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文檔簡介
第一節(jié)核糖體的類型與結構核糖體是細胞內蛋白質合成的細胞器,唯一功能是按mRNA指令由氨基酸合成多肽鏈。核糖體幾乎存在于所有細胞,從原核細胞到真核細胞均含有大量核糖體,線粒體和葉綠體中也含核糖體,僅紅細胞等少數特化細胞中沒有核糖體是一種顆粒狀結構,沒有被膜,主要是核糖體RNA(rRNA),占60%,核糖體蛋白(r蛋白),占40%還有其它功能的核糖核蛋白顆粒,常是小分子RNA(snRNA)與蛋白組成的顆粒,參與RNA的加工、RNA編輯、基因表達調控等.第一頁,共二十七頁。一、核糖體的基本類型與成分1、基本類型(1)70S的核糖體:由50S和30S兩個亞基組成;原核細胞的核糖體,葉綠體和線粒體核糖體也接近70S(2)80S的核糖體:由60S和40S兩個亞基組成大小兩個亞基常游離于細胞質基質中,只有在合成蛋白質時才結合在一起,胎鏈合成完畢后,大小亞基解體,又游離于細胞質中第二頁,共二十七頁。2、核糖體的化學組成核糖體大小亞基都是由rRNA和核糖體蛋白組成(1)原核細胞的70S核糖體中:50S大亞基含33種蛋白質和兩種rRNA:23SrRNA和5SrRNA。30S小亞基含有21種蛋白質和一個16SrRNA(2)真核細胞的80S核糖體中60S大亞基含49種蛋白質及3種rRNA:28SrRNA、5.8SrRNA和5SrRNA。40S小亞基含33種蛋白和一種18SrRNA第三頁,共二十七頁。原核生物與真核生物核糖體成分的比較第四頁,共二十七頁。第五頁,共二十七頁。第六頁,共二十七頁。二、核糖體的結構(一)核糖體結構與功能的分析方法離子交換樹脂可分離純化各種r蛋白;純化的r蛋白與純化的rRNA進行核糖體的重組裝,顯示核糖體中r蛋白與rRNA的結構關系雙向電泳技術可顯示出E.coli核糖體在裝配各階段中,與rRNA結合的蛋白質的類型雙功能的交聯劑和雙向電泳分離可用于研究r蛋白在結構上的相互關系
電鏡負染色與免疫標記技術結合,研究r蛋白在核糖體的亞單位上的定位。70S核糖體小亞基16SrRNA結構及與全部r蛋白關系第七頁,共二十七頁。(二)原核細胞的核糖體結構1、核糖體蛋白E.coli核糖體小亞基含21種蛋白質,分別命名為S1-S21;大亞基含33種蛋白質,分別命名為L1-L332、核糖體rRNAE.coli小亞基含16SrRNA,共有1542個核苷酸,不同來源的16SrRNA的序列組成具保守性。含四個結構域,每個結構域都有46%堿基配對,形成螺旋的柄狀結構。每個柄狀結構都很短,不到8bp,且并不都是完全配對。第八頁,共二十七頁。核糖體小亞單位rRNA的二級結構(a)E.coli16SrRNA;(紅色為高度保守區(qū))(b)酵母菌18SrRNA,它們都具有類似的40個臂環(huán)結構,其長度和位置往往非常保守;P、E分別代表僅在原核或真核細胞中存在的rRNA的二級結構。第九頁,共二十七頁。3、細菌核糖體模型在該模型中確定了一些重要的功能區(qū)。如在小亞基中確定了mRNA和tRNA結合位點,并確定了催化肽鍵形成的位點位于大亞基。確定了小亞基中部突出的平臺部分含有16SrRNA的3‘端,此部位有與mRNA結合的序列。與蛋白質合成起始相關的tRNA、蛋白質因子結合位點位于相鄰小葉中。大亞基還具有催化肽鍵形成和GTP水解的功能區(qū)。第十頁,共二十七頁。E.coli(a)核糖體小亞單位中的部分r蛋白與rRNA的結合位點)(b)及其在小亞單位上的部位第十一頁,共二十七頁。(三)核糖體的裝配1、rRNA的轉錄與加工(1)真核生物:18S、5.8S和28S基因是串聯在一起,每個基因被間隔區(qū)隔開。該基因在RNA聚合酶Ⅰ作用下,首先轉錄成一個45S的前rRNA,然后被加工成41S前rRNA,再被切割成20S前rRNA和32S前rRNA,20SrRNA加工為成熟的18SrRNA,32SrRNA加工為28S和5.8SrRNA5SrRNA基因位于不同染色體上,由RNA聚合酶Ⅲ轉錄,僅進行簡單加工或不加工第十二頁,共二十七頁。(2)原核生物:細菌中5SrRNA基因與16S和23S組成一個轉錄單位:16S-23S-5S在RNA聚合酶的作用下,轉錄單位轉錄成一個rRNA前體,經核酸酶Ⅲ的切割,生成16S、23S和5.8S的前體,經其它酶進一步加工生成成熟的三種rRNA。第十三頁,共二十七頁。2、核糖體的裝配核糖體是自我裝配的細胞器,當r蛋白和rRNA合成加工完成后即開始裝配大小亞基。在原核生物小亞基裝配時,一些蛋白能獨立地與16SrRNA結合,裝配成的中間體為其它蛋白的結合提供位點。在真核生物,45SrRNA、5SrRNA與蛋白結合形成80S顆粒,隨后降解成兩種顆粒,大顆粒含32S和5SrRNA,小顆粒含20SrRNA。小顆粒中20SrRNA降解成18SrRNA,大顆粒中的32SrRNA被加工成28S和5.8SrRNA,并與5S裝配成大亞基第十四頁,共二十七頁。E.coli核糖體小亞單位中rRNA與r蛋白的相互關系示意圖線條表示相互作用及作用力的強(粗線)與弱(細線)
