固氮菌作為非豆類生物肥料的應(yīng)用：前景與挑戰(zhàn) 生物技術(shù)專業(yè)

固氮菌作為非豆類生物肥料的應(yīng)用：前景與挑戰(zhàn)摘要：固氮（NF）細(xì)菌與豆科植物形成共生關(guān)系并固定大氣中的氮的潛力已在田間得到開發(fā)利用，以滿足后者對氮需求。這種現(xiàn)象提供了一種氮肥使用的替代方案，數(shù)十年來，氮肥過多和不平衡使用造成了溫室氣體的排放（N2O）和地下水浸出。最近，研究發(fā)現(xiàn)非豆科植物，如水稻，甘蔗，小麥和玉米形成多種固氮細(xì)菌的擴(kuò)展生態(tài)位。這些細(xì)菌在植物中繁殖，成功地定植在根，莖和葉上。在締合期間，入侵的細(xì)菌使獲得的宿主受益，植物的生長，活力和產(chǎn)量得到顯著的提高。隨著人口的增加，對非豆科植物產(chǎn)品的需求也在增長。在這方面，非豆科植物中固氮菌群的豐富度及其與宿主的相互作用程度無疑顯示出其是開發(fā)含氮肥料的生態(tài)友好替代品的希望。在這篇綜述中，我們討論了與各種非豆科植物相關(guān)聯(lián)的固氮菌，并強(qiáng)調(diào)它們促進(jìn)宿主植物生長和提高其產(chǎn)量的潛能，此外，還簡要介紹了觀察到的這些固氮細(xì)菌的促植物生長特性及其與寄主植物的相互作用方式。關(guān)鍵詞：生物固氮（BNF）；固氮（NF）細(xì)菌；內(nèi)生菌；根瘤菌；非豆科植物；促進(jìn)成長前言禾本科的非豆科植物如水稻，玉米和小麥?zhǔn)鞘澜缟霞s65億人口的主食。世界人口的指數(shù)增長表明需要增加作物產(chǎn)量。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織的數(shù)據(jù)，預(yù)計(jì)2008年世界谷物產(chǎn)量將增長2.6％，達(dá)到創(chuàng)紀(jì)錄的21.64億噸。作物產(chǎn)量的增長是化肥（N，P，K）結(jié)合先進(jìn)技術(shù)的任意使用的結(jié)果。非豆類作物的氮肥施用是農(nóng)業(yè)中最昂貴的投入之一。但是，由于氣體排放，徑流，侵蝕和浸出，植物-土壤系統(tǒng)損失了大約65％的應(yīng)用礦質(zhì)氮。該損失對環(huán)境的影響從溫室效應(yīng)，平流層臭氧和酸雨到全球氮循環(huán)的變化以及地表水和地下水的硝酸鹽污染（RejesusandHornbaker1999）。隨著對與環(huán)境相關(guān)的關(guān)注度日益增加，人們正采用各種替代方法來減少植物養(yǎng)分對氮肥的依賴。在此情況下，在農(nóng)業(yè)實(shí)踐中使用固氮細(xì)菌越來越重要。固氮細(xì)菌可以自由存在或共生，無論哪種情況下都可以捕獲大氣中的氮并將未反應(yīng)的N2分子轉(zhuǎn)化為植物容易利用的NH3形式，此過程稱為生物固氮（BNF），并通過以下由細(xì)菌內(nèi)存在的對氧敏感的酶固氮酶催化的反應(yīng)：在非豆科植物體內(nèi)部和周圍發(fā)現(xiàn)了豐富的固氮細(xì)菌菌群。在植物內(nèi)繁殖而未引起任何明顯疾病的固氮細(xì)菌種群稱為“內(nèi)生菌”，而從植物根圍分離出的固氮細(xì)菌種群稱為“根圍細(xì)菌”。有人指出內(nèi)生菌處于比根圍細(xì)菌更有利的環(huán)境中，因?yàn)樗鼈儾灰资芘c其他土壤細(xì)菌競爭的攻擊，并且不易受各種生物和非生物脅迫的影響（Reinhold-HurekandHurek1998）。此外，內(nèi)生菌可獲得宿主體內(nèi)直接提供的營養(yǎng)元素和低水平的O2因子，有助于最佳的固氮酶活性的維持。作為回報(bào)，內(nèi)生菌通過生物固氮和促進(jìn)生長的物質(zhì)促進(jìn)宿主植物的生長發(fā)育（SevillaandKennedy2000）。顯然，這種密切的聯(lián)系使研究人員能夠預(yù)期這些細(xì)菌在可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展中的應(yīng)用。在我們的綜述中，根據(jù)過去十年的發(fā)展情況，我們討論了固氮細(xì)菌（內(nèi)生/根圍）與非宿主禾本科作物共生的自然趨勢有和促進(jìn)它們生長發(fā)育的情況。我們還闡述了在相互作用過程中負(fù)責(zé)促進(jìn)宿主植物生長的細(xì)菌的各種促進(jìn)生長活動(dòng)。固氮細(xì)菌的擴(kuò)展生態(tài)位根瘤菌（根瘤菌屬，中慢生根瘤菌屬，慢生根瘤菌屬，固氮根瘤菌屬，異根瘤菌屬和中華根瘤菌屬）作為一種存在于豆科植物的天然內(nèi)生菌已被廣泛記載。然而，內(nèi)生菌的領(lǐng)域不僅限于豆科植物。在過去的十年中，從世界各地的各種非豆科植物中分離出大量內(nèi)生菌，每克新鮮組織的內(nèi)生菌數(shù)量為106至107個(gè)細(xì)胞（Yannietal，1997；Muthukumarswamyetal，1999；Mirzaetal.2001）。