qPCR快速使用手冊(cè)

ip?5使用快速指南?如何用iQ?5運(yùn)行一次實(shí)驗(yàn)2.1.1綜述創(chuàng)建、選擇或修改一個(gè)反應(yīng)程序文件(Protocolfile)創(chuàng)建、選擇或修改一個(gè)反應(yīng)板設(shè)置文件(PlateSetupfile)。點(diǎn)擊“Run”鍵。以選定的反應(yīng)板設(shè)置文件和反應(yīng)程序文件進(jìn)行反應(yīng)2.1.2反應(yīng)程序文件(Protocolfile)設(shè)置指南用戶可以在Workshop模塊中，創(chuàng)建一個(gè)新的反應(yīng)程序文件，或是直接選擇或修改一個(gè)已有的反應(yīng)程序文件。2.1.2.1選擇一個(gè)已有的反應(yīng)程序文件點(diǎn)擊“Protocol"鍵，在彈出的瀏覽器中選定所要選擇的反應(yīng)程序文件的路徑。點(diǎn)擊所需的反應(yīng)程序文件的文件名，此時(shí)該文件的具體設(shè)置在“SelectedProtocol”窗口中顯示出來。注意：iQ?5軟件安裝后，里面會(huì)自帶一些我們?cè)O(shè)置好的反應(yīng)程序文件作為示例，用戶可以直接調(diào)用它們。2.1.2.2創(chuàng)建或修改一個(gè)反應(yīng)程序文件在“SelectedProtocol”窗口點(diǎn)擊“Edit”鍵即可對(duì)當(dāng)前的反應(yīng)程序文件進(jìn)行修改；在“SelectedProtocol”窗口點(diǎn)擊“CreateNew”鍵即可創(chuàng)建一個(gè)新的反應(yīng)程序文件。無論點(diǎn)擊“Edit”或“CreateNew”鍵，軟件都會(huì)自動(dòng)切入“ProtocolEdit”窗口。這個(gè)窗口下部有一顯示反應(yīng)內(nèi)容的表格，用戶可以在其中按自己的需求進(jìn)行修改。修改保溫時(shí)間和保溫溫度?！癉wellTime”列設(shè)置保溫時(shí)間，“Setpoint”列設(shè)置保溫溫度。如果用戶要設(shè)置一個(gè)10秒的保溫時(shí)間，那就要在相應(yīng)格中輸入0：10或者0.10。選擇熒光數(shù)據(jù)收集步驟“DataAcquisition”列用于設(shè)置熒光數(shù)據(jù)收集步驟。其中“Real-Time”選項(xiàng)用于熒光定量，“MeltCurve”用于熔點(diǎn)曲線分析。注意：如要進(jìn)行熒光PCR實(shí)驗(yàn)，必須保證程序中至少有一個(gè)熒光數(shù)據(jù)收集步驟。插入循環(huán)或步驟在表格中“Cycle”列有數(shù)字顯示的行，點(diǎn)擊該行“Insert”列的"+”，即可完成循環(huán)插入，系統(tǒng)默認(rèn)插入的循環(huán)在當(dāng)前循環(huán)之后。在表格中“Step”列有數(shù)字顯示的行，點(diǎn)擊該行“Insert”列的"+”，即可完成步驟插入，系統(tǒng)默認(rèn)插入的步驟在當(dāng)前步驟之后。刪除循環(huán)或步驟點(diǎn)擊某Cycle行“Delete”列的“X”，即可將該循環(huán)刪除。點(diǎn)擊某Step行“Delete”列的“X”，即可將該步驟刪除。文件保存點(diǎn)擊“SaveandExitProtocolEditing”鍵，在隨后出現(xiàn)的“Saveas”對(duì)話框中輸入程序文件的名稱，再點(diǎn)擊“Save”鍵即可完成保存。注意：點(diǎn)擊“SaveandExitProtocolEditing"鍵或“CancelandExitProtocolEditing"鍵才能退出“ProtocolEdit"窗口。2.1.3反應(yīng)板設(shè)置文件(PlateSetupfile)設(shè)置指南在Workshop模塊中，用戶可以：點(diǎn)擊反應(yīng)板設(shè)置文件顯示區(qū)的“CreateNew”鍵創(chuàng)建一個(gè)新的反應(yīng)板設(shè)置文件；點(diǎn)擊反應(yīng)板設(shè)置文件顯示區(qū)的“Plate”鍵，在瀏覽器中選擇想要的反應(yīng)板設(shè)置文件的路徑并雙擊其文件名，即可選中該文件；點(diǎn)擊反應(yīng)板設(shè)置文件顯示區(qū)的“Plate”鍵打開瀏覽器，選擇想要的反應(yīng)板設(shè)置文件的路徑并雙擊其文件名，再點(diǎn)擊“Edit”鍵即可對(duì)該文件進(jìn)行修改；點(diǎn)擊“DataFile”鍵，在隨后出現(xiàn)的瀏覽器中選擇數(shù)據(jù)文件。