植物細(xì)胞工程

9/9植物細(xì)胞工程HUAZHONGAGRICULTURAL

UNIVERSITY

煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生的研究ResearchonCallusInductionandPlant

RegenerationofTobaccoLeaves

姓名:黃金波

CANDIDATE：Huang-JinBo

學(xué)號(hào):2012304200510

STUDENTID：2012304200510

課程:植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)CURRICULUM：PlantCellEngineeringExperiment

班級(jí):MAJOR:生技1201班Biotechnology1201

指導(dǎo)老師：SUPERVISOR：柳俊齊迎春陳浩

Liu-JunQi-YingChunChen-Hao

中國(guó)武漢

WUHAN，

CHINA

二○一四年十二月DEC,2014

煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生的研究

黃金波

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生技1201班

[

darkcondition;Buddifferentiationstatushavecertaindifferenceindarkandlightconditions,differentiationofplantseedlingsininducedtherewasnosignificantdifferencebetweenlightanddarkconditions.[Conclusion]theilluminationconditionandundertheconditionofdarkinductioncanaffectthebuddifferentiationofcallusbudnumberandstatus.

[KeyWords]TobaccoLeaves；Callus；CellEngineeringDifferentiation；Induce；

PlantRegeneration

1.前言

細(xì)胞工程是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科的原理和方法，通過(guò)某種工程學(xué)的手段，在細(xì)胞水平或細(xì)胞器水平上，按照人們的意愿對(duì)細(xì)胞進(jìn)行改造，從而得到目的產(chǎn)物的一門(mén)綜合科學(xué)技術(shù)（柳俊等，2011）。近年來(lái)，由于包括遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生理學(xué)、工程學(xué)、生物物理學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展和融合，細(xì)胞工程再綜合了各大學(xué)科的優(yōu)勢(shì)以及利用自身的特點(diǎn)后，也得到了極大的發(fā)展。

細(xì)胞工程技術(shù)根據(jù)對(duì)象分類(lèi)，可以將其分為植物細(xì)胞工程、動(dòng)物細(xì)胞工程和微生物細(xì)胞工程。它們之間的原理和方法都是相通的，但是又有微小的區(qū)別。植物細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展源頭可以追溯到上世紀(jì)初，發(fā)展到現(xiàn)在，其實(shí)它的應(yīng)用已經(jīng)非常的廣泛。目前來(lái)說(shuō)，它已被廣泛用于醫(yī)學(xué)、能源、制藥、農(nóng)業(yè)育種、食品等方面的科學(xué)研究和生產(chǎn)應(yīng)用。下面就主要對(duì)動(dòng)物細(xì)胞工程和植物細(xì)胞工程技術(shù)在生產(chǎn)生活中的一些應(yīng)用做一些簡(jiǎn)單的介紹。

1.1動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)及其應(yīng)用

動(dòng)物細(xì)胞工程主要是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的研究手段和原理，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、細(xì)胞核移植、胚胎移植、基因轉(zhuǎn)移等技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的一門(mén)生物技術(shù)（葉敏，1984）。目前在細(xì)胞工程制藥、細(xì)胞治療、干細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞核移植等方面有著非常廣泛的應(yīng)用（李剛等，2002；唐紅等，2011；馬瑞麗，2007；）。下面就以下幾個(gè)方面對(duì)動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的一些應(yīng)用做一些簡(jiǎn)單的介紹。1.1.1生產(chǎn)單克隆抗體和細(xì)胞因子

自1975年英國(guó)劍橋大學(xué)的科學(xué)家利用

動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)首次獲得單克隆抗體以來(lái)，現(xiàn)在針對(duì)各種抗原的單克隆抗體已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，而細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展對(duì)于單克隆抗體的生產(chǎn)無(wú)疑是

提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。用單克隆抗體可以檢測(cè)出多種病毒中非常細(xì)微的株間差異，尤其在鑒別菌種型及亞型、病毒的變異株以及寄生蟲(chóng)不同生活周期的抗原性等方面更具

獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。這些都是傳統(tǒng)血清法或動(dòng)物免疫法所做不到的，而且利用細(xì)胞工程技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，所以診斷非常準(zhǔn)確，誤診率與傳統(tǒng)血

清學(xué)手段相比大大降低（唐紅，2011）。

不僅如此，近年來(lái)的發(fā)展也將細(xì)胞工程帶入了腫瘤診斷的領(lǐng)域，利用生產(chǎn)的特異性單克隆抗體為腫瘤的檢測(cè)和治療提供了新

的思路和方法。比如就有這樣的報(bào)道，有科學(xué)家利用單克隆抗體耦聯(lián)放射性核素，在腫瘤局部產(chǎn)生足夠的電離輻射生物學(xué)效應(yīng)，這在治療卵巢癌的實(shí)驗(yàn)與臨床研究已取得較

大進(jìn)展，給卵巢癌特別是術(shù)后復(fù)發(fā)及化療耐藥患者的治療帶來(lái)新的希望（吳嘉涵，2009）。

1.1.2細(xì)胞融合技術(shù)

細(xì)胞融合指在誘導(dǎo)劑或促融劑作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上的異源細(xì)胞或原生質(zhì)體相

互接觸，進(jìn)而發(fā)融合并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象。細(xì)胞融合技術(shù)作為細(xì)胞工程的核心基礎(chǔ)技

術(shù)之一，不僅在農(nóng)業(yè)、工業(yè)的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，而且在醫(yī)藥領(lǐng)域也取得了開(kāi)創(chuàng)性的研究成果。這其中其實(shí)也主要包括有單克隆技

術(shù)（馬瑞麗，2007）。但是，不僅是單克隆技術(shù)，細(xì)胞核移植技術(shù)也得到了很好的發(fā)展。自從1997年克隆羊多利誕生以來(lái)，相繼在很多國(guó)家都報(bào)道出來(lái)已經(jīng)克隆出各種動(dòng)物，比如說(shuō)我國(guó)的克隆牛、克隆豬、克隆鼠等。

克隆動(dòng)物的技術(shù)最大的發(fā)展前景莫過(guò)

于將它與轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器結(jié)合起來(lái)，發(fā)展為類(lèi)似于動(dòng)物工廠(chǎng)的優(yōu)勢(shì)雜種細(xì)胞用于生

產(chǎn)各種藥物。這其中比較成熟的比如有利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺作為生物反應(yīng)器,生產(chǎn)基因

工程人類(lèi)蛋白質(zhì)藥物，它可以使成本較微生物發(fā)酵、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)基因工程藥物大大降低（李剛等，2002）。

1.2植物細(xì)胞工程技術(shù)及其應(yīng)用

植物細(xì)胞工程是以細(xì)胞的全能性和體

細(xì)胞分裂的均等性作為理論依據(jù)，在細(xì)胞水平上對(duì)植物進(jìn)行操作的育種新技術(shù)。植物細(xì)胞工程包括染色體工程技術(shù)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)與無(wú)性系篩選、組織培養(yǎng)與體系胞雜交、器官與胚胎培養(yǎng)、植物脫毒快速繁殖與人工種子生產(chǎn)技術(shù)等（李培夫等，2006）。

植物細(xì)胞工程技術(shù)目前應(yīng)用十分廣泛，其中在作物育種方面的應(yīng)用報(bào)道的最多。下面做些簡(jiǎn)單的介紹。

1.2.1在植物作物育種中的應(yīng)用

我們知道，傳統(tǒng)的雜交育種在自交5代

以后可以產(chǎn)生一些同質(zhì)配子結(jié)合的純合植株，需要經(jīng)6-8代才可選育出新品系。對(duì)于

一年一季的植物，這之間需要花費(fèi)最少5-8

年的時(shí)間，甚至更久。而單倍體育種是通過(guò)單倍體培養(yǎng)迅速獲得純合二倍體，從而大大縮短了育種年限，有些單倍體育種只需要兩年左右的時(shí)間就可以得到純種，為育種提供了極大的方便，而且選出的品種純種率高（柳成蔭，2011；李培夫等，2006）。