與豆科植物-根瘤菌的相互作用不同，內(nèi)生菌不僅限于非豆科植物內(nèi)的特定區(qū)域，而是發(fā)生于植物的主根，莖和葉中。為了分離內(nèi)生菌，使用次氯酸鈉或氯化汞系統(tǒng)地對植物表面（根，芽）進(jìn)行表面滅菌。Reinhold-HurekandHurek（1998）已經(jīng)綜述了從非豆科植物中分離內(nèi)生菌的各種表面滅菌技術(shù)及其效率。然后，將經(jīng)過表面滅菌的植物部分的提取物鋪在無氮培養(yǎng)基上。通過再接種無菌水稻幼苗驗(yàn)證被分離細(xì)菌作為內(nèi)生菌的能力（Yannietal,1997；Prayitnoetal.1999）。根據(jù)分離出的內(nèi)生菌重新感染宿主植物并滿足“Koch”假設(shè)的能力，它們被稱為“真正的內(nèi)生菌”（Reinhold-HurekandHurek1998）。Koch的假設(shè)陳述了確定某些細(xì)菌是否為致病因子的標(biāo)準(zhǔn)。這些標(biāo)準(zhǔn)之一是從受感染的植物中重新分離引起疾病的細(xì)菌。如果內(nèi)生菌與植物相互作用，則應(yīng)從受感染的植物中重新分離出接種負(fù)責(zé)促進(jìn)植物生長的細(xì)菌。最新的分離方法包括直接分析從含有內(nèi)生菌的源植物組織中獲得的細(xì)菌基因序列（Engelhardetal，2000；Hureketal，2002）。通過這種技術(shù)，Conn和Franco（2004）在小麥中建立了更大的內(nèi)生菌多樣性,不同于用通過純培養(yǎng)的方法獲取。純培養(yǎng)法給予特定細(xì)菌群一定的選擇優(yōu)勢，因此無法提供內(nèi)生菌群的完整概況。Knauthetal.(2005)開發(fā)了基于信使RNA（mRNA）的固氮酶（nifH）基因分析，并在水稻根系相關(guān)的nifH表達(dá)群落中獲得了顯著的品種差異。相似地，Zhangetal.(2007)使用基于nifH基因的短寡核苷酸芯片分析了納米比亞野生稻根中的固氮菌重氮營養(yǎng)。他們的結(jié)果表明，在他們鑒定的總的重氮菌中，有一小部分種群在宿主體內(nèi)活躍地固氮。根瘤菌接種促進(jìn)植物的生長與發(fā)育分離的內(nèi)生菌在農(nóng)業(yè)綜合產(chǎn)業(yè)中的重要性取決于它們在促進(jìn)宿主植物在田間生長和發(fā)育中的表現(xiàn)。在限菌的盆栽和田間條件下進(jìn)行的各種實(shí)驗(yàn)說明了一些分離的內(nèi)生菌對獲得宿主的生物肥育作用(Yannietal.1997,2001;Matthewsetal.2001;Muthukumaraswamyetal.2005,2007).內(nèi)生菌被用作植物（非豆科植物）的菌劑，被證明是一種有效的氮源，可以在水稻和其他谷物的種植中部分替代尿素氮(Yannietal.1997;Baldanietal.2000;Govindarajanetal.2007).通過根瘤菌接種促進(jìn)植物生長（包括植物生物量的增加），說明了生物肥育作用。根瘤菌接種促進(jìn)植物生長涉及增加植物的生物量，氮含量，籽粒產(chǎn)量和在稻草中的轉(zhuǎn)移效應(yīng)以及接種菌在缺氮和含氮土壤中的持久性(Yannietal.1997,2001;Biswasetal.2000a,b;Pengetal.2002)。表1顯示了在致病菌，溫室和田間條件下，不同固氮細(xì)菌利于其谷物宿主的相對能力。Yannietal.（1997）從埃及水稻根分離了11株三葉草結(jié)瘤菌、豆科根瘤菌bv，Trifolii來自埃及水稻與三葉草輪作幾代種植的水稻的根部。在致病菌和田間條件下TrifoliiE11和E12對水稻品種Giza的接種顯著提高了的總氮含量（置信度為95％），水稻的籽粒氮含量和收獲指數(shù)（置信度為99％）(Yannietal.1997,2001;Biswasetal.2000a,b).田間植物的總產(chǎn)量和氮積累每公頃分別增加了3.6t和19-28％(Yannietal.1997,2001;Biswasetal.2000a).觀察到，根瘤菌接種增強(qiáng)了氣孔導(dǎo)度，從而使水稻品種的光合作用速率提高了12％，其中水稻單產(chǎn)顯著提高了16％。這表明在零氮水平下，谷物產(chǎn)量的提高與光合速率之間存在正相關(guān)關(guān)系(Pengetal.2002)。顯然，他們認(rèn)為某些根瘤菌菌株可以通過提高單葉凈光合速率的機(jī)制來促進(jìn)水稻的生長和產(chǎn)量。另一方面，某些根瘤菌分離株抑制了水稻幼苗的生長和發(fā)育(Prayitnoetal.1999;Perrineetal.2005)。這種抑制作用是在以硝酸鹽/亞硝酸鹽作為培養(yǎng)基中唯一存在的氮源的情況下發(fā)生的。