生物技術(shù)常用技術(shù)技術(shù)及應(yīng)用

關(guān)于生物技術(shù)常用技術(shù)技術(shù)及應(yīng)用第1頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五一、PCR的用途體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，能快速、特異地?cái)U(kuò)增目的DNA片段。能通過(guò)試管內(nèi)的數(shù)小時(shí)反應(yīng)將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍。迅速獲取大量的單一核酸片段，為分子生物學(xué)研究提供了強(qiáng)大的工具。第2頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五1953年，Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模型。1958年，Meselson和Stahl用實(shí)驗(yàn)證實(shí)DNA半保留復(fù)制模型。70年代以來(lái)，人們采用兩種思路去嘗試建立基因的無(wú)性繁殖體系，一是基因克隆技術(shù)，二是體外擴(kuò)增技術(shù)。二、發(fā)展歷程第3頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五1971年，Khorana（美國(guó)MIT教授，1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主）：“經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因。”核酸體外擴(kuò)增最早設(shè)想被遺忘原因:（1）很難進(jìn)行測(cè)序和合成寡核苷酸引物；（2）1970年Smith等發(fā)現(xiàn)了II型限制性?xún)?nèi)切酶，體外克隆基因已成為可能。第4頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五1976年，臺(tái)籍科學(xué)家錢(qián)嘉韻（AliceChien）從黃石國(guó)家公園的嗜熱菌Thermusaquaticus中分離出熱穩(wěn)定的TaqDNA聚合酶。1985年，美國(guó)Cetus公司人類(lèi)遺傳研究室的Mullis發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR），Saiki等首次應(yīng)用PCR法成功地?cái)U(kuò)增了人-珠蛋白的DNA，并應(yīng)用于鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的產(chǎn)前診斷。第5頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五1988年Saiki開(kāi)始將耐熱性TaqDNA聚合酶應(yīng)用于PCR，整個(gè)反應(yīng)只加一次酶即可，擴(kuò)增特異性和效率都明顯改善，操作大為簡(jiǎn)化。1989年被譽(yù)為“分子年”，列PCR為十余項(xiàng)發(fā)明之首。1993年，Mullis榮獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

KaryMullis1993第6頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五三、PCR的基本原理試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，依據(jù)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復(fù)性的性質(zhì)；通過(guò)人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度，使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。第7頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五待擴(kuò)增片段第8頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五第9頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五高溫變性第10頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五低溫退火第11頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五中溫延伸第12頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五第13頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五第14頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五第15頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五第16頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五第17頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五第18頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五第19頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五第20頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五第21頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五PCR每一步的轉(zhuǎn)換通過(guò)溫度的改變控制。DNA模板解鏈（變性）、引物與模板結(jié)合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三個(gè)步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個(gè)循環(huán)。此循環(huán)反復(fù)進(jìn)行，可使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。第22頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五理論擴(kuò)增率：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），25～30循環(huán)，目標(biāo)DNA可增加109倍。實(shí)際擴(kuò)增率：(１＋Ｘ)n，X為PCR的實(shí)際擴(kuò)增率，平均約為75%。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€(xiàn)性形式，所以實(shí)際上進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)一般可達(dá)106～107。以上“變性、退火、延伸”三部曲為PCR一輪循環(huán)。第23頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)第24頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五必須的儀器設(shè)備第25頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五四、PCR反應(yīng)體系與流程反應(yīng)體系模板（DNA或RNA）引物TaqDNA聚合酶10×PCR緩沖液1.5～4

mM

Mg2+0.2

mM

dNTP反應(yīng)流程預(yù)變性變性退火延伸延伸完全終止25～35循環(huán)第26頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五（一）PCR的反應(yīng)體系引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP模板（template）Mg2+（magnesium）第27頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五1、引物引物：決定PCR反應(yīng)的特異性PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增第28頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五基本原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性，同時(shí)盡可能抑制非特異性擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)的原則第29頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五①引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用20bp左右—引物的有效長(zhǎng)度不能大于38bp，否則最適延伸溫度會(huì)超過(guò)TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃），不能保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性②引物擴(kuò)增跨度：以500bp為宜—特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段第30頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜

—G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶

—ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C，因?yàn)檫@樣會(huì)使引物在G+C富集區(qū)引發(fā)錯(cuò)誤延伸④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物間互補(bǔ)