目前我國(guó)在植物育種中的應(yīng)用在很多

方面都有建樹(shù)。比如說(shuō)在水稻育種、菊花育種、茶樹(shù)育種、棗樹(shù)育種等等都有比較深入的研究（王婷婷，2009；白瑞霞,2007;鄺琦,2010;邱濤濤,2010）。

1.2.2在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，目前，根據(jù)人們的需要已經(jīng)相繼完善和發(fā)展了一些具有特色的

植物細(xì)胞工程實(shí)用技術(shù)，包括植物細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)、無(wú)性快繁技術(shù)及單倍體育種技術(shù)等，這些技術(shù)在脫毒苗生產(chǎn)、經(jīng)濟(jì)植物快繁、植物新品種選育及有用次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)

方面發(fā)揮了重要作用。

植物細(xì)胞工程在脫毒苗生產(chǎn)方面的應(yīng)

用主要是想提高農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前主要采用的方法和手段是莖尖剝離的方法。這在我國(guó)都已經(jīng)得到了很大的推廣。我國(guó)相繼在黑龍江、內(nèi)蒙古、湖南、湖北、河南和甘肅等地建立了生產(chǎn)脫毒種薯的原種場(chǎng)，目前，草莓、蘋(píng)果、柑橘和葡萄等經(jīng)濟(jì)植物都已建立了脫毒苗生產(chǎn)技術(shù)（柳成蔭，2011）。在其他方面，植物細(xì)胞工程在經(jīng)濟(jì)植物快繁方面的應(yīng)用的技術(shù)也十分成熟。例如利用植物快繁技術(shù)可以使生根困難的名貴花卉大

量繁殖，還可應(yīng)用于雜合植物材料的快速繁殖，因?yàn)楹芏鄡?yōu)良的觀賞植物和經(jīng)濟(jì)植物都是雜種，一旦有性繁殖，其后代性狀會(huì)發(fā)生分離。而通過(guò)無(wú)性繁殖則能夠保持其雜合性，并可以大量生產(chǎn)性狀均一的商品苗。目前已在木薯、馬鈴薯、咖啡、橡膠、菠蘿、甘蔗和蘋(píng)果等經(jīng)濟(jì)植物上建立了植物快繁技術(shù)（楊賀，2010）。

1.2.3培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物

植物細(xì)胞培養(yǎng)作為一種有效生產(chǎn)有重

要價(jià)值次生代謝物的技術(shù).與其他方法相比,應(yīng)用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝

產(chǎn)物具有以下優(yōu)點(diǎn):

(1)有利于研究植物的代謝途徑,還

可以利用某些基因工程手段探索與創(chuàng)造新

的合成路線(xiàn),得到價(jià)值更高的產(chǎn)品；

(2)所獲得產(chǎn)物可從培養(yǎng)體系內(nèi)直接

提取,快速、高效的回收與利用,簡(jiǎn)化了分

離與純化步驟；

(3)節(jié)省大量用于種植原料的土地,

以便土地資源得到高效利用；

(4)能夠減少各種環(huán)境因素對(duì)產(chǎn)物的

影響,確保在一個(gè)限定的生產(chǎn)系統(tǒng)中連續(xù)、均勻生產(chǎn)；

(5)有利于細(xì)胞篩選、生物轉(zhuǎn)化，合成新的有效成分；

(6)可以在生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng),并通過(guò)控制環(huán)境條件提高代謝物產(chǎn)量。

目前植物細(xì)胞工程技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)次

生代謝的產(chǎn)物有植物生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的一

些酚類(lèi)、萜類(lèi)、含氮化合物（羅凱，2007；谷榮輝等，2013）。這其中很多對(duì)于我們有著非常重要的商業(yè)價(jià)值和藥用價(jià)值。例如，一些重要的植物代謝產(chǎn)物具有抗癌防癌的

