達(dá)安 HBV-DNA定量試劑說(shuō)明書

第頁(yè)共4頁(yè)是不易做到的。靈敏度提高得益于光譜技術(shù)。熒光探針雜交，進(jìn)一步提高了特異性PCR擴(kuò)增中常會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和引物二聚體，從而影響了對(duì)特異電泳帶的判斷。FQ-PCR通過特異性探針雜交信號(hào)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，相當(dāng)于PCR反應(yīng)過程中自動(dòng)完成了Southern雜交，進(jìn)一步提高目的基因檢測(cè)的特異性。擴(kuò)增與自動(dòng)分析一體化，檢測(cè)更加簡(jiǎn)便和快速FQ-PCR通過計(jì)算機(jī)和分析軟件，使PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測(cè)和定量分析一體化，比傳統(tǒng)定性PCR更為簡(jiǎn)便和快速，同時(shí)也避免了傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物分析中有害物質(zhì)對(duì)人體的影響，計(jì)算和數(shù)據(jù)處理也有利于科研和臨床資料的保存和分析。.臨床應(yīng)用概要科學(xué)研究已經(jīng)證明，人類疾病大都直接或間接與基因有關(guān)，臨床實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)正進(jìn)入基因診斷時(shí)代。但對(duì)于許多疾病的發(fā)生和發(fā)展來(lái)說(shuō)，相關(guān)基因不是有無(wú)問題，而是一個(gè)從量變到質(zhì)變的過程，基因定量檢測(cè)更具有臨床意義。感染性疾病PCR在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)中最有價(jià)值的應(yīng)用領(lǐng)域就是對(duì)感染性疾病的診斷。理論上，只要樣本有一個(gè)病原體存在，PCR就可以檢測(cè)到。一般實(shí)驗(yàn)室也能檢出10~102基因拷貝，而目前病原體抗原檢測(cè)方法一般需要105-7個(gè)病原體才可檢測(cè)到。PCR對(duì)病原體的檢測(cè)解決了免疫學(xué)檢測(cè)的“窗口期”問題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。定量PCR研究資料已表明，病原體數(shù)量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有相關(guān)性。許多研究表明，人類免疫缺陷病毒(HIV)感染后，潛伏期長(zhǎng)短和臨床癥狀輕重與血液中的病毒量顯著相關(guān)；有也研究表明，HIV病毒載量低于一定值時(shí)，沒有傳染性。在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中發(fā)現(xiàn)，病毒的數(shù)量與某些藥物的療效相關(guān)。例如，干擾素治療對(duì)肝炎病毒高拷貝者不敏感，低拷貝者敏感；而有些藥物則具有顯著降低病毒高拷貝的作用。腫瘤盡管腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制尚未完全清楚，但相關(guān)的基因的遺傳學(xué)改變的積累，是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被普遍接受。癌基因的表達(dá)增加和突變，在許多腫瘤早期和良性的階段就可出現(xiàn)。PCR技術(shù)不但能有效的檢測(cè)基因的突變，而且能準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因的表達(dá)量，可據(jù)此進(jìn)行腫瘤早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷。幾乎所有慢性骨髓性白血病患者都可檢測(cè)到原癌基因易位導(dǎo)致的BCR/ABL融合基因形成，定量PCR技術(shù)可通過檢測(cè)BCR/ABL融合基因的表達(dá)確定微量殘余惡性細(xì)胞存在的數(shù)量，以此作為治療效果和估計(jì)復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性的依據(jù)。腫瘤標(biāo)記物質(zhì)也是腫瘤診斷的熱門研究領(lǐng)域。目前臨床對(duì)此多用免疫學(xué)方法檢測(cè)，靈敏度低，一般需要達(dá)到108個(gè)分子數(shù)。用定量逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR方法，一般條件下可檢出10-102某種標(biāo)志物的mRNA，可大大提高檢出率。一些病毒致癌作用也與病毒載量有關(guān)，EB病毒載量的FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果已被用于鼻咽癌早期發(fā)現(xiàn)和隨訪。