PerrineWalker等(2005,2007a)假設(shè)在這些菌株中觀察到的抑制作用是由于細(xì)菌pSymA質(zhì)粒中的基因編碼的硝酸鹽代謝酶所致。這些酶的活性使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，隨后積累了一氧化氮（NO），從而抑制了植物的生長。有趣的是，由于存在附加還原酶，促進(jìn)植物生長的根瘤菌（PGPR）R.trifoliiR4能夠?qū)O進(jìn)一步還原為N2(nitrous/NO;Perrineetal.2007a)。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，初始接種密度為108-109個(gè)細(xì)胞/毫升的菌液足以在接種的植物中獲得最佳生長響應(yīng)(Yannietal.1997,2001;Biswasetal.2000a,b;Chaintrueletal.2000)。然而，可以采用了不同的技術(shù)在溫室或田地中對植物進(jìn)行接種。常用的方法包括：在播種前將種子或幼苗的根浸入肉湯培養(yǎng)基中，將細(xì)菌懸浮液直接施用到土壤中，對甘蔗的苗木進(jìn)行接種，接種菌種衣劑，并用細(xì)菌懸浮液進(jìn)行葉面噴灑(Yannietal.1997,2001;Muthukumarasamyetal.1999;Baldanietal.2000;Biswasetal.2000a,b;Gutierrez-ZamoraandMartinezRomero2001;Matthewsetal.2001;Riggsetal.2001;Fengetal.2006)。不幸的是，目前尚不清楚這些技術(shù)中的哪種技術(shù)能最有效地使細(xì)菌作用于植物，使其在生長和生產(chǎn)方面達(dá)到最大產(chǎn)量。以前的研究顯示，對很多重要商業(yè)作物如水稻，甘蔗和小麥的內(nèi)生菌接種可以減少耕作中的氮肥投入(Yanniatel.1997,Baldanietal.2000,Matthewsetal.2001,Salehetal.2001;Govindarajanetal.2006,2007)。Yanni（1997年）在水稻田除R.trifolii外使用了所建議施氮量的三分之一，稻田的糧食與在施用完全推薦的肥料劑量（每公頃144kgN）的稻田獲得的谷物產(chǎn)量等價(jià)。相似地，在甘蔗中接種伯克霍爾德氏菌（Burkholderiasp.）MG43所產(chǎn)生的效率要比將肥料從一半增加到建議的完全施用量增加很多，從而節(jié)省了約每公頃～140kgN肥料的成本(Govindarajanetal.2006)。草螺菌（Herbaspirillum）是一種廣泛宿主的內(nèi)生菌，可寄生于甘蔗，水稻，小麥，高粱和其他谷物。Baldani等（2000年）測試了80種不同的從水稻，玉米和高粱中分離出來的H.seropedicae菌株，以篩選適合接種水稻的菌種。他們觀察到了12％的測試菌株使水稻鮮重比對照增加100％的超調(diào)現(xiàn)象。在連續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，只有少數(shù)幾個(gè)菌株可以保持其性能。在溫室中，草螺菌可顯著提高水稻產(chǎn)量（以5％的概率水平），達(dá)到每株植物7.5克(Mirzaetal.2000)。此外，接種H.seropedicaeZ67的耐鋁水稻品種的根部氮含量顯著增加29-61％，芽中氮含量顯著增加37-85％(Gyaneshwaretal.2002)。同樣，伯克霍爾德氏菌是另一種內(nèi)生菌，在該領(lǐng)域已被廣泛研究。在田間不同形式的細(xì)菌（根圍和內(nèi)生菌）可使每公頃稻谷產(chǎn)量提高0.5-0.8t，每株植物生物量提高22mg(Baldanietal.2000)。這相當(dāng)于比未接種的對照植物增加了69％的植物生物量。伯克霍爾德氏菌PsJN菌株需要類似于nadC的基因來促進(jìn)馬鈴薯試管苗生長(Wangetal.2006).nadC基因編碼喹啉酸磷酸核糖酰轉(zhuǎn)移酶（QAPRTase）。QAPRTase的酶活性是催化煙酰胺二核苷酸的從頭形成，并形成煙酸單核苷酸（NaMN）作為副產(chǎn)物。nadC突變體無法合成中間底物NaMN，從而無法促進(jìn)宿主植物的生長。但是，通過在體外的培養(yǎng)基中補(bǔ)充添加商用NaMN（10-100μM），可以恢復(fù)PsJN突變體的生長促進(jìn)活性。除了促進(jìn)生長外，B.phytoformisPsJN還使接種植物比無細(xì)菌植物對照更具耐寒性(Barkaetal.2006)。