藥用功效；我國(guó)通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)的次生代謝物主要有小檗堿、紫杉醇等,具有很好的抗癌、抑菌消炎活性(張玲華，2006)。除了藥用外,許多次生代謝產(chǎn)物還是食品、化工和農(nóng)業(yè)化學(xué)的重要原料,如用作殺蟲(chóng)劑、染料、調(diào)味品和香料等。

總之,次生代謝物不僅是植物生命活

動(dòng)不可或缺的物質(zhì),而且對(duì)人類(lèi)社會(huì)的生

存發(fā)展也起著重要的作用。

1.3本次實(shí)驗(yàn)的目的及意義

1.3.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

通過(guò)實(shí)驗(yàn)課程，掌握細(xì)胞工程的核心技術(shù)無(wú)菌操作技術(shù)和植物個(gè)體再生技術(shù)；通過(guò)實(shí)驗(yàn)課程和理論課程的學(xué)習(xí)，了解特殊器官離體發(fā)生調(diào)控技術(shù)；最后，通過(guò)整個(gè)過(guò)程，能夠初步掌握本領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果分析及其報(bào)告/論文的撰寫(xiě)。

1.3.2實(shí)驗(yàn)意義

隨著各個(gè)學(xué)科之間的深入融合和快速發(fā)展，細(xì)胞工程技術(shù)也得到了極大的發(fā)展，盡管動(dòng)物細(xì)胞工程與植物細(xì)胞工程在技術(shù)和原理上都存在一定的差異，但其核心技術(shù)和原理是相通的，都是利用無(wú)菌操作技術(shù)和細(xì)胞的全能性等。所以通過(guò)植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)課程，可以讓我們對(duì)于細(xì)胞工程技術(shù)有較為深入的了解和掌握，可以使我們學(xué)習(xí)到相關(guān)關(guān)鍵的操作技術(shù)。同時(shí)，在整個(gè)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們還學(xué)習(xí)到了一些其他的技術(shù)，比如制作試管花卉、人工種子等，轉(zhuǎn)基因水稻gus報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)和檢測(cè)等等這些實(shí)驗(yàn)，使我們對(duì)其中一些的實(shí)驗(yàn)非常感興趣?？傊?，本次實(shí)驗(yàn)既讓我們學(xué)習(xí)到了相關(guān)的技術(shù)和原理，還激起了我們對(duì)其中的一些實(shí)驗(yàn)極大興趣。

2.實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1材料：無(wú)菌煙草苗

2.1.2培養(yǎng)基

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+0.25mg/LNAA+0.25mg/LBA+8g/L瓊脂

分化培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+0.25mg/LNAA+1.0mg/LBA+8g/L瓊脂

2.1.3其他器材與試劑

器材：天平、電磁爐、燒杯、移液管、三角瓶、滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫（25℃）培養(yǎng)室等

試劑：蔗糖、瓊脂、MS培養(yǎng)基母液等

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1無(wú)菌苗的培養(yǎng)（老師準(zhǔn)備）

2.2.2培養(yǎng)基的配置

按配方加入各培養(yǎng)基成份。

i.取一大的容量瓶，配制1000ml培養(yǎng)基母液備用。1000ml容量瓶中順序加入已配好的培養(yǎng)基母液（齊迎春等，2014）：大量元素25ml，微量元素5ml，鐵鹽5ml，維生素5ml，肌醇5ml，甘氨酸5ml；其中，誘導(dǎo)培

養(yǎng)基中再加入0.25mg/LNAA、0.25mg/LBA；分化培養(yǎng)基中加入0.25mg/LNAA、1.0mg/LBA。

ii．加好后，加水至總體積的3/4左右，加入20g蔗糖攪拌使溶化，用0.5N的NaOH和0.5N的HCl調(diào)整pH至5.8-6.0。

iii.加入8g瓊脂，置于電磁路爐上加熱，攪拌使瓊脂完全溶化，再用蒸餾水定容至終體積1000ml；繼續(xù)加熱幾分鐘使充分混均，分裝于三角瓶中，每瓶20ml左右；用記號(hào)筆表明培養(yǎng)基類(lèi)型。

iv.滅菌（老師準(zhǔn)備）。將分裝好的培養(yǎng)基置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌條件：溫度121℃，壓力1.1kg/cm2，時(shí)間20min。滅菌后的培養(yǎng)基置于無(wú)菌室保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)