—特別避免3’端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增條帶第31頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五第32頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五⑤引物3’端的堿基要求嚴(yán)格配對(duì)（不能做任何修飾）—特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失?、抟?′端可修飾

—引物5′端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，但對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大；引物5′端堿基可不與模板DNA

互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)；引物5′端最多可加10個(gè)堿基而對(duì)PCR反應(yīng)無(wú)影響

第33頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五3’5’3’5’限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列啟動(dòng)子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記第34頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五⑦引物的特異性：—引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性⑧引物量：—每條引物的濃度0.1~0.5μM，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好—引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)第35頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五2、酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從水生嗜熱桿菌中提純基因工程酶：大腸桿菌合成一個(gè)典型的PCR反應(yīng)約需酶量1-2.5U/100ul體系濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少第36頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五DNA聚合酶

Klenow片段

T4DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶（應(yīng)用最廣）其他DNA聚合酶：TthDNA聚合酶

VentDNA聚合酶

PfuDNA聚合酶等第37頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五Taq酶的保真性不高5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，無(wú)3’→5’外切活性;在PCR反應(yīng)中如發(fā)生某些堿基的錯(cuò)配，該酶是沒(méi)有校正功能的。保真性不如PfuDNA聚合酶等。第38頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五3、dNTP的質(zhì)量與濃度在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200μM，濃度過(guò)低會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制）,如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配高濃度的dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性

第39頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五4、模板DNA模板DNA的來(lái)源：

—微生物中提取DNA—從細(xì)胞中提取DNA：血細(xì)胞、絨毛、尿樣、毛發(fā)、精斑、口腔上皮細(xì)胞

—固定和包埋的組織標(biāo)本：脫蠟、蛋白酶K消化模板DNA的濃度：0.1～2ug/100ul體系

—PCR產(chǎn)量隨模板DNA濃度的增加而顯著升高

—模板DNA濃度過(guò)高導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增加

第40頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五5、Mg2+濃度Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少第41頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五PCRAgarosegelelectrophoresis產(chǎn)物分析UV檢測(cè)3-4hours（二）、PCR的反應(yīng)流程第42頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五溫度與時(shí)間的設(shè)置循環(huán)次數(shù)常見(jiàn)問(wèn)題第43頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五1、溫度與時(shí)間的設(shè)置設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃退火，然后快速升溫至70～75℃延伸，對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度100～300bp）可采用二溫度點(diǎn)法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸。第44頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五①變性溫度與時(shí)間：一般93℃～94℃，1min足以使模板變性若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。第45頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五②退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的重要因素退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基因序列的長(zhǎng)度對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃作為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想第46頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五引物的復(fù)性溫度

通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm（解鏈溫度）＝4(G+C)+2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值－（5～10℃）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性復(fù)性時(shí)間一般為30～60s，足以使引物與模板之間完全結(jié)合第47頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五③延伸溫度與時(shí)間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行第48頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五③延伸溫度與時(shí)間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定1Kb以?xún)?nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴(kuò)增10kb需延伸至15min延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些第49頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五2、循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度循環(huán)次數(shù)：選在30～40次之間循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多第50頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五如何提高PCR中的DNA聚合酶的保真性？在PCR反應(yīng)體系中，除使用TaqDNA聚合酶，摻入少量的具有3′→5′外切酶活性的耐熱DNA聚合酶，如Pfu，Vent，Pwo等，錯(cuò)配率可降為原來(lái)的1/10；Mg2+濃度盡可能低，但不影響DNA合成；減少高溫反應(yīng)時(shí)間，這樣DNA熱損傷將減少；減少循環(huán)數(shù)。第51頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五如何提高PCR擴(kuò)增的特異性？升高退火溫度可增加引物與模板結(jié)合的特異性；縮短退火和延伸時(shí)間，可減少錯(cuò)誤引發(fā)及多余的DNA聚合酶分子參與酶促延伸的機(jī)會(huì)；降低引物和酶的濃度也可以減少錯(cuò)誤引發(fā)，尤其是能減少引物二聚體的引發(fā)；改變Mg2+的濃度可進(jìn)一步提高擴(kuò)增的特異性。第52頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五引物設(shè)計(jì)的特異性；減少循環(huán)次數(shù)；熱啟動(dòng)（HotStart）。即首先將模板變性，然后在較高溫度時(shí)加入TaqDNA聚合酶、引物及MgCl2等一些重要成分，這樣使得引物在較高溫度下與模板退火，提高了反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性，使擴(kuò)增更特異；采用二對(duì)引物即外引物和內(nèi)引物進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)提高擴(kuò)增的特異性。第53頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五（三）、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法

凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法（PCR-RFLP）單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SSCP）核酸探針雜交法PCR產(chǎn)物測(cè)序PCR-OLA（PCR-oligonucleotideligationassay)熒光PCR

第54頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五1.瓊脂糖凝膠電泳

制膠加樣電泳紫外光檢測(cè)第55頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五特點(diǎn)：分辨力高，長(zhǎng)度僅相差1bp的DNA分子即可分開(kāi)；上樣量遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠；回收的DNA純度高；采用銀染色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱點(diǎn)。用途：PCR擴(kuò)增指紋圖、多重PCR、PCR產(chǎn)物限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析。2.聚丙烯酰胺凝膠電泳第56頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五3.PCR-RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)

據(jù)目的基因序列可查出所包含的酶切位點(diǎn)，用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后進(jìn)行電泳，觀(guān)察消化片段的大小是否與序列資料相符。用途：傳染病病原體基因分型人類(lèi)基因的變異性研究。第57頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五4.單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法

（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism,PCR-SSCP）

將PCR產(chǎn)物雙鏈DNA（dsDNA）變性為單鏈DNA（ssDNA），加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，由于DNA分子在凝膠中的電泳遷移率與其分子量和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，而空間結(jié)構(gòu)又與ssDNA序列有關(guān)。因此，電泳結(jié)束后，ssDNA帶位置的差異即可反映出PCR產(chǎn)物序列的差異。第58頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五

5.核酸探針雜交法

點(diǎn)雜交反向點(diǎn)雜交微孔板雜交Southern印跡雜交第59頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五

①點(diǎn)雜交（dotblot）原理：將擴(kuò)增產(chǎn)物變性后直接點(diǎn)在尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的寡核苷酸探針與之雜交。探針：放射性同位素標(biāo)記探針檢測(cè)的敏感、特異，具有不穩(wěn)定性和放射性危害。非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛、熒光素等）標(biāo)記的探針?lè)€(wěn)定性高、使用安全、檢測(cè)速度快用途：主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。第60頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五

②反向點(diǎn)雜交(reversedotblot)原理：使用帶有標(biāo)記物的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性。將不同的寡核酸探針固定在尼龍膜上，用變性的PCR產(chǎn)物與之雜交。探針：嚴(yán)格設(shè)計(jì)，具有相同的雜交反應(yīng)條件。用途：反向點(diǎn)雜交特別適用于遺傳性疾病多個(gè)位點(diǎn)的點(diǎn)突變分析。結(jié)果分析：正常純合子突變純合子雜合子第61頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五

③微孔板雜交(microplatehybridization)

夾心雜交第62頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五

④熒光探針雜交法

目前臨床上常用熒光探針?lè)▉?lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，主要的方法有TaqMan技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)、復(fù)合探針?lè)ǖ取＃ǘ縋CR詳述）。第63頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五

⑤Southern印跡雜交(Southernblot)

第64頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五

6.PCR-ELISA引物雙標(biāo)記：生物素/地高辛、熒光素引物5’端標(biāo)記生物素+RNA探針標(biāo)記地高辛將一寡核酸探針固定于微孔板作為捕獲探針，變性的PCR產(chǎn)物單鏈的某一區(qū)域與之雜交后，此單鏈間接地固定于微孔板上。再用一非放射性標(biāo)記物標(biāo)記（如生物素）的檢測(cè)探針與固定于微孔板的PCR產(chǎn)物單鏈的另一區(qū)域雜交。第65頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五7.PCR產(chǎn)物測(cè)序

方法：雙脫氧核苷酸鏈末端終止法化學(xué)裂解法用途：目前一般多用于科研第66頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五五、PCR常見(jiàn)問(wèn)題無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物非特異性擴(kuò)增拖尾假陽(yáng)性第67頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五PCR常見(jiàn)問(wèn)題之一無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物模板:含有抑制物，含量低Buffer對(duì)樣品不合適引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短

