植物快速繁殖技術(shù)實驗指導

植物快速繁殖技術(shù)實驗指導植物快速繁殖技術(shù)實驗指導植物快速繁殖技術(shù)實驗指導xxx公司植物快速繁殖技術(shù)實驗指導文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準審核制定方案設(shè)計，管理制度《植物快速繁殖技術(shù)》實驗指導李國平編生態(tài)與資源工程系2014年1月8日目錄TOC\o"1-3"\p""\h\z\u前言III學生實驗守則IV實驗一觀賞植物種子無菌萌發(fā)與試管開花技術(shù)1實驗二金線蓮的快速繁殖技術(shù)3實驗三鐵皮石斛的快速繁殖技術(shù)5實驗四一種植物的組織培養(yǎng)與快速繁殖8前言植物組織培養(yǎng)即植物無菌培養(yǎng)技術(shù)，又稱離體培養(yǎng)，是根據(jù)植物細胞具有全能性的理論，利用植物體離體的器官(如根、莖、葉、莖尖、花、果實等）、組織（如形成層、表皮、皮層、髓部細胞、胚乳等）或細胞（如大孢子、小孢子、體細胞等）以及原生質(zhì)體,在無菌和適宜的人工培養(yǎng)基及溫度等人工條件下，能誘導出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的學科。近40年以來，植物組培技術(shù)已滲透到植物生理學、病理學、遺傳學、藥學、育種以及生物化學等各個研究領(lǐng)域，為快速繁育優(yōu)良品種，培育無毒苗木，進行突變篩選培育，藥用植物工廠化生產(chǎn)，種質(zhì)保存和基因庫建立等方面開辟了新途徑，成為生物學科中的重要研究技術(shù)和手段之一。現(xiàn)如今，植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有保持花卉優(yōu)良性狀、培育脫毒苗木、保存種質(zhì)資源等優(yōu)勢，根據(jù)這些優(yōu)勢，植物栽培技術(shù)也被廣泛應用于花卉的種苗繁殖與生產(chǎn)之中。學生實驗守則一、自覺遵守紀律和各項規(guī)章制度，保持室內(nèi)安靜，注意環(huán)境衛(wèi)生，不吸煙、不隨地吐痰、不亂扔紙屑雜物，愛護公務。二、實驗過程中應嚴肅認真，嚴格遵守操作規(guī)程。貴重、精密儀器的使用須在專人指導下進行。三、愛護實驗儀器設(shè)備，厲行節(jié)約。儀器若有損壞，應如實報告，填寫登記表。凡損壞、丟失的儀器設(shè)備，均應查清原因，按儀器設(shè)備損壞、丟失賠償制度處理。四、實驗物品不得隨意翻動，嚴禁攜出室外。若需借用應辦理借物手續(xù)。五、注意實驗室安全，易燃易爆品的操作應遠離火源。六、實驗結(jié)束，由實驗指導教師和管理人員檢查清點儀器設(shè)備，學生應辦好交接手續(xù)，做好清潔衛(wèi)生，及時關(guān)好水電閥門，保持實驗室和儀器的清潔整齊。實驗一觀賞植物種子無菌萌發(fā)與試管開花技術(shù)一、實驗目的掌握利用種子作為外植體進行快速繁殖的方法；掌握試管花卉的培養(yǎng)技術(shù)；了解植物開花的影響因素。二、實驗原理試管開花是指用組織培養(yǎng)的方法，使植物開花的過程在培養(yǎng)容器中完成。一般情況下，植物必須達到某種成熟階段時才能開花。自1946年羅士韋在對菟絲子莖尖培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)了花器官的形成后，植物組織培養(yǎng)技術(shù)已用于植物離體開花的研究。影響試管開花的因素主要有外植體，外源植物激素，營養(yǎng)水平和環(huán)境因素等4個方面。通過改變培養(yǎng)基中外源植物激素、營養(yǎng)水平和培養(yǎng)環(huán)境條件，可以誘導培養(yǎng)物在試管內(nèi)開花。