadiponectin；（4）點(diǎn)擊go后顯示序列接受號(hào)及序列名稱；（5）點(diǎn)擊序列接受號(hào)NP_004788(adiponectinprecursor;adiposemostabundantgenetranscript1[Homosapiens])后顯示序列詳細(xì)信息；（6）將序列轉(zhuǎn)為FASTA格式保存(參考上述步驟使用SRS信息查詢系統(tǒng)檢索人脂聯(lián)素蛋白質(zhì)序列)；2、使用BioEdit軟件對(duì)人脂聯(lián)素蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分子質(zhì)量、氨基酸組成和疏水性等基本性質(zhì)分析：打開BioEdit軟件→將人脂聯(lián)素蛋白質(zhì)序列的FASTA格式序列輸入分析框→點(diǎn)擊左側(cè)序列說明框中的序列說明→點(diǎn)擊sequence欄→選擇protein→點(diǎn)擊AminoAcidComposition→查看該蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和氨基酸組成；或者選擇protein后，點(diǎn)擊Kyte&DoolittleMeanHydrophobicityProfile→查看該蛋白質(zhì)分子疏水性水平；3、人脂聯(lián)素蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)同源性分析：（1）進(jìn)入NCBI/Blast網(wǎng)頁；（2）選擇HYPERLINK"/blast/Blast.cgi?CMD=Web&LAYOUT=TwoWindows&AUTO_FORMAT=Semiauto&ALI