高分辨活細胞成像技術(shù)交流

高分辨活細胞成像技術(shù)交流1主要內(nèi)容高分辨活細胞實驗的要求高分辨活細胞成像技術(shù)的種類以及介紹DeltaVisionElite高分辨成像系統(tǒng)在植物領(lǐng)域的應(yīng)用2現(xiàn)有的顯微鏡技術(shù)3科學(xué)影像技術(shù)的三個基本參數(shù)空間分辨率時間分辨率定量分析所需數(shù)據(jù)通量.高分辨活細胞成像的要求空間分辨率要高（2D&3D)時間分辨率根據(jù)實驗來選擇保證細胞的活性（降低光毒性，減少熒光淬滅）長時間運行儀器各方面的穩(wěn)定性yx100nm(0.1mm)FluorescentBeadinaLightMicroscope顯微鏡成像的信號分布PointSpreadFunction(PSF)zx100nm(0.1mm)FluorescentBeadinaLightMicroscope如果能看得更清楚共聚焦VS影像還原microscopedeconvolutionmicroscopeconfocol三種常見的高分辨活細胞成像技術(shù)LightmicroscopytechniquesforlivecellimagingScience,2003cellobjective寬場照明CellSlideobjective激光共聚焦Slide1.Lowintensity(InsightSSI22-89mW).2.Largeilluminatingarea.3.

Weakdamagetothecell.Average:52.8mW/cm21.Highintensity(Laser25-250mW).2.Focusintoasmallvolume.3.Significantdamage.Average:30000000mW/cm2照明強度比較sCMOS極大的提高了成像速度FordecadesCCDswereasuperiorchoiceforfluorescentmicroscopybecauseofseriouslimitationsofCMOSdetectors:smallchipsize(0.5”formatorless)lowersensitivity(<50%QuantumEfficiency)highnoise(>20e-)…untilscientificgradeCMOS(sCMOS)chipwasdevelopedNewgenerationofCMOScamerasoffers:Largefield-of-view(wholewellimagingfor96wellplateat2X)HigherSensitivitythanscientificCCDs5xlessnoiseincomparisonwithindustrystandardcooledCCDsHigherdynamicrangethanscientificCCDsFasterframeratesthanscientificCCDsLargeFieldofViewLowerimagenoiseCCDsCMOSsCMOScameraessentials:ScientificgradeCMOSchip2560x2160pixels(5.5Megapixel)~1electronread-noise33Kelectronwell-depth50-55%maxQE

400fps512*512sCMOSdataandimagesaretakenfromPCO.edge

sCMOS

準確的采集信號，準確的點擴散函數(shù)和軟件結(jié)合才能實現(xiàn)影像還原A:激發(fā)光強度B：采集PSF，由載物臺精度決定C:PSF，由物鏡決定×f(A,B,C)=Astigmatism&ComaSphericalAberrationrejectrejectAxialSkewreject

Pass–allthreecolorsshareacommonvertex.Pass–allthreecolorsoverlaptoformasinglewhitepixel(henceallfourverticesaresharedbyallthreecolors)Fail-Oneortwoofthecolorsdonotshareacommonvertex.完美的物鏡鏡油的選擇長時間實驗的系統(tǒng)穩(wěn)定性因素多點實驗時XY的漂移——電動平臺的長時間精度焦距的穩(wěn)定性——Z軸穩(wěn)定系統(tǒng)溫度敏感細胞的長時間觀察——溫度控制的穩(wěn)定軟件的健壯程度16UltimateFocus焦距穩(wěn)定系統(tǒng)正在申請專利無論機械移動或環(huán)境溫度波動，都能維持Z軸聚焦位置（±25nm）持續(xù)監(jiān)控校正Z軸位置，保證各個時間點的數(shù)據(jù)準確收集聚焦校正時間<200ms只和標記點相關(guān)，和其他條件物鏡、介質(zhì)、液流等無關(guān)KeepyourtargetinfocusVerocelltransfectedwithCFP-actinTimelaps:12hrsOneframe/5minsSinglesliceExposure:200ms中科院病毒所XY電動平臺的穩(wěn)定性Pixel=64nminx,yOpticalResolution=200nminx,yDeltaVisionstagesconfinedrifttolevelsundetectablebythecameraforsuperiortimelapse-imagingxy

多點觀察以及細胞追蹤

keepyourtargetinthefieldofviewx,y=100.0,100.0x,y=100.0,100.0x,y=100.0,100.0x,y=40.0,100.0高分辨活細胞成像的要求空間分辨率要高（2D&3D)時間分辨率根據(jù)實驗來選擇保證細胞的活性（降低光毒性，減少熒光淬滅）長時間運行儀器各方面的穩(wěn)定性植物顯微成像的困難自發(fā)熒光強烈組織樣品多樣且很多比較致密不方便做切片植物活細胞顯微成像的優(yōu)勢大部分時候無需控溫以及CO2比較容易得到有活性的組織DeltaVisionElite在植物領(lǐng)域的應(yīng)用實例23活細胞延時觀察Four-dimensionalimagingofcentromeresduringmitosis(中科院植物生理生態(tài)研究所)(Scalebar=5μm)7sections0.5μmintervals7sections0.5μmintervals45secondsUpto24hoursTheactincytoskeletonundergoescharacteristic