基于高通量測序的萬峰湖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

基于高通量測序的萬峰湖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析摘要:以高通量測序技術(shù)分析萬峰湖庫區(qū)上中下游水體不同水層細(xì)菌的多樣性,共鑒定出細(xì)菌門23個，細(xì)菌屬263個，各水樣含共有細(xì)菌門13個，共有細(xì)菌屬107個。Limnohabitans&Ilumatobacter&Rhodoluna、Terracoccus四個屬為萬峰湖水體優(yōu)勢細(xì)菌屬。研究顯示，地理位置是影響萬峰湖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素。萬峰湖水體細(xì)菌多樣性水平為上游V中游V下游；不同水層種屬多樣性差異不明顯。萬峰湖水體細(xì)菌特異性水平為上游V中游V下游，中層V上層V下層。關(guān)鍵詞：高通量測序；萬峰湖;微生物多樣性BacterialCommunityDiversityinWanfengLakebasedonHigh-throughputSequencingAbstract：Thisarticleanalyzesthemicrobialdiversityindifferentwaterlevelfromupper,middleandlowerreachesofWanfengLake.Throughhigh-throughputsequencingtechnology,23phylaand263generawereidentified.Thereare13phylaand107generafoundinallsamples.Thereare4dominantgenerainWanfenglakewhicharelimnohabitans,ilumatobacter,rhodolunaandterracoccus.Accordingtotheresearch,geographicalpositionisthemaininfluencefactorofbacterialcommunitydiversityinWanfenglake.ThebacterialdiversitiesofWanfenglakearetheupperreaches<themiddlereaches"thelowerreaches.Diversitydifferencearen,tobviousindifferentwaterlayer.ThemicrobialspecificitiesofWanfenglakearetheupperreaches#themiddlereaches$thelowerreaches,andthemiddlelayer%theupperlayer<thelowestlayer.Keywords:highthroughputsequence;Wanfenglake;microbialdiversity水體微生物作為水生態(tài)系統(tǒng)中重要的參與者，其數(shù)量大、種類多、存在一定群落結(jié)構(gòu)，能對環(huán)境變化做出敏感反應(yīng)，從而預(yù)測環(huán)境變化、指示生態(tài)現(xiàn)狀[1]o除此之外,水體微生物還可通過自身代謝過程來影響水生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)、能量循環(huán)等生物地球化學(xué)循環(huán)過程，它們在地球元素循環(huán)中發(fā)揮著關(guān)鍵的驅(qū)動作用A]o研究水體微生物群落組成，能為保護(hù)水圈生態(tài)服務(wù)功能、合理利用自然資源、管理和維護(hù)湖泊生態(tài)環(huán)境提供科學(xué)依據(jù)，能對推動國民經(jīng)濟(jì)與社會的可持續(xù)發(fā)展做出貝獻(xiàn)。利用高通量測序技術(shù)宏觀地研究水體種中微生物群落組成已經(jīng)成為現(xiàn)今重要的技術(shù)手段。朱德銳等利用高通量測序研究了青藏高原鹽湖超鹽環(huán)境中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，獲得鹽湖中的優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)以及與環(huán)境因子的關(guān)系余偉鈺等利用高通量測序研究分析了不同時空條件下三峽庫區(qū)水體固氮微生物，其固氮微生物的種群結(jié)構(gòu)和多樣性具有時空差異回;劉強(qiáng)等利用高通量測序分析出了舟山群島不同功能區(qū)劃海域細(xì)菌優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)孔萬峰湖位于貴州、云南、廣西三省交界處,以喀斯特地貌和湖光山色為特色，是國家級風(fēng)景名勝區(qū),集供水、發(fā)電、灌溉、養(yǎng)殖、防洪、旅游及調(diào)節(jié)自然生態(tài)等七大功能于一湖，其總庫容為102.6億m3,是全國五大人工淡水湖泊之一啊。因萬峰湖處于三省交界地帶，缺乏統(tǒng)一管理，存在工農(nóng)業(yè)污水和生活污水亂排放現(xiàn)象，水庫水質(zhì)已出現(xiàn)富營養(yǎng)化叫11〕。