試管花卉作為高新技術(shù)與工藝生產(chǎn)相結(jié)合的新生物,不僅在理論研究上有重要作用,而且可以利用成花決定因素的研究來培養(yǎng)能迅速進入生殖階段的試管苗或有觀賞價值的試管花卉,并將這一技術(shù)直接應用于花卉生產(chǎn)。試管花卉有較大市場前景,目前可以做成試管花卉的植物有石斛蘭、龍角、波露、短葉蘆薈、美麗十二卷、雞冠花、玫瑰、紅蓮、鳳梨、大花蕙蘭、狼牙掌、燕尾蘆薈、非洲紫羅蘭、下城蘆薈、金線蓮、迎春、六月雪、紅葉李、無刺火棘、紫薇、情人草、康乃馨、幸運草、草莓、非洲菊、文心蘭等。三、實驗器具與藥品①器材：電子天平、托盤天平、燒杯（50ml,100ml,500ml,1000ml）、量筒（1000ml,100ml,25ml）、容量瓶（1000ml,500ml,100ml）、藥勺、稱量紙、玻璃棒、滴管、電爐、冰箱、移液槍、pH計、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、鑷子、酒精燈、棉球、三角瓶、培養(yǎng)皿。②試劑：MS培養(yǎng)基各種母液、PP333、KT、6-BA、NAA、IAA、蔗糖、瓊脂、酒精、升汞。=3\*GB3③以矮生雞冠花品系的種子為試材。四、實驗內(nèi)容與操作步驟1、培養(yǎng)基的配制①種子萌發(fā)培養(yǎng)基：ＭＳ基本培養(yǎng)基②增殖培養(yǎng)基：MS+NAA·L-1+6-BA·L-1+蔗糖20g·L-1+瓊脂10g·L-1=3\*GB3③試管開花誘導培養(yǎng)基：MS+PP333·L-1+NAA·L-1+蔗糖20g·L-1+瓊脂10g·L-12、種子滅菌先用洗潔精洗凈種子，用自來水流水沖洗干凈；再用%HgCl2浸泡10min，最后用無菌水反復沖洗5遍。在超凈工作臺上將滅菌后的種子接種到MS培養(yǎng)基上，每三角瓶接種5-10個外植體。培養(yǎng)室條件為：光照12h·d-1、光照強度1500Lx、溫度25～26℃。14d后統(tǒng)計種子發(fā)芽率和污染率。3、增殖培養(yǎng)當無菌苗長到約2cm時，取其中約1cm芽段，接種到②增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)26d后統(tǒng)計其增殖倍數(shù)。4、開花誘導將高約２～３ｃｍ的試管苗，轉(zhuǎn)到=3\*GB3③試管開花誘導培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件：日溫（２５±２）℃，夜溫（２０±２）℃，光照強度１５００～3０００ｌｘ，光照時間１２ｈ／ｄ，接種30d后觀察統(tǒng)計試管內(nèi)開花情況。五、實驗結(jié)果觀察試驗結(jié)果，報告種子發(fā)芽率和污染率、增殖倍數(shù)和試管開花情況。六、思考題：什么是試管花卉有何開發(fā)價值影響試管開花的主要因素有哪些？

實驗二金線蓮的快速繁殖技術(shù)一、實驗目的掌握利用組織培養(yǎng)方法進行金線蓮快速繁殖的技術(shù)；了解影響金線蓮快速繁殖的各種因素。二、實驗原理金線蓮為蘭科開唇蘭屬花葉開唇蘭((Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl.)，又名金線蘭、金絲草。主要種植于我國福建、臺灣、廣東等亞熱帶及熱帶地區(qū)，素有“金草”、“神藥”等美稱。金線蓮喜歡生長在潮濕、陰涼的環(huán)境中，溫度需要控制在20～28℃之間，喜散射光，最忌陽光直射，對環(huán)境的要求比較嚴格。近年來，由于其藥用價值不斷被發(fā)掘，金線蓮人工環(huán)境中的量產(chǎn)也逐步實現(xiàn)。特別是在福建、廣東等華南地區(qū)，應用金線蓮組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)商品金線蓮的模式不斷興起。野生金線蓮自然繁殖是用種子繁殖的，其人工繁育技術(shù)難度較大。