點(diǎn)擊其文件名即可打開其關(guān)聯(lián)的反應(yīng)板設(shè)置文件，再點(diǎn)擊“Edit”鍵即可對(duì)其進(jìn)行修改。在“Notes”欄中輸入或修改對(duì)該文件的說明。在樣品體積(SampleVolume)、封板類型(SealType)、反應(yīng)容器類型(VesselType)各項(xiàng)設(shè)置中輸入或修改相應(yīng)內(nèi)容。輸入或修改文件名。點(diǎn)擊“Select/AddFluorophores”鍵選擇本次實(shí)驗(yàn)所要使用的熒光染料種類，在軟件中每種選中的熒光染料都會(huì)用一獨(dú)特的圖標(biāo)表示。如果“WholePlateLoading”顯示在取消狀態(tài)，請(qǐng)選擇該選項(xiàng)選項(xiàng)。注意當(dāng)用戶修改一個(gè)反應(yīng)板設(shè)置文件時(shí)，該選項(xiàng)為不可用。點(diǎn)擊某一樣品類型圖標(biāo)。用點(diǎn)擊或拖曳來設(shè)定該樣品類型對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔。點(diǎn)擊某一熒光染料圖標(biāo)。用點(diǎn)擊或拖曳來設(shè)定該熒光染料對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔。重復(fù)以上7~8兩個(gè)步驟，直到所有反應(yīng)孔第一熒光染料對(duì)應(yīng)的樣品類型全部設(shè)置完畢。如要取消某孔此前的所有設(shè)置，點(diǎn)擊“DeleteAll”鍵，再點(diǎn)擊該孔。如要取消某孔此前的熒光染料設(shè)置，點(diǎn)擊“DeleteFluorophore"鍵，再點(diǎn)擊該孔。如要某些反應(yīng)孔第一熒光染料對(duì)應(yīng)的樣品類型為標(biāo)準(zhǔn)品(Standard)，點(diǎn)擊“DilutionSeries”鍵可設(shè)置其原始靶核酸數(shù)量。以上為所有反應(yīng)板設(shè)置文件共通的部分，根據(jù)反應(yīng)板設(shè)置文件對(duì)應(yīng)類型不同，以下的步驟有所區(qū)別。單色熒光檢測(cè)(Single-ColorExperiments)點(diǎn)擊“Save&ExitSetup”鍵，在隨后出現(xiàn)的對(duì)話框中設(shè)置文件名并進(jìn)行保存。該文件會(huì)以后綴為".pts”的文件形式保存。多色熒光檢測(cè)并啟用“WholePlateLoading”選項(xiàng)(Multi-ColorExperimentswithWholePlateLoadingSelected)點(diǎn)擊第二熒光染料對(duì)應(yīng)的圖標(biāo)。如要取消當(dāng)前選擇的第二熒光染料，點(diǎn)擊“DeleteFluophore”圖標(biāo)并點(diǎn)擊相應(yīng)反應(yīng)孔。點(diǎn)擊“PaintCan”圖標(biāo)。用點(diǎn)擊或拖曳來設(shè)定第二熒光染料對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔。重復(fù)7~8兩個(gè)步驟，直到所有反應(yīng)孔第二熒光染料對(duì)應(yīng)的樣品類型全部設(shè)置完畢。重復(fù)15~19的步驟，把第三、第四熒光染料設(shè)置完畢(如有需要)。點(diǎn)擊“Save&ExitSetup”鍵，在隨后出現(xiàn)的對(duì)話框中設(shè)置文件名并進(jìn)行保存。該文件會(huì)以后綴為".pts”的文件形式保存。多色熒光檢測(cè)并不啟用“WholePlateLoading”選項(xiàng)(Multi-ColorExperimentswithWholePlateLoadingDeselected)點(diǎn)擊第二熒光染料對(duì)應(yīng)的圖標(biāo)。此時(shí)會(huì)顯示所有反應(yīng)孔對(duì)應(yīng)第一熒光染料會(huì)顯示，但其樣品類型不會(huì)顯示。同樣在設(shè)置第三及第四熒光染料時(shí)，此前的熒光染料對(duì)應(yīng)的樣品類型也不會(huì)顯示。如要取消當(dāng)前選擇的第二熒光染料，點(diǎn)擊“DeleteFluophore”圖標(biāo)并點(diǎn)擊相應(yīng)反應(yīng)孔。點(diǎn)擊某一樣品類型圖標(biāo)。