本研究采用高通量測序技術(shù)對萬峰湖上中下游不同水層的細(xì)菌多樣性、水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性以及優(yōu)勢細(xì)菌屬等進(jìn)行了宏觀的分析，為萬峰湖生態(tài)環(huán)境的管理和維護(hù)提供理論依據(jù)。一、材料方法（一） 材料試劑:TaqDNAPolymerase（1000U）:中國Vazyme公司;E.Z.N.A.RSoilDNAKit：美國OMEGA公司;AgencourtAMPureXP：美國Beckman公司；Qubit3.0DNA檢測試劑盒:美國Life公司。（二） 方法水樣采集于萬峰湖上游（N24。475,E105。01）、中游（N24。51,E105。025）、下游（N：24。56,，E：105。05,），三個河道交匯點(diǎn)進(jìn)行采樣，分別用G、B、T表示采樣地點(diǎn);每個采樣點(diǎn)分別對表層、中層（25m）、下層（50m）三個水層進(jìn)行水樣采集,分別用u、m、d表示采樣水層。采樣地理位置見圖1%采樣時間為2019年1月，天氣晴朗,無降水影響。使用2L水樣采集器，進(jìn)行水樣采集并分裝至500m1無菌水樣收集袋中。T采樣點(diǎn)?天生橋供下游或佰?B采樣點(diǎn)圖1采樣分布圖Fig.1Sketchofthesamplingpositions水體細(xì)菌收集通過砂芯抽濾器將1L水樣中的細(xì)菌真空抽濾至0.226m無菌聚碳酸酯膜上并低溫保存。總DNA提取與檢測將濾膜剪碎后使用E.Z.N.A.RSoilDNAKit提取水樣濾膜上的總DNA,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。PCR擴(kuò)增利用Qubit3.0DNA檢測試劑盒對總DNA精確定量后，進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。第一輪PCR擴(kuò)增以所提DNA為模板，采用了Miseq測序平臺的V3-V4區(qū)通用引物（341PrimerF：5'-CCCTA-CACGACGCTCTTCCGATCTG-35;805PrimerR：55-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC-CA-3'）［12］進(jìn)行擴(kuò)增。第二輪PCR擴(kuò)增以第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，采用Illumina橋式PCR兼容引【物（PrimerF：5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG-3;PrimerR：5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）［13］進(jìn)行擴(kuò)增。對兩輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,采用AgencourtAMPureXP對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、回收。測序回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用Qubit3.0DNA檢測試劑盒進(jìn)行DNA定量,使最終上機(jī)測序濃度為20pmol%上機(jī)測序由生工生物工程（上海）股份有限公司的IlluminaMiSeq測序平臺完成％微生物分類鑒定與分析測序序列通過拼接、過濾、去除非特異性擴(kuò)增序列及嵌合體，最終得到有效序列％利用QIIME軟件劃分操作分類單兀（operationaltaxonomicunit,OTU）,將相似度＞97%的序列定義為一個OTU,每個OTU對應(yīng)于一種代表序列％基于16SRNA基因數(shù)據(jù)庫［w（（RDP數(shù)據(jù)庫、Silva數(shù)據(jù)庫、NCBI16S數(shù)據(jù)庫）進(jìn)行16SrRNA基因序列比對、分類學(xué)注釋％采用RDPclassifier算法對97%水平OTU進(jìn)行聚類分析和主成分分析（PCA），并對樣品的Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行分析%Alpha多樣性指數(shù)衡量指標(biāo)包括體現(xiàn)菌群檢測覆蓋率的Coverage;用來估算生物總數(shù)的超指數(shù)（Chao）;用來體現(xiàn)生物多樣性的香農(nóng)指數(shù)（Shannon）和辛普森指數(shù)（Simpson），其中Shannon與生物多樣性呈正相關(guān),Simpson與生物多樣性呈負(fù)相關(guān)％通過制作韋恩圖揭示各采樣點(diǎn)以及水層中細(xì)菌的異同與相關(guān)性％利用R語言繪制柱狀圖，揭示各地理位置和水層中細(xì)菌群落組成和豐度％二、結(jié)果與分析（一）OTU豐度的樣本聚類分析樣本聚類樹圖可以通過樹枝結(jié)構(gòu)直觀地反應(yīng)出多個樣品間的相似性和差異關(guān)系％根據(jù)各水樣OTU豐度進(jìn)行層次聚類分析、構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)，得到樣本聚類樹圖，結(jié)果見圖2%圖2基于OTU的樣本聚類樹圖Fig.2ClusteringtreebasedonOTU如圖2所示，各采樣點(diǎn)的不同水層基本上處于同一聚類，僅B采樣點(diǎn)的上層（Bu）水樣與B采樣點(diǎn)的中層（Bm）和下