應用組培繁殖可大大縮短金線蓮成苗時間，顯著提高培養(yǎng)效率，降低育苗成本，是金線蓮種苗生產(chǎn)的重要方法。三、實驗器具與藥品①器材：電子天平、托盤天平、燒杯（50ml,100ml,500ml,1000ml）、量筒（1000ml,100ml,25ml）、容量瓶（1000ml,500ml,100ml）、藥勺、稱量紙、玻璃棒、滴管、電爐、冰箱、移液槍、pH計、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、鑷子、酒精燈、棉球、三角瓶、培養(yǎng)皿。②試劑：MS培養(yǎng)基各種母液、KT、6-BA、NAA、IAA、蔗糖、瓊脂、酒精、升汞、香蕉汁、活性炭等。=3\*GB3③金線蓮野生種苗或試管苗。四、實驗內(nèi)容與操作步驟1、培養(yǎng)基的配制①莖段誘導培養(yǎng)基：MS+BA+NAA0.5+香蕉汁100g/L②繼代增殖培養(yǎng)基：12MS+BA+NAA+香蕉汁100g/L+AC%;=3\*GB3③生根培養(yǎng)基:12MS+IBA+NAA+AC%2、莖段誘導將帶芽的金線蓮莖段剪成2～3cm長的莖段用自來水沖洗，置飽和漂白粉上清液中浸泡15min，并用軟毛刷輕輕刷洗，沖洗干凈;在自來水下滴沖1～2h，雙蒸水沖洗2～3次，置超凈工作臺用75%酒精消毒30s，0.1%氯化汞溶液消毒10～13min，無菌水沖洗3～5次;取出要接種的材料放在滅過菌的培養(yǎng)皿上，用手術(shù)刀切掉與氯化汞接觸的切口，然后將材料平放在誘導培養(yǎng)基面上進行誘導。每瓶接種帶側(cè)芽的莖段數(shù)5個，每隔一周觀察污染情況和記錄側(cè)芽發(fā)芽狀況，30d后記錄發(fā)芽個數(shù)，并算出側(cè)芽的出芽率。3、叢生芽的增殖培養(yǎng)將誘導產(chǎn)生的高1.0～1.5cm的叢生芽從瓶中取出，切去葉片和基部褐化部分，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中，每瓶接種3-5個不定芽，每隔一周觀察其污染情況及記錄增殖培養(yǎng)過程中叢生芽的增殖狀況，50d后記錄增加的不定芽的個數(shù)，計算增殖倍數(shù)。4、生根培養(yǎng)當叢生芽長至1.5～3.0cm高，2～3片葉時，將其分成單個植株，接入生根培養(yǎng)基中誘導生根。每瓶培養(yǎng)基接種5株，每隔一周觀察其污染情況及記錄叢生芽的生根狀況，30d后記錄生根株數(shù)及每株的生根數(shù)，并計算生根培養(yǎng)基下幼苗的生根率及平均生根數(shù)。五、實驗結(jié)果觀察試驗結(jié)果，報告?zhèn)妊空T導率和污染率、叢生芽增殖倍數(shù)、試管苗生根率及平均生根數(shù)；總結(jié)金線蓮的工廠化育苗技術(shù)。六、思考題：闡述金線蓮的生物學特性、價值和育苗技術(shù)。實驗三鐵皮石斛的快速繁殖技術(shù)一、實驗目的掌握利用組織培養(yǎng)方法進行鐵皮石斛快速繁殖的技術(shù)；了解影響鐵皮石斛快速繁殖的各種因素。二、實驗原理鐵皮石斛（Dendrobiumofficinale）是一種生長緩慢、自然繁殖率很低的蘭科附生植物,具有很高的藥用價值,為傳統(tǒng)名貴中藥,有“救命仙草”、“藥中黃金”之美稱。自然資源將近枯竭,已列入瀕危保護植物。鐵皮石斛種質(zhì)資源的保護和開發(fā)離不開植物組織培養(yǎng)技術(shù),組培工廠化生產(chǎn)是鐵皮石斛種植規(guī)?；幕A(chǔ)。鐵皮石斛目前關(guān)于其組織培養(yǎng)及快速繁殖的研究頗多,用于外植體的有種子、無菌苗幼苗莖段、原球莖及人工種子等;再生植株的獲得途徑主要有種子→原球莖→小植株,種子→原球莖→無菌苗莖段→小植株,種子→愈傷組織→原球莖→小植株等。