用點(diǎn)擊或拖曳來設(shè)定第二熒光染料及該樣品類型對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔。重復(fù)17~18兩個(gè)步驟設(shè)置其他反應(yīng)對(duì)應(yīng)第二熒光染料的樣品類型。2.1.4反應(yīng)運(yùn)行指南點(diǎn)擊“Workshop”模塊的“Run”鍵，軟件即會(huì)切入“Run-TimeCentral”模塊的“InitiateRun”界面。2.1.4.1開始運(yùn)行一次反應(yīng)在“InitiateRun”界面選擇所要使用的反應(yīng)程序文件和反應(yīng)板設(shè)置文件。選擇孔間差異因子計(jì)算方式。點(diǎn)擊“BeginRun”鍵。在彈出的“SaveOpticalDataFile”對(duì)話框中輸入數(shù)據(jù)文件的文件名。點(diǎn)擊“OK”鍵。2.1.4.2反應(yīng)運(yùn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控在反應(yīng)運(yùn)行開始后，軟件會(huì)切入“MonitorRun”界面，在這里會(huì)實(shí)時(shí)顯示反應(yīng)狀況。在反應(yīng)結(jié)束后，會(huì)自動(dòng)彈出“RunStatus”對(duì)話框。如點(diǎn)擊“Yes”，軟件會(huì)切入“DataAnalysis”模塊顯示本次反應(yīng)的數(shù)據(jù)。如點(diǎn)擊“No”，軟件會(huì)退回“Workshop”模塊。2.2數(shù)據(jù)分析指南2.2.1綜述“DataAnalysis”模塊的主要功能就是讓用戶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。當(dāng)用戶剛打開iQ?5軟件時(shí)，“DataAnalysis”模塊的切換鍵顯示為灰色不可選。用戶只有通過“Workshop”模塊的“DataFile”界面選擇一數(shù)據(jù)文件后點(diǎn)擊“Analyze”鍵，即可進(jìn)入“DataAnalysis”模塊。“DataAnalysis"模塊分為以下六個(gè)功能界面：1.PCRQuant&2.MeltCurve/Peak&3.EndPoint&4.AllelicDisc&5.GeneExpr&6.EditPlatePCRQuant界面設(shè)置指南“PCRQuant”界面主要的功能是設(shè)置本底和臨界閾值等參數(shù)來進(jìn)行PCR定量計(jì)算。當(dāng)這些參數(shù)設(shè)置完成后，軟件就會(huì)自動(dòng)分析出每孔樣品的臨界循環(huán)數(shù)。如果用戶之前設(shè)定了標(biāo)準(zhǔn)品，那么此時(shí)軟件還會(huì)計(jì)算出其他各孔樣品的原始靶核酸含量。對(duì)于多重?zé)晒釶CR來說，任一種熒光染料對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)均可實(shí)現(xiàn)以上分析功能。在本界面中，主要實(shí)現(xiàn)以下設(shè)置：設(shè)置熒光PCR的本底；設(shè)置臨界閾值；添加或刪除需要分析的反應(yīng)孔?！癢orkshop”模塊中點(diǎn)擊“DataFile”鍵。選擇一個(gè)數(shù)據(jù)文件，點(diǎn)擊“Analyze”鍵，軟件會(huì)自動(dòng)切入“PCRQuant”界面，并自動(dòng)設(shè)置本底和臨界閾值。用戶可根據(jù)需要，通過“AnalyzeWells”選項(xiàng)添加或刪除需分析的反應(yīng)孔。如果當(dāng)前界面不是“PCRQuant”界面，請(qǐng)點(diǎn)擊“PCRQuant”切換鍵。第一次進(jìn)入一個(gè)數(shù)據(jù)文件時(shí)，軟件會(huì)自動(dòng)設(shè)置本底和臨界閾值。如果某個(gè)數(shù)據(jù)文件被修改保存后再打開，此時(shí)顯示的是最近一次修改的內(nèi)容。按照需要手動(dòng)調(diào)節(jié)本底。按照需要手動(dòng)調(diào)節(jié)臨界閾值。在手動(dòng)調(diào)節(jié)時(shí)，用戶可以隨時(shí)通過右擊曲線圖選擇“BaselineThresholdfromthecontextmenu”返回軟件自動(dòng)調(diào)節(jié)模式。MeltCurve/Peak界面設(shè)置指南該界面用于分析雙鏈DNA的熔點(diǎn)溫度（Tm值）。