表1固氮細(xì)菌與非豆科植物結(jié)合的優(yōu)勢宿主植物內(nèi)寄生菌/重氮菌劑定殖栽培條件增長百分比參考文獻(xiàn)生物固氮a水稻固氮弧菌草根限菌16（總干重）Reinhold-HurekandHurek1997;Engelhardetal.2000伯克霍爾德菌根溫室68（地上部分生物量）19（種子生物量）Baldanietal.2000光合慢生根瘤菌根圍(以內(nèi)寄生菌形式生存)限菌20(植物總生物量)Chaintrueletal.2000醋桿菌莖，根限菌30（總干重）Muthukumarasamyetal.2005,2007草螺菌seropedicae根限菌38-54（根生物量），22-50（地上部分生物量），37.6（植物干重），52–112，71（鮮重與干重）Elbeltagyetal.2001,Gyaneshwaretal.2002,Jamesetal.2002,Baldanietal.2000粘質(zhì)沙雷氏菌根，莖限菌23（總干重）Gyaneshwaretal.2001玉米伯克霍爾德氏菌sp.莖，根，根圍溫室、田間36-4、5.9-6.3（產(chǎn)量）Estradaetal.2005,Riggsetal.2001巴西固氮螺菌根、莖溫室13-25(產(chǎn)量)Riggsetal.2001甘蔗重氮營養(yǎng)醋桿菌根、莖盆栽試驗(yàn)18.83–49.86(植物生物量)Sumanetal.2005,2007H.seropedicae,H.rubrisubalbicans—溫室35(干物質(zhì))Oliveiraetal.2002PGPRa水稻豆科植物根瘤菌bv.trifolii根溫室和田間15–22,8–22（粒產(chǎn)量）Yannietal.1997,2001;Biswasetal.2000a,b越南伯克氏菌根圍苗圃盆栽試驗(yàn)，田間23和59(芽/根重)，19(產(chǎn)量)，13-22(產(chǎn)量)TranVanetal.2000小麥R.trifolii根盆栽試驗(yàn)24(小麥芽干物質(zhì)和籽粒產(chǎn)量)Hilalietal.2001纖維菌sp.根圍溫室，田間33（根系生長）EgamberdiyevaandH?flich2002玉米R.trifolii根溫室，田間34(產(chǎn)量)、11(產(chǎn)量)Riggsetal.2001中華根瘤菌sp.—溫室49-82（產(chǎn)量）Riggsetal.2001A.螺菌根盆栽試驗(yàn)、田間50-90，33(糧食產(chǎn)量)Dobbelaereetal.2001R.etlibv.phaseoli根限菌20-45(總生物量)Gutierrez-ZamoraandMartinez-Romero,2001H.seropedicae根溫室、田間49–82(產(chǎn)量),19.5(產(chǎn)量)Riggsetal.2001假單胞菌sp,根限菌11.7(總生物量)Shaharoonaetal.2006甘蔗G.重氮營養(yǎng)菌微繁殖溫室26(植物干重)Mu?oz-RojasAndCaballeroMellado(2003)生物固氮+PGPR水稻泛菌屬成團(tuán)泛菌根芽組織限菌63.5（總生物量）Vermaetal.2001;Fengetal.2006G.重氮營養(yǎng)菌LMG7603，H.seropedicaeLMG6513，產(chǎn)脂固氮螺菌4BLMG4348和越南伯克霍爾德氏菌LMG10929的組合—盆栽、田間9.5,23.6Govindarajanetal.2008越南伯克氏霍爾德菌MGK3根，芽盆栽、田間5.6–12.16(產(chǎn)量)Govindarajanetal.2008小麥H.seropedicae種子溫室49–82（總生物量）Riggsetal.2001甘蔗越南伯克霍爾德氏菌根圍、莖、根田間19.5(產(chǎn)量)Govindarajanetal.2006G.重氮營養(yǎng)菌根、莖田間13–16（產(chǎn)量）Govindarajanetal.2006H.seropedeceae根、莖田間5-12（產(chǎn)量）Govindarajanetal.2006陰溝腸桿菌根限菌55和70（根和芽生物量）Mirzaetal.2001克雷伯氏菌sp.GR9根、莖田間13-19.5(生物量)Govindarajanetal.2007a促進(jìn)生長的機(jī)制：生物固氮指生物固氮，PGPR指促進(jìn)植物生長的根瘤菌活性（以上各菌種名字均由網(wǎng)絡(luò)或文獻(xiàn)查得其中一些不是很準(zhǔn)確或沒有中文名字）在寒冷條件下,與未接種的植物相比,B.phytoformisPsJN可以提高葡萄屬釀酒葡萄的光合作用活性和淀粉積累（P<0.05）?？鼓嫘缘脑鰪?qiáng)是細(xì)菌定植使植物中在適應(yīng)脅迫過程中起著重要作用的脯氨酸和酚類含量的升高所引起的。(Barkaetal.2006)。酚類物質(zhì)的升高是宿主植物由于細(xì)菌入侵而引起的一種應(yīng)激反應(yīng)，在水稻與內(nèi)生菌的相互作用的過程中也觀察到過此現(xiàn)象(Mishraetal.2006)。內(nèi)生菌用于盆栽或田地中的植物接種，可單獨(dú)施用或作為混合物施用。