層（Bd）水樣不在同一聚類%結(jié)果表明各采樣點(diǎn)不同水層的細(xì)菌群落相似性較高，水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主要由水體地理位置決定,同一地理位置中不同水層深度的水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似％結(jié)合B采樣點(diǎn)的地理環(huán)境位置，分析造成B采樣點(diǎn)上層水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與中層和下層出現(xiàn)差異的原因可能因為B采樣點(diǎn)位于巴結(jié)鎮(zhèn)附近,人口較為密集,人類活動對此處水體微生物影響較大,且此處設(shè)有萬峰湖一號碼頭，船只來往頻繁等原因所致％（二）基于OTU的樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性分析基于OTU水平，采用PCA（主成分分析）對各水樣中生物群落的相似性進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3%由圖3可知,PCA1、PCA2分別解釋了樣品中細(xì)菌OTU的82%和8%的信息，累計貢獻(xiàn)率為90%,可較全面地解釋各水樣OTU水平上的異同％各相同采樣點(diǎn)不同水層的樣品較為集中、距離較近，而各相同水層不同采樣點(diǎn)的樣品距離較遠(yuǎn)％由此可知相同地理位置不同水層的水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，而相同水層不同采樣點(diǎn)之間水體細(xì)菌群落相似性較小，再次驗證了地理位置是影響水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性的主要因素%圖3基于OTU的PCA分析Fig.3PCAanalysisbasedonOTU（三）細(xì)菌多樣性分析根據(jù)測序結(jié)果分析各樣品的細(xì)菌.多樣性,結(jié)果見表2%反映測序覆蓋程度的Coverage指數(shù)

均在0.985以上，說明本次測序數(shù)據(jù)可靠。從代表群落生物總量Chao指數(shù)來看，Chao指數(shù)在2394.4至2091.3之間，從采樣點(diǎn)位置和水層來看不存在明顯趨勢，說明水體生物總量差異不明顯。Shannon指數(shù)和Simpson分別與微生物多樣性呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)。Shannon多樣性指數(shù)越大，表示細(xì)菌多樣性越高，而Simpson多樣性指數(shù)越大，則表示細(xì)菌多樣性越低?，F(xiàn)以Shannon指數(shù)為例來分析各水樣中細(xì)菌多樣性。為了比較不同地點(diǎn)和深度湖水細(xì)菌多樣性差異，對不同地點(diǎn)和深度湖水微生物Shannon指數(shù)值進(jìn)行平均。G采樣點(diǎn)為4.085,B采樣點(diǎn)為4.358,T采樣點(diǎn)為4.622，由此可知,Shannon指數(shù)平均數(shù)G點(diǎn)＜B點(diǎn)＜T點(diǎn)（Shannon指數(shù)遞增約為0.3），即上游〈中游〈下游，說明細(xì)菌多樣性上游水體最小，中游次之，下游水體細(xì)菌多樣性最高；上層為4.360,中層為4.450,下層為4.268,Shannon指數(shù)差異較?。⊿hannon指數(shù)遞增約為0.1）,說明不同水層的細(xì)菌多樣性差異不明顯。表2樣品微生物群落.多樣性Table2Microbial.-diversityofsamples樣品有效序列數(shù)OTU數(shù)目CoverageShannon指數(shù)Simpson指數(shù)Cha。指數(shù)Gu5843614700.98824.2540.046932497.5Gm6079616740.98714.0750.053902777.0Gd5449616320.98583.9260.089562772.3Bu7716717320.98914.1590.048473091.3Bm4894016940.98464.6800.029342672.9Bd6163418090.98634.2360.045853008.0Tu6542215980.98974.6320.025542415.2Tm4396613840.98544.5940.028682394.4Td5938816300.98754.6410.024862723.9（四）微生物組成分析測序結(jié)果經(jīng)與16SRNA基因數(shù)據(jù)庫比對、分類注釋后，從9個水樣中鑒定出細(xì)菌門23個,細(xì)菌屬263個。樣品共有細(xì)菌門13個，共有細(xì)菌屬107個，各樣品中所包含的門屬個數(shù)如圖4所示。