將煙草葉片用剪刀剪成1cm2大小的小立方塊，接種于已滅菌含誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶中。每個(gè)三角瓶接種4-6片，注意不要太多；另外，在選取葉片時(shí)盡量不要選取葉片的頂芽和芽尖，因?yàn)轫斞亢脱考獾纳L(zhǎng)素濃度較高，不利于葉片的誘導(dǎo)；并且，將小葉片的四邊都剪一下，以使葉片充分接觸培養(yǎng)基。全程都在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，嚴(yán)格控制無(wú)菌操作。

每人接種六個(gè)三角瓶，三個(gè)放于光照條件（實(shí)際為每天十二小時(shí)光照）下培養(yǎng)，另外三個(gè)置于黑暗條件（全天黑暗）下培養(yǎng)。培養(yǎng)三周。

2.2.4器官的分化培養(yǎng)

在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)三周后，取出，將污染的材料廢棄，將沒(méi)有污染的材料接種到含分化培養(yǎng)基的三角瓶中，原則上是將原來(lái)一個(gè)三角瓶中材料轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)的一個(gè)含分化培養(yǎng)基的三角瓶中。因?yàn)楣庹諚l件下和黑暗條件下各有兩瓶被污染了，而剩下的材料每個(gè)三角瓶又長(zhǎng)得太多，所以將剩下的光照條件下的材料轉(zhuǎn)移到了兩個(gè)分化三角瓶中，將黑暗條件下的材料轉(zhuǎn)移到了三個(gè)分化三角瓶中。做好光照誘導(dǎo)和黑暗誘導(dǎo)的標(biāo)記，置于光照下培養(yǎng)兩個(gè)月左右，觀察結(jié)果。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3.1.1煙草葉片誘導(dǎo)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

煙草葉片誘導(dǎo)成愈傷組織統(tǒng)計(jì)表

Statisticforcallusinductionoftobaccoleaves

編號(hào)Number

接種數(shù)

Inoculation

number

愈傷組織形成數(shù)

Callusnumber

誘導(dǎo)率

Induction

rate

是否污染

Pollution

愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)

Growthstateofcallus

L16583.33%是被污染，沒(méi)形成愈傷組織

L255100.00%是被污染，但均形成愈傷組織，2個(gè)

長(zhǎng)根

L366100.00%否均長(zhǎng)根，形成愈傷組織

D15240.00%是被污染，有一個(gè)愈傷組織，且長(zhǎng)根D2500.00%是被污染，無(wú)愈傷組織形成

D355100.00%否2個(gè)長(zhǎng)根，4個(gè)形成愈傷，1個(gè)沒(méi)

長(zhǎng)

3.1.2煙草葉片分化結(jié)果統(tǒng)計(jì)

煙草葉片愈傷組織植株再生情況統(tǒng)計(jì)表

Statisticforcallusdifferentiationandregenerationoftobaccoleaves

編號(hào)Number愈傷組

織來(lái)源

Source

of

callus

分化率

Differentiation

rate

愈傷分

化芽數(shù)

Number

of

sprout

分化芽狀態(tài)

Stateofsprout

愈傷植

株數(shù)

Number

of

callus

plant

株苗狀

態(tài)

State

of

plant

污染率

Pollution

是否有

芽

Is

there

大小

Size

密集程度

Density

L1-1光照100%23有+++++++++1+0L1-2光照100%18有+++++++++3+0L1-3光照100%27有++++2+0L1-4光照100%34有+++++++++0o0L2-1光照100%78有++++++8+++0L2-2光照100%26有+++++3++++0D1-1黑暗100%13有++2++++0D1-2黑暗100%12有+++++3++++0D1-3黑暗100%16有+++++3++0D2-1黑暗100%12有+++++3++++0D2-2黑暗100%25有++++++2++0D2-3黑暗100%11有+++++1+++++0D3-1黑暗100%7有+++++1++0D3-2黑暗100%16有+++++7++++0D3-3黑暗100%9有++++2++0D3-4黑暗100%12有++++++++0o0說(shuō)明：i.L表示光照條件下誘導(dǎo)，D表示在黑暗條件下誘導(dǎo)。

ii.對(duì)于分化芽狀態(tài)，在大小一欄，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”分別表示小、較小、適中、較大、