用作接種物的細(xì)菌分離株混合物在植物生長和發(fā)育方面具有協(xié)同效應(yīng)(Govindarajanetal.2008).Govindarajan等（2008年）使用了濃度為每毫升10個(gè)菌落形成單位的H.seropedicaeLMG6513，產(chǎn)脂固氮螺菌4BLMG4348，重氮營養(yǎng)葡糖酸醋桿菌LMG7603和越南伯克霍爾德氏菌LMG10929的混合物接種5天齡未感染的水稻幼苗。在所有測定中，混合菌劑的效果最佳，產(chǎn)量提高了14.4％(Govindarajanetal.2007)，而單株平均增產(chǎn)6.2％。然而，在使用混合菌劑時(shí)，每種菌株在混合物中彼此的相容性決定了接種物在促進(jìn)植物生長方面的總體性能。當(dāng)施用到甘蔗上時(shí)，接種重氮營養(yǎng)葡糖酸醋桿菌LMG7603，無乳固氮螺菌和伯克霍爾德菌的混合物比單獨(dú)接種越南伯克霍爾德氏菌MG43和重氮營養(yǎng)葡糖酸醋桿菌LMG7603的產(chǎn)量要低(Oliveiraetal.2002;Govindarajanetal.2006)。但是，在水稻中，與接種上述混合物相比，接種重氮營養(yǎng)菌LMG7603越南伯克霍爾德氏菌LMG10929，H.seropedicaeLMG6513和產(chǎn)脂固氮螺菌4BLMG4348的混合物表現(xiàn)出更高的生長響應(yīng)。盡管Govindrajan等人（2007）使用混合物的性能尚未在甘蔗中進(jìn)行評估，這些研究強(qiáng)調(diào)了為使植物獲得更高的性能在混合接種物中選擇菌株的重要性。

人們已經(jīng)意識到內(nèi)生菌在農(nóng)業(yè)綜合產(chǎn)業(yè)中的潛力，像巴西這樣的國家已經(jīng)采用了在非豆科植物栽培中使用促進(jìn)植物生長的細(xì)菌的方法。隨著大量對非豆類如水稻，小麥，玉米和甘蔗的生長和發(fā)育具有積極作用細(xì)菌的分離和鑒定，使這些植物開發(fā)有效的微生物生物肥料前景光明。然而，要廣泛采用此種做法，要求對在不同地點(diǎn)和不同輪作中觀察到的生產(chǎn)變異性進(jìn)行嚴(yán)格分析。內(nèi)生菌促進(jìn)植物生長：機(jī)制研究據(jù)推測，宿主植物在內(nèi)生菌與植物的相互作用中所產(chǎn)生的有益作用是（1）定植細(xì)菌產(chǎn)生的生物固氮和（2）根瘤菌產(chǎn)生的促進(jìn)植物生長的物質(zhì)的結(jié)果。在某些情況下，可觀察到上述兩種機(jī)制的累積參與。表1總結(jié)了被提出過的不同內(nèi)生菌促進(jìn)宿主植物的生長所產(chǎn)生的不同機(jī)制。氮累積氮是許多農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)中最重要的限產(chǎn)元素。眾所周知，在豆類中，共生細(xì)菌的生物固氮可提供大量植物所需的氮。當(dāng)固氮細(xì)菌在非豆科植物中作為內(nèi)生菌共存時(shí)，植物的總氮含量會均勻上升。接種過的非豆科植物中的氮積累可能是以下因素造成的：生物固氮(Boddeyetal.1995;Elbeltagyetal.2001;Oliveiraetal.2002)或土壤中氮吸收增加(Yannietal.1997;Prayitnoetal.1999)。巴西科研人員們多年來進(jìn)行的系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，盡管氮供應(yīng)不足，但幾十年甚至一個(gè)世紀(jì)以來種植的甘蔗品種并未顯示出土壤氮儲備或單產(chǎn)下降(Boddeyetal.1995)。某些甘蔗品種中發(fā)現(xiàn)，在沒有氮肥情況下，進(jìn)行良好灌溉及施肥種植（給與適當(dāng)供應(yīng)鉀和磷），第一年每公頃產(chǎn)量增加了170至230t。在品種CB45-3，SP70-1143和Krakatau的甘蔗中，在隨后的3年中產(chǎn)量呈持續(xù)增加的趨勢。在這些品種中，氮積累的60％至80％是由于生物固氮。人們已使用了不同的方法證實(shí)了內(nèi)生菌在宿主體內(nèi)固定大氣中氮的能力，例如：乙炔還原檢測，15N同位素稀釋實(shí)驗(yàn)，15N2還原檢測或15N天然豐度測定。Dalton和Kramer（2006）討論了這些測定的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和缺點(diǎn)。這些實(shí)驗(yàn)最終表明，水稻中每株宿主植物（六周齡幼苗）的氮素含量高達(dá)30-45mg，而甘蔗每年每公頃氮素含量為170kg，出現(xiàn)此種現(xiàn)象的原因是生物固氮(Boddeyetal.1995;Iniguezetal.2004)。在野生稻品種Oryzaofficinalis中，用乙炔還原法和摻入15N2氣體來確定接種內(nèi)生草螺弧菌(Herbaspirillumsp.)菌株B501后的植物體內(nèi)氮的固定。