原因?qū)Σ呒兓０寤蛘呤褂迷噭┖刑崛∧０錎NA或加大模板的用量更換Buffer或調(diào)整濃度重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間現(xiàn)象：正對(duì)照(marker?)有條帶，而樣品則無(wú)；第68頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五PCR常見(jiàn)問(wèn)題之二

非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。第69頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五PCR常見(jiàn)問(wèn)題之二引物特異性差模板或引物濃度過(guò)高酶量過(guò)多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過(guò)多

原因?qū)Σ咧匦略O(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)

非特異性擴(kuò)增第70頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五PCR常見(jiàn)問(wèn)題之三

拖尾(與非特異性擴(kuò)增條帶明顯不同，非特異性擴(kuò)增帶有明顯的條帶分隔。)現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。

M12第71頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五PCR常見(jiàn)問(wèn)題之三模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過(guò)多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過(guò)多

原因?qū)Σ呒兓０甯鼡QBuffer適當(dāng)提高退火溫度適量用酶適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)

拖尾第72頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五PCR常見(jiàn)問(wèn)題之四

假陽(yáng)性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測(cè)基因表達(dá)情況)原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染打開(kāi)標(biāo)本管蓋時(shí)樣品飛濺，造成樣品間相互污染。使用帶有污染的試劑。公用試劑如液體石蠟等污染。操作時(shí)手套引起的交叉污染。加樣器通道易形成氣溶膠，氣溶膠常帶有PCR產(chǎn)物污染，可用有濾篩的吸頭避免此類(lèi)污染。實(shí)驗(yàn)室污染。

現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物第73頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五

對(duì)策：PCR前后工序分室操作，試劑器材分室存放低溫貯存。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，凡耐高溫的試劑器材均高壓滅菌。Tip頭、Eppendorf管等最好一次性使用。操作人員必須戴手套進(jìn)行操作。試劑小量分裝保存，用前先離心，操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外防止開(kāi)蓋時(shí)液體濺出。第74頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五引物二聚體

兩個(gè)相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對(duì)，特別是引物3’端有互補(bǔ)區(qū)。引物模板比例太高，可增加模板用量。退火溫度過(guò)低。熱循環(huán)次數(shù)過(guò)多。PCR常見(jiàn)問(wèn)題之五第75頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五9.7PCR技術(shù)的發(fā)展

巢式PCR（nestedPCR）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）多重PCR(multiplexPCR)重組PCR(recombinantPCR)錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）不對(duì)稱(chēng)PCR（asymmetricPCR）反向PCR（inversePCR）擴(kuò)增長(zhǎng)片段PCR（longPCR，long-distancePCR）免疫PCR(immuno-PCR)定量PCR六、PCR技術(shù)的主要類(lèi)型第76頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五（1）巢式PCR（nestedPCR）第77頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五（2）逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR（reversetranscription-PCR）原理：先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下、以mRNA為模板合成互補(bǔ)的cDNA（complementaryDNA），再以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。是一種快速、簡(jiǎn)便、敏感性極高的檢測(cè)mRNA表達(dá)的方法。第78頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五逆轉(zhuǎn)錄酶：AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為42℃）和MoMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為37℃）逆轉(zhuǎn)錄引物：①隨機(jī)引物；②Oligo(dT)；③特異性引物。one-stepRT-PCR：在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物、TaqDNA聚合酶、PCR引物、dNTP和緩沖液，直接以mRNA

為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，稱(chēng)為一步法RT-PCR。第79頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五（3）多重PCR(multiplexPCR)

第80頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五（4）重組PCR(recombinantPCR)第81頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五（5）錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）

基本原理：抽提細(xì)胞總RNA或mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，通過(guò)DNA末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA3’端加上poly(dG)尾。據(jù)此設(shè)計(jì)錨定引物poly(dC)，為提高擴(kuò)增特異性，poly(dC)在十二聚以上，錨定引物5’端可加上某些限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列或其它序列信息。根據(jù)已知的3’端序列設(shè)計(jì)基因特異性引物，與錨定引物一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用途：檢測(cè)T細(xì)胞受體和免疫球蛋白基因的多態(tài)性。第82頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五（6）不對(duì)稱(chēng)PCR（asymmetricPCR）