n個數(shù)屬個數(shù) 級性（屬個數(shù)）圖4樣品門屬個數(shù)柱狀圖Fig.4Bargraphonnumbersofphylumandgenusinthesesamples由圖4可知，三個采樣點(diǎn)的細(xì)菌種類無論從門的層面還是屬的層面上來看，均呈現(xiàn)細(xì)菌種類數(shù)量G點(diǎn)＜B點(diǎn)＜T點(diǎn)的情況，推測是由于隨著水流方向的運(yùn)動，水體細(xì)菌種類向下游不斷累積，以及各水道交匯處水源的不斷匯入，導(dǎo)致微生物種類數(shù)上游＜中游＜下游％各采樣點(diǎn)的不同水層中微生物種類數(shù)無明顯變化趨勢％地理位置仍然是影響水體中細(xì)菌種類數(shù)量的關(guān)鍵，與2.21中Shannon指數(shù)所顯示的各采樣點(diǎn)細(xì)菌多樣性結(jié)果相符，下游細(xì)菌種類數(shù)量最多，細(xì)菌多樣性最高%對水樣中細(xì)菌屬數(shù)目進(jìn)行韋恩圖分析，結(jié)果如圖5所示％由圖5可知，在所有鑒定出的263個細(xì)菌屬中，各水樣內(nèi)存在共有細(xì)菌屬107個，即萬峰湖水體的核心細(xì)菌屬，占所有細(xì)菌屬個數(shù)的40.68%，說明萬峰湖水體不同的地理位置和水層水體中細(xì)菌種類有40.68%相同％各樣品中存在的特有細(xì)菌屬數(shù)目如下:Gu中特有屬4個、Gm中特有屬0個、Gd中特有屬7個，Bu中特有屬5個、Bm中特有屬9個、Bd中特有屬3個,Tm中特有屬7個、Tm中特有屬14個、Td中特有屬11個％Fig.5Venndiagramofgenusnumbersinthesesamples根據(jù)采樣地點(diǎn)以及采樣水層對水樣進(jìn)行分組,并制作韋恩圖，各組細(xì)菌組成相似性和重疊情況如圖6、圖7%number圖number圖6屬個數(shù)韋恩圖Fig.6Venndiagramofgenus如圖6所示，上中下游存在共有細(xì)菌屬160個，占比為60.83%；三個水層深度存在共有微生物屬176個，占比為66.92%%說明萬峰湖水體細(xì)菌種類在各地理位置水體中的相似性為60.83%，不同水層水體的相似性為66.92%%仍可看出地理位置對水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響大于水層％種屬特異性方面,G采樣點(diǎn)存在特有細(xì)菌屬11個,B采樣點(diǎn)存在特有細(xì)菌屬18個,T采樣點(diǎn)存在特有細(xì)菌屬30個,即上游特異性＜中游特異性＜下游特異性％上層存在特有細(xì)菌屬17個，中層存在特有細(xì)菌屬14個,下層存在特有細(xì)菌屬23個，即中層特異性＜上層特異性＜下層特異性％根據(jù)各水樣所鑒定出的細(xì)菌屬，選取相對豐度前48位的屬制作柱狀圖，結(jié)果見圖8%不同顏色表示不同的屬,柱狀長度表示相對豐度,可以看出各組樣品中高豐度細(xì)菌組成基本一致，尤其是相同采樣點(diǎn)的三個不同深度水層的樣品各屬豐度差異性較小，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)水平相似，該結(jié)果與前文的聚類分析額主成分分析結(jié)果一致％Fig.7Abundancehistogramongenuslevel在屬水平根據(jù)各樣品中細(xì)菌的相對豐度，篩選出各樣品中相對豐度72.0%的優(yōu)勢屬，結(jié)果如表3所示％表3樣品優(yōu)勢微生物屬統(tǒng)計表Table3Statisticaltableondominantgenera樣品優(yōu)勢微生物GuLimnohabitans、Ilumatobactee、Rhodobactee、CandidatusPelagibacter、Rhodoluna、Terracoccus&Aciditerrimonas&GmLimnohabitans、Ilumatobactee、Rhodobactee、CandidatusPelagibacter、Rhodoluna、Terracoccus&Aciditerrimonas&GdLimnohabitans、Ilumatobacter、Rhodobacter、CandidatusPelagibacter、Rhodoluna、Terracoccus&Aciditerrimonas&BuLimnohabitans、Ilumatobacter、Rhodobacter、Rhodoluna、Terracoccus、AciditerrimonasBmLimnohabitans、Ilumatobacter、Rhodobacter、CandidatusPelagibacter、Rhodoluna、TerracoccusGemmobacter-^BdLimnohabitans、Ilumatobacter、Rhodobacter、CandidatusPelagibacter、Rhodoluna、Terracoccus、Gemmobacter&FlavobacteriumTuLimnohabitans、Ilumatobacter、Rhodobacter、CandidatusPelagibacter、Rhodoluna、Terracoccus、Ornithinibacter、Algoriphagus、FluviicolaTmLimnohabitans、Ilumatobacter、CandidatusPelagibacter、Rhodoluna、Terracoccus、Ornithinibacter、GemmobacterTdLimnohabitans、Ilumatobacter、Rhodobacter、CandidatusPelagibacter、Rhodoluna、Terracoccus、Ornithinibacter、Algoriphagus、Gemmobacter經(jīng)統(tǒng)計，各水樣中共有優(yōu)勢細(xì)菌屬為:Limno-habitan&Ilumatobacter&Rhodoluna、Terracoccus四個屬%Limnohabitans由HahnMW等研究者于2