N2的摻入百分比為381，而未接種植物比例為0.4，這證明了水稻中草螺弧菌Herbaspirillumsp.B501菌株的固氮作用(Elbeltagyetal.2001)。另一個(gè)例子是生長促進(jìn)內(nèi)生菌伯克霍爾德菌侵染水稻，其中據(jù)估計(jì)31％（每株植物372μgN）的水稻植物的氮來自生物固氮(Baldanietal.2000)。眾所周知，重要的商品水稻印度香米和超級印度香米也通過接種草螺菌和固氮螺菌受益(Mirzaetal.2000)。在溫室試驗(yàn)中，這些水稻品種從大氣中獲得它們氮需求量的19％和47％。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，Oliveira等人（2002年）用每毫升含2×105個(gè)細(xì)胞的最初從甘蔗中分離出的5種不同的固氮細(xì)菌菌株接種微繁殖甘蔗。這些菌株以各種組合方式一起使用。在溫室中馴化45天后，將幼苗移至裝有N15的盆栽中，以通過N15同位素稀釋技術(shù)評估固氮能力。與未接種對照組相比，細(xì)菌接種的總生物量（接種后400天，每株植物645g）最大增加39％。在此過程中，接種的細(xì)菌通過生物固氮吸收了30％的氮(Oliveiraetal.2002)。同樣，在微繁殖甘蔗的根部接種的產(chǎn)生植物激素的甘蔗的重氮型腸桿菌通過大氣固定吸收了29％的氮（Mirzaetal.2001）。在上述所有情況下，接種后定植并侵入植物的細(xì)菌參與了氮的固定(Boddeyetal.1995;Oliveiraetal.2002)。即使在草叢中，也記錄了通過細(xì)菌定殖的固氮作用，盡管固氮的量比水稻或甘蔗要低(Iniguezetal.2004)。與接種nifK-突變株BHNKD4的植物相比，接種野生固氮弧菌的植物具有更高的干重，較低的N15和較多的氮（1.4毫克）(non-NF;Hureketal.2002)。他們利用氮平衡研究推測，氮含量的差異不是由于盆栽介質(zhì)吸收氮引起的，而是因?yàn)檫M(jìn)行實(shí)驗(yàn)的土壤超過8個(gè)月未施氮。在分子水平上，使用定殖于非豆科植物的內(nèi)生菌的突變體nif來確定宿主-內(nèi)生菌相互作用中的生物固氮(Iniguezetal.2004;Hureketal.2002;deCamposetal2006)。在缺氮培養(yǎng)基中生長并接種肺炎克雷伯氏菌324的非固氮nifH突變體的水稻植株與接種野生型肺炎克雷伯氏菌的批次相比顯示出嚴(yán)重氮缺乏跡象(Iniguezetal.2004)。接種了野生型的K.肺炎克雷伯菌的植物同化了42％的氮，其中41％來自大氣的氮。與先前的情況相反，接種了具有增強(qiáng)的體外固氮能力的巴西固氮螺菌Sp7::Tn5-33突變株的水稻植株，每株植物干物質(zhì)累積351mg(deCamposetal.2006)。這種積累相當(dāng)于用額外5mMNH4NO3處理的對照植物。這些科研人員的觀察結(jié)果突出了固氮細(xì)菌在植物中積累的氮與促進(jìn)生長之間的相關(guān)性。隨后，Hurek等（2002年）從接種的Kallar草根中分離出85個(gè)核苷酸長的nifHpoly（A）mRNA，表明固氮弧菌BH72在植物中表達(dá)固氮酶基因的代謝活性。在同一樣品種，從接種草根中分離出的nifH基因可以擴(kuò)增，而對照植物中nifHmRNA的水平還不夠高，無法檢測。BH72nifH在受試植物中可以表達(dá)，但在對照植物中不表達(dá)，說明接種植物的植物氮源來自固氮弧菌固氮。盡管禾本科植物沒有為參與生物固氮通路的酶的功能創(chuàng)造一個(gè)有利的體內(nèi)環(huán)境的特征，但內(nèi)生菌在宿主內(nèi)可成功表達(dá)固氮結(jié)構(gòu)基因nif。在小麥，玉米，高粱和水稻根的表皮細(xì)胞，根皮質(zhì)細(xì)胞間區(qū)和維管組織中檢測出編碼固氮酶鐵蛋白的基因的表達(dá)(Hureketal.2002;Egeneretal.1999;RoncatoMaccarietal.2003)。實(shí)際上，在O.officinalis7天的幼苗中，定殖的草螺菌sp.B501gfp的nifH轉(zhuǎn)錄遵循生理節(jié)律（Youetal.2005）。在光亮階段，nifH基因的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到了黑暗階段的100倍。這是矛盾的，并且與所謂的“氧氣悖論”背道而馳，因?yàn)楣庹针A段會產(chǎn)生好氧條件（21％O2）。在此階段，尚不知道在這種情況下酶活性是如何被保護(hù)的。但是，You等（2005年）認(rèn)為可能是為了獲得在光照期間產(chǎn)生的光產(chǎn)物的最大益處的內(nèi)生菌適應(yīng)現(xiàn)象。內(nèi)生菌的其他PGPR活性一些科研人員觀察到，接種細(xì)菌的植物中總體的生長促進(jìn)和氮同化作用不僅僅是由于內(nèi)生菌引起的生物固氮所致。