由于鐵皮石斛組培周期長,如何有效解決快繁中存在的組培苗生產(chǎn)成本高、移栽苗成活率低、標準化生產(chǎn)程度低等問題是維持鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的基石，是開發(fā)利用鐵皮石斛資源的一個重要方面。三、實驗器具與藥品①器材：電子天平、托盤天平、燒杯（50ml,100ml,500ml,1000ml）、量筒（1000ml,100ml,25ml）、容量瓶（1000ml,500ml,100ml）、藥勺、稱量紙、玻璃棒、滴管、電爐、冰箱、移液槍、pH計、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、鑷子、酒精燈、棉球、三角瓶、培養(yǎng)皿。②試劑：MS培養(yǎng)基各種母液、KT、6-BA、NAA、IAA、蔗糖、瓊脂、酒精、升汞、香蕉汁、活性炭等。=3\*GB3③鐵皮石斛野生種苗或試管苗。四、實驗內(nèi)容與操作步驟1、培養(yǎng)基的配制①莖段啟動誘導培養(yǎng)基為:(1)MS+6BAL，單位下同)+NAA+2g/L活性碳；(2)MS+6BA1.0+NAA0.1+2g/L活性碳。②石斛繼代增殖培養(yǎng)基為:(3)3g/L花寶3號+6-BA+NAA+2g/L活性碳；(4)3g/L花寶3號+6-BA2.5+NAA+2g/L活性碳。=3\*GB3③生根培養(yǎng)基為:(5)1/2MS+IBA0.5+2g/L活性碳。以上培養(yǎng)基均加%蔗糖,%瓊脂,~5.4,培養(yǎng)溫度(25±2℃),光照度1500~2000lx,光照時間12h/d。2、無菌材料的處理從植株上切下長2~5cm的幼嫩莖段,在流水下沖洗,用刷子蘸少許洗衣粉水輕輕刷洗,并經(jīng)自來水充分洗凈。在超凈工作臺上將莖段放置在75%的酒精中消毒30s后,再用0.1%的升汞水溶液浸泡8~10min,無菌水沖洗5~6次。3、原球莖的誘導用解剖刀將鐵皮石斛的幼嫩莖段切下,接種在誘導培養(yǎng)基(1)中培養(yǎng)，每瓶接種帶側(cè)芽的莖段數(shù)5個，每隔一周觀察污染情況和記錄原球莖誘導狀況。15~20d后,外植體開始萌動,莖段膨大,切面及頂部組織形成疏松組織。繼續(xù)培養(yǎng)20d后,轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基(2)中,切面及頂部膨大組織的表面形成凹凸不平的顆粒物,隨著培養(yǎng)時間的延長,顆粒物長大形成直徑約1~2mm的原球莖顆粒物，30d后記錄原球莖個數(shù)，并算出原球莖誘導率。4、原球莖的增殖將培養(yǎng)基(2)中形成的原球莖轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)基(3)、(4)中,30d后記錄原球莖個數(shù)，并算出原球莖增殖率。原球莖在培養(yǎng)基(3)、(4)中都有增殖,培養(yǎng)基(4)增殖速度很快,增殖倍數(shù)可達3~4倍,同時,部分原球莖開始分化出芽點并長出1~2片小葉,原球莖的增殖與芽分化同時進行,表明高濃度的激素組合可促進原球莖的增殖與分化。待芽數(shù)量較多時,將高1~2cm、帶有2~3片葉的小芽切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(5)上進行生根培養(yǎng)。5、生根與移栽小苗在生根培養(yǎng)基(5)進行不定根的誘導。培養(yǎng)30d左右,基部開始出現(xiàn)2~3條約1cm長的白色根,隨后逐漸伸長,45d統(tǒng)計生根率當苗高3cm以上、具3~4片葉時,便可出瓶移栽。移栽前,將生根瓶苗打開瓶蓋,移至常溫下煉苗7d,然后,將瓶苗取出,洗去附著在根部的培養(yǎng)基,用0.01%的高錳酸鉀溶液浸泡8~10min,栽種于已滅菌的碎樹皮基質(zhì)中(移栽前澆透水),放置在遮光度50%~60%、濕度達80%以上的溫室中,2個月