2022年醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體

第四章

細(xì)胞融合與單克隆抗體(kàngtǐ)山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(xuéyuàn)第一頁，共五十一頁。第一節(jié)細(xì)胞融合概述(ɡàishù)第二頁，共五十一頁。細(xì)胞融合（cellfusion)，又稱體細(xì)胞雜交（somatichybridiazation），是指兩個或更多個相同或不同細(xì)胞通過(tōngguò)膜融合形成單個細(xì)胞的過程。一、細(xì)胞融合的定義(dìngyì)第三頁，共五十一頁。Muller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。Lange于1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。1958年日本學(xué)者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有(jùyǒu)觸發(fā)動物細(xì)胞融合的效應(yīng)。1974年華裔加拿大學(xué)者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。二、細(xì)胞融合研究進(jìn)展第四頁，共五十一頁。生物種類細(xì)胞來源成功年代煙草兩個種間苷藍(lán)——青菜大豆——馬唐草矮牽?！埫婊ù篼湣ㄉ篼湣蠖剐←湣珷颗Ｓ筒恕蠖褂衩住蠖勾蠖埂巴愣勾篼湣Q豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細(xì)胞葉——花瓣葉——懸浮細(xì)胞葉——懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞——懸浮細(xì)胞葉——根懸浮細(xì)胞——葉原生質(zhì)體——血紅細(xì)胞懸浮細(xì)胞——葉懸浮細(xì)胞——葉腹水癌細(xì)胞——原生質(zhì)體葉——根尖纖維肉瘤細(xì)胞——畸胎瘤細(xì)胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972幾種(jǐzhǒnɡ)細(xì)胞融合成功的例子第五頁，共五十一頁。植物融合(rónghé)細(xì)胞成長狀態(tài)對比,右瓶為地面融合(rónghé)的細(xì)胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合(rónghé)的細(xì)胞

第六頁，共五十一頁。動物細(xì)胞融合實驗(shíyàn)使用的小白鼠第七頁，共五十一頁。三、動植物細(xì)胞(xìbāo)的融合過程植物(zhíwù)細(xì)胞融合過程人造(rénzào)小鼠培育過程示意圖第八頁，共五十一頁。四、細(xì)胞融合的意義(yìyì)理論上說任何細(xì)胞，都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體(kàngtǐ)的制備。第九頁，共五十一頁。第二節(jié)細(xì)胞融合的基本原理第十頁，共五十一頁。顯微鏡下細(xì)胞融合過程(guòchéng)第十一頁，共五十一頁。融合過程(guòchéng)中兩個細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的變化過程(guòchéng)圖解第十二頁，共五十一頁。用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物(dòngwù)細(xì)胞融合過程示意圖

第十三頁，共五十一頁。第三節(jié)細(xì)胞融合的常用(chánɡyònɡ)方法第十四頁，共五十一頁。一、仙臺病毒法仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個階段：①兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在4℃條件下病毒附著在細(xì)胞膜上。并使兩細(xì)胞相互凝聚；②在37℃中，病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)(fǎnyìng)，細(xì)胞膜受到破環(huán)，此時需要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一8.2；②細(xì)胞膜連接部穿通，周邊連接部修復(fù)，此時需Ca2+和ATP；④融合成巨大細(xì)胞，仍需ATP。第十五頁，共五十一頁。病毒促使細(xì)胞融合的主要(zhǔyào)步驟如下：兩個原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此(bǐcǐ)靠近；通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透；兩個原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合，兩個細(xì)胞融為一體；進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細(xì)胞。第十六頁，共五十一頁。用滅活的病毒(bìngdú)誘導(dǎo)的動物細(xì)胞融合過程示意圖

第十七頁，共五十一頁。

優(yōu)點是易得，用法簡單，融合效果穩(wěn)定。聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作細(xì)胞融合劑。PEG濃度以W/W；如將10克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定1ml培養(yǎng)液為1g重)，即成50％PEG溶液。PEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫?zé)岬腅ngle氏液混合。通常(tōngcháng)用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50％PEG溶液能產(chǎn)生最多雜交細(xì)胞。PEG溶液在pH6.0時細(xì)胞融合率最高。二、聚乙二醇（PEG）法第十八頁，共五十一頁。聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合過程(guòchéng)第十九頁，共五十一頁。PEG的作用機(jī)理：Kao等認(rèn)為，由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成(xíngchéng)H鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成(xíngchéng)分子橋，其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。

PEG誘導(dǎo)融合的特點：其優(yōu)點是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制(xiànzhì)。其缺點是融合過程繁瑣，PEG可能對細(xì)胞有毒害。

第二十頁，共五十一頁。聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合步驟（1）將兩種不同親本(qīnběn)細(xì)胞各5×l06混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml50％PEG溶液，用吸管吹打，使之與細(xì)胞接觸1分鐘；（4）加9ml培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml培養(yǎng)液，分別接種5個直徑60mm平皿，每個平皿加培養(yǎng)液至5ml，37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）6—24小時后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞。第二十一頁，共五十一頁。第二十二頁，共五十一頁。三、電融合法電融合法是80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點：融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對細(xì)胞傷害小；裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察(guānchá)或錄像觀察(guānchá)融合過程；免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控性強(qiáng)。第二十三頁，共五十一頁。電融合的基本過程：細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(liǎnɡɡè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。