在使用未滅菌的土壤進(jìn)行的大量溫室和田間試驗(yàn)中，Riggs等人（2001）觀察到，在溫室條件下，接種了H.seropedicae的玉米種子中，施用氮肥的玉米產(chǎn)量提高了49％至82％，而沒有施肥的玉米產(chǎn)量僅提高了16％。這表明除生物固氮以外的其他因素的參與，可提高玉米植物利用有效氮肥的能力(Yannietal.1997,2001;Chaintrueletal.2000)。同樣，Sevilla等（2001年）還提出了除N固定外其他生長促進(jìn)因子的參與，因?yàn)锳.重氮營養(yǎng)菌的野生和nifH-突變體都在氮存在下促進(jìn)了甘蔗的生長。此外，在R.trifolii或緩生根瘤菌與水稻的聯(lián)系中，沒有證據(jù)表明細(xì)菌會固定植物中的氮(Yannietal.1997,2001;Chaintrueletal.2000)。大多數(shù)具有植物生長促進(jìn)特性的內(nèi)生菌是植物激素的生產(chǎn)者：吲哚乙酸，赤霉素和細(xì)胞分裂素(Biswasetal.2000a,b;Yannietal.2001,Vermaetal.2001)，鐵載體螯合體(Yannietal.2001;Vermaetal.2001)，磷酸鹽增溶酶(Vermaetal.2001)，重組1-氨基環(huán)丙烷-1-羧基脫氨酶(Khalidetal.2005)。細(xì)菌產(chǎn)生的生長激素促進(jìn)了側(cè)根的發(fā)育，提高根瘤菌對植物養(yǎng)分的吸收。ACC脫氨酶產(chǎn)生的假單胞菌spp.在氮存在的情況下使玉米植株的株高，根重和總生物量顯著增加(Shaharoonaetal.2006)。PGPR產(chǎn)生的ACC脫氨酶降低了乙烯的直接前體ACC，從而降低了乙烯的水平。在根中和根的周圍較低水平的乙烯依次促進(jìn)了根的生長和伸長(Glick1995)。根圍細(xì)菌在體外釋放植物生長素和ACC脫氨酶與促進(jìn)宿主植物的生長呈線性相關(guān)(Khalidetal.2005)。隨后，吲哚-3-乙酸和ACC脫氨酶的生產(chǎn)被用來作為鑒定和篩選內(nèi)生菌的工具(Khalidetal.2005;Shaharoonaetal.2006)。非豆科植物-根瘤菌互作盡管在非豆科植物中廣泛存在內(nèi)生菌，但有關(guān)內(nèi)生菌與宿主相互作用的機(jī)理數(shù)據(jù)很少。固氮細(xì)菌對非豆科植物的感染和定殖與豆科植物根瘤菌共生有顯著差異。已在許多情況下使用熒光標(biāo)記的內(nèi)生菌，抗體，熒光顯微鏡，掃描和透射電子顯微鏡等各種技術(shù)，對細(xì)菌進(jìn)入宿主植物的途徑進(jìn)行了跟蹤和評分(Prayitnoetal.1999;Chaintreuiletal.2000;Jamesetal.2001;Vermaetal.2004;Perrie-Walkeretal.2007b)。在接種非豆類后90-120分鐘，可在主根表面觀察到綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的根瘤菌菌株ANU843，E4和R4(Prayitnoetal.1999;Perrie-Walkeretal.2007b)。然而，細(xì)菌需要24小時(shí)才能完全附著在根表面，此后再保持穩(wěn)定2周(Prayitnoetal.1999;GyaneShwaretal.2001;Chietal.2005;Perrie-Walkeretal.2007b)。內(nèi)生菌是更具侵略性的定居菌，能夠勝過周圍環(huán)境中的其他細(xì)菌（Vermaetal，2004）。R.trifolii水稻根部周圍每克根圍土壤?1.7×106的密度下發(fā)生。（Yanni等，1997）。在側(cè)根突出的某些區(qū)域，R.trifoliiR4處理的水稻中觀察到根部卷曲的根毛，包圍著大量的GFP標(biāo)記的細(xì)菌（Perrie-Walkeretal.2007b）。另外，在被接種的植物中也明顯存在感染線狀結(jié)構(gòu)。隨后，細(xì)菌通過種子或營養(yǎng)器官傳播至下一代（Vermaetal.2001）。內(nèi)生菌能成功進(jìn)入宿主植物的途徑包括：根尖，側(cè)根出現(xiàn)點(diǎn)處的側(cè)根裂紋，根表皮上的損傷部位和受損的氣孔(Chaintreuiletal.2000;Jamesetal2002;Sevillaetal.2001;Chietal.2005;Perrine-Walkeretal.2007b)。在擬南芥中，100％已接種H.seropedicae的植物其菌株定植在側(cè)根(Jamesetal.2002)。根瘤菌在成功入滲后，會在整個(gè)宿主植物內(nèi)部傳播，而不會引起明顯的植物防御反應(yīng)。