第十五頁,共二十七頁。三、核糖體的功能-蛋白質的合成在核糖體上合成的蛋白質的一級結構,即多肽鏈。合成是從多肽鏈的N端開始,到C端結束。對于mRNA,合成的方向是5’-3’,蛋白質的合成涉及核糖體的一些功能位點和RNA作用第十六頁,共二十七頁。(一)核糖體的功能位點原核生物有4種與RNA結合的位點,一個是與mRNA,另3個是與tRNA結合位點A位點:氨?;稽c,是新摻入氨酰tRNA結合的位點,主要位于大亞基;B位點:肽酰tRNA位點,位于大亞基P位點:脫氨酰tRNA結合位點;mRNA結合位點:位于小亞基,原核生物位于16SrRNA的3’端,mRNA中與16SrRNA結合的序列稱SD序列,位于起始密碼AUG上游5-10個堿基。真核生物主要依賴5’端甲基化帽結構第十七頁,共二十七頁。第十八頁,共二十七頁。(二)蛋白質合成的基本過程1、鏈的起始:(1)30S亞基與mRNA的結合:在原核生物,mRNA依靠SD序列只和游離的30S小亞基結合;真核生物,小亞基識別mRNA5’端甲基化帽結構,然后沿mRNA滑動,直到遇到識別序列,典型的識別序列為5’-CCACCAUGC-3’,含AUG小亞基與mRNA結合還需要起始因子(initiationfactor,IF)的幫助.原核生物命名為IF,有IF1,IF2和IF3,IF3幫助mRNA與核糖體結合;真核生物為eIF,至少有10個,eIF4幫助mRNA與核糖體結合.第十九頁,共二十七頁。(2)第一個氨酰tRNA進入核糖體:攜帶甲酰甲硫氨酸的tRNA同GTP、IF2結合,形成GTP-IF2-tRNAfMet復合物,然后通過反密碼子與mRNA中AUG識別進入核糖體.(3)完整起始復合物裝配:tRNA與AUG結合后,大亞基加入,形成完整的核糖體-mRNA起始復合物,該過程伴有GTP水解,IF1、IF2和IF3釋放,fMet占據P位點2、多肽鏈的延伸:復合物形成后蛋白質合成開始。延伸涉及4個重復的步驟,這4個步驟的循環(huán),使肽鏈不斷延長第二十頁,共二十七頁。①氨酰tRNA進入A位點:第二個氨酰tRNA與GTP及延伸因子EF-Tu結合,密碼子相配的tRNA進入A位點,GTP水解,EF-Tu-GDP釋放②肽鍵形成(延伸第二步):當P位和A位點都被tRNA占據后,在肽酰轉移酶催化2個aa形成肽鍵,P位點tRNA卸去氨基酸,A位點tRNA形成二肽③轉位(延伸第二步):第一個肽鍵形成后,核糖體沿著mRNA從5’→3’移動3個核苷酸,此時,A位點tRNA-二肽移到P位點,P位點tRNA進入E位點.移位需結合有GTP的移位酶EF-G參與④脫氨酰tRNA釋放:脫氨酰tRNA離開核糖體E位延伸反應,每次循環(huán)消耗2個GTP,耗時0.05s.第二十一頁,共二十七頁。3、蛋白質合成的終止:核糖體沿mRNA移動,當進入A位點的是終止密碼子UAA、UAG、UGA,由于沒有與之配對的反密碼子,蛋白質合成終止。該過程需要釋放因子(releasefactor,RF),細菌有3種RF,RF1識別UAA和UAG,RF2識別UAA和UGA,RF3能增加其它因子活性。RF與A位點的結合,活化了肽鏈轉移酶,水解P位的多肽與tRNA之間的連接,多肽鏈離開核糖體第二十二頁,共二十七頁。蛋白質的合成第二十三頁,共二十七頁。(三)多聚核糖體(polyribosome)在蛋白質合成時,同一條mRNA能同多個核糖體結合,同時合成多條肽鏈,結合在同一條mRNA上的核糖體稱多聚核糖體。在蛋白質合成過程中,核糖體不斷向mRNA的3’端移動。當第一個核糖體離開起始密碼子后,空出的位置能與另一核糖體結合,并合成蛋白質多聚核糖體中,每個核糖體相隔約80個核苷酸這種蛋白質合成方式,大大提高了合成效率,也減輕了細胞核進行基因轉錄和加工的壓力第二十四頁,共二十七頁。多聚核糖體第二十五頁,共二十七頁。(四)蛋白質合成抑制劑是研究蛋白質合成機制有用的工具1、抗生素(antibiotic):是主要的蛋白質合成抑制劑,不同抗生素作用機制不同,如鏈霉素主要是抑制tRNA與核糖體的結合,導致肽鏈合成提前中止。鏈霉素還可引起密碼子錯讀。2、嘌呤毒素(puromycin):它具有與tRNA分子末端類似的結構,能同氨基酸結合,代替氨?;膖RNA同A位點結合,并摻入到生長的肽鏈中。但不能參與隨后的反應,導致蛋白質合成的終止并釋放出C端含有嘌呤毒素的不成熟的多肽。通過嘌呤毒素抑制作用發(fā)現P和A位點是獨立第二十六頁,共二十七頁。四、核酶Cech1981在研究四膜蟲核糖體大亞基26S前rRNA加工去除內含子時發(fā)現:在沒有任何蛋白質參與下,26S前rRNA進行自我加工切除了前體分子中的內含子,產生成熟的rRNA。這種現象稱自剪接(self
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