第二十四頁，共五十一頁。電融合誘導(dǎo)法原理(yuánlǐ)示意圖第二十五頁，共五十一頁。第三節(jié)雜種(zázhǒng)細(xì)胞的篩選根據(jù)已經(jīng)發(fā)生(fāshēng)融合的細(xì)胞中所含有核的類型，可將其分為以下幾種類型：異核細(xì)胞：非同源細(xì)胞的融合體。同核細(xì)胞：兩個相同細(xì)胞的融合體。多核細(xì)胞：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。第二十六頁，共五十一頁。基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物(yàowù)抗性所建立的雜種篩選基于營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選由溫度敏感型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞的篩選具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選常用的雜種(zázhǒng)細(xì)胞篩選方法第二十七頁，共五十一頁。第四節(jié)細(xì)胞(xìbāo)雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體第二十八頁，共五十一頁。一、何謂(héwèi)單克隆抗體？第二十九頁，共五十一頁。第三十頁，共五十一頁。第三十一頁，共五十一頁。第三十二頁，共五十一頁。只針對某一抗原決定簇的抗體分子(fēnzǐ)稱為單克隆抗體。第三十三頁，共五十一頁。單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細(xì)胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridomacell)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此(yīncǐ)，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology

）。第三十四頁，共五十一頁。NielsK.Jerne

G.Kohler

C.Milstein

第三十五頁，共五十一頁。二、雜交瘤技術(shù)(jìshù)的基本原理第三十六頁，共五十一頁。三、雜交瘤細(xì)胞(xìbāo)的制備（一）骨髓瘤細(xì)胞(xìbāo)選擇及選擇性培養(yǎng)基骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體選擇(xuǎnzé)次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第三十七頁，共五十一頁。HAT培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基(ānjī)喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶(jīméi)缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第三十八頁，共五十一頁。（二）免疫(miǎnyì)小鼠

免疫程序是取6—8周齡Balb／C雌鼠，基礎(chǔ)免疫2周，靜脈再加強(qiáng)免疫一次，3—5天后用于融合。免疫時是否采用佐劑和事先處理(chǔlǐ)抗原，要依抗原性的強(qiáng)弱而定。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好?？乖客瑯优c抗原強(qiáng)弱有關(guān)，以IgG為例，第一次為loog，第二次為50g，免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。對于細(xì)胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1×l06一1×107。第三十九頁，共五十一頁。（三）脾細(xì)胞(xìbāo)的制備(1)引頸處死小鼠，用酒精(jiǔjīng)消毒體表；(2)無菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和脂肪，用5ml無血清培養(yǎng)液沖洗一次；(3)把脾臟置于已消毒的90一100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中；(4)在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養(yǎng)液沖洗，令細(xì)胞通過紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入3ml無血清培養(yǎng)液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細(xì)胞，再制成細(xì)胞懸液亦可；(5)把細(xì)胞懸液注入50ml離心管中，加l0一20ml培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中置5分鐘；(6)離心(800一1000轉(zhuǎn)／分)計數(shù)、備用。第四十頁，共五十一頁。（四）細(xì)胞(xìbāo)準(zhǔn)備（1）收集骨髓瘤細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37℃)，計數(shù)活力(huólì)細(xì)胞(不少于90％)；（2）收集小鼠脾細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37℃)，并計細(xì)胞數(shù)和測定活力細(xì)胞；（3）按1：5或1：10混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上清。第四十一頁，共五十一頁。（五）細(xì)胞融合(1)將1ml40％的PEG液一滴滴加入列細(xì)胞團(tuán)中，在60秒內(nèi)加完，同時并不斷輕微轉(zhuǎn)動離心管或用手指輕彈離心管；(2)在不斷轉(zhuǎn)動離心管中加1ml無血清培養(yǎng)液，60秒鐘內(nèi)加完；(3)于5分鐘內(nèi)慢慢(mànmàn)加完20ml無血清培養(yǎng)液；此時細(xì)胞對機(jī)械損傷非常敏感，(4)離心(800轉(zhuǎn)／分，8分鐘)，去上清，用完全培養(yǎng)液10ml懸浮，輕輕混勻；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等體積細(xì)胞懸液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5％CO2，溫箱中37℃培養(yǎng)，24小時后更換成HAT選擇性培養(yǎng)掖。第四十二頁，共五十一頁。（六）融合(rónghé)后細(xì)胞培養(yǎng)(1)融合后7—10天用HAT培養(yǎng)液半量換液(留一半舊的加一半新的)后每隔2—3天半量換液一次；(2)兩周后可改用HA培養(yǎng)液半量換液，或仍用HAT培養(yǎng)液；(3)2—3周后出現(xiàn)雜交細(xì)胞集落，細(xì)胞個大、圓且透明；(4)待集落增殖生長(shēngzhǎng)至1／3孔時，應(yīng)進(jìn)行抗體檢測。第四十三頁，共五十一頁。HAT培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基(ānjī)喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷(quēxiàn)型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第四十四頁，共五十一頁。（七）抗體(kàngtǐ)檢測免疫熒光試驗(shìyàn)放射免疫試驗(RIA)聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)第四十五頁，共五十一頁。（八）單克隆抗體(kàngtǐ)的大量制備體內(nèi)(tǐnèi)法培養(yǎng)法第四十六頁，共五十一頁。四、單克隆抗體(kàngtǐ)的應(yīng)用單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地由于臨床醫(yī)學(xué)的疾病診斷，以提高疾病診斷的準(zhǔn)確性。利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅(bùjǐn)能大大降低生產(chǎn)成本，同時也增加了疫苗的安全性。單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛在技術(shù)。單克隆抗體技術(shù)還可廣泛用于各種基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，從而推動現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展。

第四十七頁，共五十一頁。第五節(jié)人源單克隆抗體(kàngtǐ)主要困難（1）缺乏合適的人骨髓瘤細(xì)胞株作為融合親本(qīnběn)?，F(xiàn)有的細(xì)胞株大多是融合率不高，雜交