用戶可以通過加入能與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料（比如SYBRGreenI等）或熒光標(biāo)記的雜交探針進(jìn)行反應(yīng)，再用該界面進(jìn)行分析?！癢orkshop”模塊中點(diǎn)擊“DataFile”鍵，選擇一個(gè)數(shù)據(jù)文件，點(diǎn)擊“Analyze”鍵，軟件會(huì)自動(dòng)切入“DataAnalysis”模塊。點(diǎn)擊“MeltCurve/Peak”切換鍵進(jìn)入該界面，此時(shí)熔點(diǎn)曲線圖及其峰圖就會(huì)顯示出來。用戶可根據(jù)需要，通過“AnalyzeWells”選項(xiàng)添加或刪除需分析的反應(yīng)孔。右擊熔點(diǎn)曲線圖，在彈出的對(duì)話框中可以選擇參數(shù)調(diào)整、復(fù)制圖表、打印圖表等等操作。拖曳臨界閾值條，將該值調(diào)整到合適的位置。用戶可以在列表中選擇某一峰，然后點(diǎn)擊“DeleteSelectedPeak”即可在圖中刪除該峰。用Shift組合鍵可以實(shí)現(xiàn)群刪。點(diǎn)擊“EditMeltPeakBegin/EndTemp”鍵可對(duì)默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行修改。點(diǎn)擊“RestoreDefault”可以返回默認(rèn)設(shè)置。EndPoint界面設(shè)置指南終點(diǎn)法分析，它通過樣品相對(duì)熒光讀數(shù)(RalativeFluorescenceUnit簡(jiǎn)稱RFU)終值來對(duì)樣品的陰、陽(yáng)性進(jìn)行定性判斷。用戶可以采取以下兩個(gè)方法進(jìn)入該界面進(jìn)行終點(diǎn)法分析：在運(yùn)行時(shí)點(diǎn)擊“RunEndPoint”鍵。進(jìn)入“DataAnalysis”模塊后點(diǎn)擊“EndPoint”切換鍵。以下就分別就這兩種方法進(jìn)行說明方法一終點(diǎn)法運(yùn)行將加好樣、封閉完成的反應(yīng)板放到儀器的加熱模塊上，合上熱蓋。在“Workshop"模塊中設(shè)置好反應(yīng)板設(shè)置文件。點(diǎn)擊“RunEndPoint”鍵。進(jìn)入“Run-TimeCenter”模塊的“InitiateRun”界面，調(diào)整完反應(yīng)程序文件后，點(diǎn)擊“BeginRun”注意：進(jìn)行終點(diǎn)法分析時(shí)，其孔間差異因子必須恒定。輸入其數(shù)據(jù)文件名，點(diǎn)擊“Save”鍵保存。當(dāng)反應(yīng)運(yùn)行完成后，軟件會(huì)自動(dòng)切入“EndPoint”界面。調(diào)整以下參數(shù)：分析方法——運(yùn)用“Nagatives”區(qū)分出那些未擴(kuò)增的反應(yīng)孔、終點(diǎn)誤差及誤差參數(shù)。用戶可根據(jù)需要，通過“AnalyzeWells”選項(xiàng)添加或刪除需分析的反應(yīng)孔。在“DefineControl”中定義陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。點(diǎn)擊“Recalculate”鍵，軟件進(jìn)行分析。并在“UnknownsCall”中給出每個(gè)未知樣本是陰性、陽(yáng)性還是空白的定性結(jié)果。11.點(diǎn)擊“Report”鍵獲得分析報(bào)告。方法二終點(diǎn)法數(shù)據(jù)分析“Workshop”模塊中點(diǎn)擊“DataFile”鍵，選擇一個(gè)數(shù)據(jù)文件。點(diǎn)擊“Analyze”鍵。點(diǎn)擊“EndPoint”切換鍵進(jìn)入該界面。調(diào)整以下參數(shù)：分析方法——運(yùn)用“Nagatives”區(qū)分出那些未擴(kuò)增的反應(yīng)孔、終點(diǎn)誤差及誤差參數(shù)。用戶可根據(jù)需要，通過“AnalyzeWells”選項(xiàng)添加或刪除需分析的反應(yīng)孔。在“DefineControl”中定義陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。點(diǎn)擊“Recalculate”鍵，軟件進(jìn)行分析。并在“UnknownsCall”中給出每個(gè)未知樣本是陰性、陽(yáng)性還是空白的定性結(jié)果。點(diǎn)擊“Report”鍵獲得分析報(bào)告。