《分離以尿素為氮源的微生物》教學(xué) 省賽獲獎(jiǎng)-完整版課件

實(shí)驗(yàn)2分離以尿素為氮源的微生物1.使用專一的培養(yǎng)基（含有尿素）分離專一的細(xì)菌（有脲酶的細(xì)菌）。2.利用指示劑顏色的變化檢知（脲酶）所催化的反應(yīng)。微生物種類多樣，也有多種代謝類型。根瘤菌，為固氮菌，可固定空氣中的氮?dú)饧賳捂邨U菌，可以分解石油的超級(jí)細(xì)菌。尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥，人類和其他哺乳動(dòng)物的尿中都含有尿素，大量尿素的存在會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。既然微生物有多種代謝類型，那么有沒有能降解尿素的微生物呢？今天我們就試試能不能從土壤中分離出以尿素為氮源的微生物。1、尿素的利用

尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)脲酶+H2O+CO2NH33、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的①?gòu)耐寥乐蟹蛛x出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌1、實(shí)例：DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（93℃）的DNA聚合酶。啟示：尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。原因：因?yàn)闊崛獪囟?0～80℃，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來。要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等；方法：⑴抑制大多數(shù)微生物不能生長(zhǎng)；⑵造成有利于該菌生長(zhǎng)的環(huán)境。結(jié)果：培養(yǎng)一定時(shí)間后，該菌數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對(duì)它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。3、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)2、間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）⑴原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×MC代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。注意事項(xiàng)①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的培養(yǎng)皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。④涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個(gè)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為最好。計(jì)數(shù)法直接計(jì)數(shù)法平板計(jì)數(shù)法比濁法膜過濾法１、制備無菌的尿素固體培養(yǎng)基和ＬＢ固體培養(yǎng)基尿素培養(yǎng)基

葡萄糖0.025gNaCl0.12gK2HPO40.12g

瓊脂糖

0.5g

酚紅

0.25g

水

15mlLB培養(yǎng)基

蛋白胨

0.25g

酵母粉

0.12gNaCl

0.25g

瓊脂糖

0.5g

水25ml對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組２、倒平板：需要倒３個(gè)ＬＢ培養(yǎng)基，９個(gè)尿素固體培養(yǎng)基LB(對(duì)照)尿素10-210-310-4每個(gè)稀釋度1個(gè)LB對(duì)照平板3個(gè)尿素平板(平行重復(fù)組)３、制備一定濃度梯度的細(xì)菌懸液：１g土壤＋９９ml無菌水，振蕩，為１０２稀釋液，依次制備１０３、１０４、１０５的土壤稀釋液。1個(gè)99ml無菌水2個(gè)4.5ml無菌水得10-2

10-3,10-4的菌懸液1g土壤４、稀釋涂布分離法分離細(xì)菌取0.1ml菌懸液高濃度→低濃度，換槍頭低濃度→高濃度，可不用換槍頭接種涂布分離５、培養(yǎng)觀察（倒置，３７度）按濃度捆成一摞恒溫37℃培養(yǎng)LB培養(yǎng)基上10-2、10-3、10-4

、10-5稀釋度土樣涂布結(jié)果尿素培養(yǎng)基上10-2、10-3、10-4

、10-5稀釋度土樣涂布結(jié)果1、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法有（）A.①②③⑥B.③④⑤⑥C.②③④⑥D(zhuǎn).①③④⑥D(zhuǎn)①涂布平板法②重量法③直接計(jì)數(shù)法

④比濁法⑤生理指標(biāo)法⑥膜過濾法2、土壤中有些微生物能利用尿素是因?yàn)?

)A．其體內(nèi)含有脲酶B．其體內(nèi)含有氨(NH3)酶C．它能將CO2合成為有機(jī)物D．它們不需要氮源A3、用10－4稀釋度的細(xì)菌懸液分別涂布于LB、尿素培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后的結(jié)果，以下敘述正確的是(

)A．LB培養(yǎng)基上未出現(xiàn)任何菌落B．尿素培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落數(shù)量和種類都多于LB培養(yǎng)基上的C．尿素培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落數(shù)量和種類都少于LB培養(yǎng)基上的D．尿素培養(yǎng)基上是不可能出現(xiàn)菌落的C4、在做分離分解尿素的細(xì)菌實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)10-6