大；在是否密集一欄，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”分別表示稀疏、較稀疏、適中、較密集、密

集。對(duì)于株苗狀態(tài)，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”分別表示短小、較短小、適中、較大、大；o

表示無(wú)。

Note：i.Lmeansinducedundertheconditionoflight；Dmeansinducedundertheconditionofdark；

ii.Forthestateofsprout，inthesizecolumn，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”standforsmall、lesssmall、

moderate、lesslarge、large，respectively；inthedensitycolumn，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”stand

forsparsity、lesssparsity、moderate、lessdenseness、densenessrespectively。TotheStateofplant，“+”、“++”、

“+++”、“++++”、“+++++”standforsmall、lesssmall、moderate、lesslarge、large；omeansnoplant。

3.2結(jié)果分析

對(duì)煙草葉片愈傷組織分化再生進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以對(duì)比光照和黑暗條件下誘導(dǎo)對(duì)于植株再生的影響，整理出以下結(jié)果。

3.2.1對(duì)分化率的影響

由統(tǒng)計(jì)分析可知，不管是在光照條件還是在黑暗條件下誘導(dǎo)，最終分化率都達(dá)到了100%，所以光照條件和黑暗條件對(duì)于愈傷組織分化率沒(méi)有影響。

3.2.2對(duì)愈傷組織分化芽數(shù)的影響

由統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可知，在光照條件下誘導(dǎo)總計(jì)分化芽數(shù)為206顆，在黑暗條件下誘導(dǎo)分化芽數(shù)為133顆，平均每個(gè)愈傷組織分別誘導(dǎo)出的芽數(shù)為34.33顆和13.30顆，經(jīng)方差分析可得：

光照和黑暗對(duì)愈傷組織分化芽數(shù)的影響方差分析

差異源SSdfMSFP-valueFcrit行1140.7511140.757.6380.039666.607891列1817.4175363.48332.4340.1756445.050329誤差746.755149.35

總計(jì)3704.91711

根據(jù)方差分析可以得到P值小于0.05，所以在光照條件和在黑暗條件下誘導(dǎo)對(duì)愈傷組織分化芽數(shù)的影響達(dá)到了顯著差異，在光照條件下誘導(dǎo)比在黑暗條件下誘導(dǎo)更有利于愈傷組織長(zhǎng)芽。

3.2.3對(duì)分化芽狀態(tài)的影響

對(duì)于分化芽狀態(tài)，不管是在光照條件下還是在黑暗條件下誘導(dǎo)都不影響分化出芽，均能達(dá)到100%；對(duì)于分化芽的大小，同樣可以做方差分析，可以得到光照和黑暗條件下誘導(dǎo)對(duì)分化芽的大小沒(méi)有明顯區(qū)別；對(duì)分化芽的密集程度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在黑暗條件下分化芽趨向密集生長(zhǎng)，在光照條件下誘導(dǎo)相對(duì)長(zhǎng)得更稀疏。

3.2.4對(duì)形成植株的影響

由統(tǒng)計(jì)表進(jìn)行方差分析可以得到光照條件下誘導(dǎo)和黑暗條件下誘導(dǎo)對(duì)形成植株數(shù)以及對(duì)于株苗形成的狀態(tài)均沒(méi)有顯著的影響。

3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論

在誘導(dǎo)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果有66.7%的材料被污染了，分析其原因有一下幾點(diǎn)：①操作不規(guī)范，在操作過(guò)程中沒(méi)有嚴(yán)格地按照無(wú)菌