AllelicDisc界面指南該界面可以通過與已知基因型樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較得到未知樣品的基因型結(jié)果。用戶可以通過臨界循環(huán)數(shù)或RFU來確定樣品是野生純合子、變異純合子還是雜合子。“Workshop”模塊中點(diǎn)擊“DataFile”鍵，選擇一個(gè)數(shù)據(jù)文件。點(diǎn)擊“Analyze”鍵，軟件會(huì)切入“PCRQuant”界面，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)設(shè)置本底和臨界閾值，如用戶想對(duì)其進(jìn)行修改，參看上文相關(guān)內(nèi)容。用戶可根據(jù)需要，通過“AnalyzeWells”選項(xiàng)添加或刪除需分析的反應(yīng)孔。點(diǎn)擊“AllelicDisc”切換鍵進(jìn)入該界面。在“AssignFluorophores”欄中選擇各基因型對(duì)應(yīng)的熒光染料。在“DisplayMode”欄中選擇統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的類型(臨界循環(huán)數(shù)還是RFU)?！癟hresholdCycle”代表臨界循環(huán)數(shù)。注意：如一樣品在反應(yīng)中其熒光讀數(shù)未超過臨界閾值，則在散點(diǎn)圖上該樣品的臨界循環(huán)數(shù)將會(huì)表示成反應(yīng)循環(huán)的總數(shù)?！癛FU”代表相對(duì)熒光讀數(shù)。用戶可以通過“SelectCycle”來選擇取哪個(gè)循環(huán)的讀數(shù)進(jìn)行分析。選擇“AutomaticCall”或者“ManualCall”來進(jìn)行分析，其中“AutomaticCall”（自動(dòng)分析）是默認(rèn)模式。在“AutomaticCall”模式中，軟件會(huì)自動(dòng)生成散點(diǎn)圖進(jìn)行分析?！癕anualCall”是另一種分析模式，用戶可以手動(dòng)在散點(diǎn)圖或數(shù)據(jù)列表中修改參數(shù)。點(diǎn)擊“Report”鍵獲得分析報(bào)告。GeneExpr界面指南在本界面中，軟件會(huì)以定量PCR為基礎(chǔ)對(duì)基因之間的表達(dá)進(jìn)行比較。比如取兩個(gè)基因進(jìn)行比較，一個(gè)反應(yīng)孔里有100ngcDNA，另一個(gè)只有1ngcDNA，通過定量PCR分析就能得到其相對(duì)的關(guān)系。iQ?5軟件提供了兩種基因表達(dá)比較模式：相對(duì)表達(dá)和校正表達(dá)。前者直接用樣品的CT值進(jìn)行比較。后者則設(shè)定一個(gè)恒定量對(duì)照基因，用樣品與其的對(duì)照值進(jìn)行比較，該基因事先要用細(xì)胞數(shù)測(cè)定、RNA豐度等非PCR方法定好量。比如樣品A和B，兩者CT值相同。用前者比較就1:1。如果用后者，如果設(shè)定相同CT值時(shí)，A的熒光染料與對(duì)照基因?qū)Ρ戎凳荁的熒光染料與對(duì)照基因?qū)Ρ戎礏的熒光染料的兩倍時(shí)候，那結(jié)果就會(huì)是2：1。2.2.5.1相對(duì)表達(dá)指南根據(jù)上文所述，在“PCRQuant”界面調(diào)整好定量PCR參數(shù)。點(diǎn)擊“GeneExpr”切換鍵，進(jìn)入該界面。選擇“RelativeQuantity”的分析模式。如有需要，可調(diào)節(jié)相應(yīng)參數(shù)。點(diǎn)擊“Recalculate”鍵獲得結(jié)果。2.2.5.2校正表達(dá)指南根據(jù)上文所述，在“PCRQuant”界面調(diào)整好定量PCR參數(shù)。點(diǎn)擊“GeneExpr”切換鍵，進(jìn)入該界面。選擇“NormalizedQuantity”的分析模式。如有需要，可調(diào)節(jié)相應(yīng)參數(shù)。在表達(dá)設(shè)置中選擇相應(yīng)基因。點(diǎn)擊“Recalculate”鍵獲得結(jié)果。EditPlate界面指南在這個(gè)界面里，用戶可以對(duì)反應(yīng)板設(shè)置文件中的各孔的反應(yīng)類型進(jìn)行修改，也可以對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的原始靶核酸量進(jìn)行修改。這樣，萬一用戶在實(shí)驗(yàn)運(yùn)行前設(shè)置發(fā)生錯(cuò)誤的話，在這里可以很方便地