基本原理：采用兩條不同濃度的引物，即非限制引物(高濃度引物)與限制性引物(低濃度引物)，二者之比為50-100：1。在PCR最初10-15個(gè)循環(huán)中，擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA(dsDNA)；第15個(gè)循環(huán)以后，限制性引物已被耗盡，非限制性引物介導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA(ssDNA)。關(guān)鍵：控制限制性引物的絕對(duì)量，需多次摸索優(yōu)化兩條引物的比例。也有人先用等濃度的引物PCR擴(kuò)增，制備雙鏈DNA；然后以雙鏈DNA為模板，再以其中的一條引物進(jìn)行第二次PCR，制備單鏈DNA。第83頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五（7）反向PCR（reversePCR）反向PCR用于快速擴(kuò)增已知序列以外的未知DNA片段，從而對(duì)未知序進(jìn)行分析研究。該法首先用已知序列和待擴(kuò)增序列都沒(méi)有切點(diǎn)的限制性核酸內(nèi)切酶將模板DNA消化，再用連接酶使酶切產(chǎn)物環(huán)化，使已知的和待擴(kuò)增的未知序列都包含在環(huán)中。在已知序列內(nèi)設(shè)計(jì)一對(duì)反向的引物，即可擴(kuò)增已知序列以外的區(qū)域。第84頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五反向PCR已知序列PCR用途：未知序列的研究限制酶切點(diǎn)（X）限制酶切點(diǎn)（X）限制酶X酶切連接未知序列第85頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五（8）擴(kuò)增長(zhǎng)片段PCR（longPCR）

模板完整性：應(yīng)用瓊脂糖包埋細(xì)胞抽提法模板DNA。引物：一般較長(zhǎng)（22-35nt），Tm值較大。DNA聚合酶：長(zhǎng)片段PCR應(yīng)采用錯(cuò)配率低的耐熱DNA聚合酶：如AmpliTaq、rTth、HotTube、Vent、DeenVent、Pfu、rTma等。Vent、DeenVent、Pfu、rTma等聚合酶有3’-5’外切酶活性。PCR緩沖液：增加Tris的濃度或改用Tricine緩沖液以增強(qiáng)緩沖能力，并使緩沖液pH適度升高，以補(bǔ)償升溫時(shí)pH值的降低。此外，加入適量的甘油、DMSO（二甲亞砜）、明膠、聚乙二醇、Tween20等物質(zhì)，有助于模板變性和維持DNA聚合酶的穩(wěn)定。熱循環(huán)：增加延伸時(shí)間（一般1kb/min），提高退火溫度，同時(shí)采用熱啟動(dòng)。熱循環(huán)后期，更應(yīng)適當(dāng)增加延伸時(shí)間，以保證產(chǎn)物充分延伸。第86頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五（9）免疫PCR(immuno-PCR)第87頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五（10）原位PCR（insituPCR）

直接法：使用標(biāo)記（放射性同位素、生物素、地高辛、熒光素等）的引物或脫氧三磷酸核苷酸（如dUTP）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，則標(biāo)記物摻入到PCR產(chǎn)物中。最后用放射自顯影、免疫組化或熒光法檢測(cè)PCR產(chǎn)物及其在細(xì)胞內(nèi)位置。間接法：先進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNA的原位擴(kuò)增，然后用標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行原位雜交。原位逆轉(zhuǎn)錄PCR（insitureversetransciptionPCR）第88頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五第89頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五（11）定量RT-PCR（qRT-PCR）：利用RT-PCR對(duì)mRNA水平進(jìn)行半定量或絕對(duì)定量分析。第90頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五半定量RT-PCR選用在組織中普遍表達(dá)、表達(dá)量比較恒定的管家基因mRNA作為內(nèi)源性基因模板標(biāo)準(zhǔn)。管家基因mRNA和目的mRNA混合物共同進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在各自的引物引導(dǎo)下擴(kuò)增。計(jì)算出擴(kuò)增后目的基因擴(kuò)增子/管家基因擴(kuò)增子的比值，從而達(dá)到半定量的目的。第91頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)定量PCR技術(shù)：

—對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量

—重復(fù)性差

—半定量實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量

第92頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。第93頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五（1）Ct值是熒光定量PCR的一個(gè)重要的概念，C代表Cycle，t代表threshold域值。含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。第94頁(yè)，共108頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期五（2）熒光域值（threshold）的設(shè)定PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)熒光域值是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle3-15第95