根的細(xì)胞間和皮質(zhì)區(qū)域形成了內(nèi)生菌初始定植的首選位點(diǎn)(Chaintrueletal.2000;Vermaetal.2004)。定植進(jìn)一步擴(kuò)展到根皮層的細(xì)胞間空間，再到木質(zhì)部導(dǎo)管，再擴(kuò)展到葉肉的細(xì)胞間空間(Gyaneshwaretal.2002;Roncato-Maccarietal.2003)。鑒于細(xì)菌在空氣傳播的機(jī)制，許多科研人員提出了“木質(zhì)部易位”的理論(Jamesetal.2002;Chietal.2005)。觀察到接種的甘蔗苗和溫室栽培植物的木質(zhì)部導(dǎo)管和薄壁組織（可能是韌皮部）中存在大量重氮營養(yǎng)菌(FuentesRamirezetal.1999;Jamesetal.2001)。此外，Chi等（2005年）觀察到，帶有GFP標(biāo)記的苜蓿中華根瘤菌和毛萼田菁莖瘤菌ORS57的菌落伴隨內(nèi)生植入后，細(xì)菌上升到莖基部，葉鞘和葉片中，達(dá)到每立方厘米感染組織有9×1010根瘤菌的種群。一旦細(xì)菌滲透到植物中，細(xì)胞壁水解酶，如由產(chǎn)生的內(nèi)切纖維素酶，多聚半乳糖醛酸酶，果膠裂解酶以及由成團(tuán)泛菌，H.seropedicaeZ67，H.草螺菌產(chǎn)生的纖維素酶和果膠酶，其可協(xié)助宿主內(nèi)細(xì)菌的入侵和傳播過程(Yannietal.2001;Vermaetal.2001;Jamesetal.2002)。Compant等人的工作中也強(qiáng)調(diào)在伯克霍爾德菌感染釀酒葡萄中使用細(xì)胞壁降解酶內(nèi)切葡聚糖酶和多聚半乳糖醛酸酶(2005)。在這種相互作用中發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的問題，植物是如何識別有益的微生物的。目前，關(guān)于幫助內(nèi)生菌抑制或避免宿主防御反應(yīng)的根瘤菌因子知之甚少。然而，在這種情況下，可能還存在某種與根瘤菌-豆科植物共生類似的“群體感應(yīng)”機(jī)制，這有助于建立成功的聯(lián)系。水稻根瘤菌接種與植物葉片中酚酸（例如沒食子酸，單寧酸，阿魏酸和肉桂酸）的積累增加有關(guān)(Mirzaetal.2001)。酚酸的這種增加是植物中與致病性的脅迫相關(guān)的一種現(xiàn)象(Pieterseetal.2002)。響應(yīng)于根瘤菌入侵而觸發(fā)的防御反應(yīng)稱為根瘤菌介導(dǎo)的“誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性”（ISR）。ISR受茉莉酸和乙烯起關(guān)鍵作用的信號傳導(dǎo)途徑所控制。相比之下，病原體誘導(dǎo)的“系統(tǒng)獲得性反應(yīng)”受水楊酸的調(diào)節(jié)(reviewedbyPieterseetal.2002)。乙烯信號是由甘蔗中的一個(gè)受體家族觸發(fā)的，以響應(yīng)G.重氮營養(yǎng)菌和草螺菌.sp的接種。與致病性相互作用相反，推定的乙烯受體表達(dá)在有益細(xì)菌入侵期間被上調(diào)（Cavalcanteetal.2007）。他們推測，像這樣SCER1受體的上調(diào)可能會降低乙烯的敏感性，從而降低植物對重氮營養(yǎng)菌的防御能力。從甘蔗中鑒定出的另一種受體樣激酶SHR5在內(nèi)生締合過程中受到抑制。這是在內(nèi)生相互作用過程中觀察到的排他現(xiàn)象，而在致病性相互作用中則看不到。盡管尚未被更好的了解，但該激酶的產(chǎn)物在成功建立內(nèi)生相互作用中所涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著作用。響應(yīng)PGPR而發(fā)展的ISR信號并沒有改變相互作用的建立，反而增強(qiáng)了入侵植物的生長和發(fā)育(Mirzaetal.2000)。研究表明，甘蔗對重氮營養(yǎng)菌的特異性耐受是由于宿主的某些糖蛋白與重氮營養(yǎng)菌的細(xì)胞結(jié)合。糖苷部分由通過β-（1-2）鍵連接的果糖單元組成，并且與生活在甘蔗葉片表面的附生細(xì)菌腸膜明串珠菌相比，能更有效地粘附于重A.氮營養(yǎng)菌(Legazetal.2000)。在Orme?o-Orrillo等人的最新研究中（2008年）,強(qiáng)調(diào)了根瘤菌脂多糖（LPS）在玉米的根圍和根際定植過程中的作用。他們觀察到，當(dāng)以1：1比例共同接種時(shí)，LPS生物合成缺陷的3個(gè)轉(zhuǎn)座子突變體R.tropici在與親本菌株的競爭性根部定植過程中顯著受損。另外，LPS提供了保護(hù)層，其可抵抗植物產(chǎn)生的許多疏水性和親脂性抗菌化合物，因?yàn)橥蛔凅w比野生型更易感。挑戰(zhàn)和未來展望在過去的十年中，進(jìn)行了大量研究以優(yōu)化條件并從各種內(nèi)生菌與非豆類植物的相互作用中獲得最大收益。但是