遺傳病PCR技術(shù)首次臨床應(yīng)用就是從檢測(cè)鐮狀細(xì)胞和B-地中海貧血的基因突變開始的?；虻耐蛔兒腿笔Ь鶗?huì)引起各種珠蛋白的表達(dá)不平衡，用FQ-PCR檢測(cè)各種珠蛋白基因表達(dá)差異，是地中海貧血診斷的有效手段?？傊c疾病直接相關(guān)的基因檢測(cè)外，各種與疾病相關(guān)的細(xì)胞因子、激素、受體，用FQ-PCR方法檢測(cè)其基因表達(dá)水平具有更高的靈敏性，更有利于疾病診斷。參考文獻(xiàn)LivaKJ,FloodSJA,MarmaroJ,etal.OligonucletideswithfluorescentdyesatoppositeendsprovideaquenchedprodesystemusefulfordetectingPCRproductandnucleicacidhybridization.PCRMethodsApplic,1995,4:357-362.HollandPM,AbramsonRD,WastonR,etal.Detectionofspecificpolymerasechainreactionproductbyutilizingthe5'to3'exonucleaseactivityofthethemusaquaticusDNApolymerase.ProcNatAcaSciUSA,1991,88:7276-7280HiguchiR,DollingerG,WalshPS,etal.StimutaneousamplificationanddetectionofspecificDNAsequences.Biotechnology,1992,10:413-417.熒光探針定量PCR定量檢測(cè)的意義定量檢測(cè)與定性檢測(cè)的最大區(qū)別就在于，定性只是檢測(cè)病原體核酸的“有”或“無(wú)”，而定量可以檢測(cè)病原體核酸量的“多”或“少”。定量檢測(cè)的意義：體現(xiàn)病原體含量與復(fù)制水平、感染程度之間的關(guān)系。評(píng)價(jià)和考核治療效果。用于傳染病發(fā)病的監(jiān)控、預(yù)測(cè)與預(yù)防。作為新的愈后指標(biāo)。建立新的病原體分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。新的藥物及療法的研究與開發(fā)。熒光定量PCR報(bào)告結(jié)果的讀取：熒光定量PCR是直接擴(kuò)增病原體的特異性DNA或cDNA,其結(jié)果反映了標(biāo)本中DNA或RNA存在的多少，結(jié)果通常用數(shù)字表示，報(bào)告為“copies/ml"、“2U/ml”或“copies"，copy即“拷貝”，表示病原體基因組的個(gè)數(shù)，該數(shù)據(jù)越大，表明病原體在體內(nèi)復(fù)制得越厲害，傳染性越強(qiáng)。例：HBV-DNA定量結(jié)果報(bào)告：3.637X104IU/ml（如果采用科學(xué)記數(shù)法表示為：3.637E+04）,代表每ml血液中含有36,370國(guó)際單位乙肝病毒分子。如果待檢標(biāo)本能夠定量，如血液等，結(jié)果報(bào)告為多少copies/ml或2U/ml。如果待檢標(biāo)本不易定量，如分泌物、痰液等，結(jié)果只報(bào)告為多少copies。乙型肝炎病毒（HBV）一乙肝病毒（hepatitisBvirus,HBV）感染HBV感染是全球性公共衛(wèi)生問題，世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界乙肝病毒攜帶者有3.5億人之多。我國(guó)人群HBV攜帶率約為10%,有近1.3億人感染HBV,是世界上最大的“肝炎大國(guó)”。HBV感染后臨床表現(xiàn)呈多樣性，可表現(xiàn)為重癥肝炎、急性肝炎、慢性肝炎或無(wú)癥狀攜帶者，其中部分慢性肝炎可演變成肝硬化或肝癌。HBV攜帶者因無(wú)癥狀，不易被察覺，其作為傳染源的危害性比患者更甚。HBV病毒顆粒呈球形，具有雙層的衣殼，HBsAg鑲嵌于脂質(zhì)雙層的外衣殼中。HBsAg大量存在于感染者血中，是HBV感染的主要標(biāo)志，可刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體即HBsAb。HBcAg位于內(nèi)衣殼部分，其外被HBsAg所覆蓋，不易在血循環(huán)中檢出。其抗原性較強(qiáng)，能刺激機(jī)體產(chǎn)生HBcAb。HBcAblgG在血中持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，為非保護(hù)性抗體。HBcAblgM提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)。HBeAg是PreC基因（前核基因）的編碼產(chǎn)物，是一種非結(jié)構(gòu)性蛋白，為可溶性蛋白質(zhì)，自肝細(xì)胞分泌入血中。HBeAg的消長(zhǎng)與病毒體的DNA聚合酶的消長(zhǎng)一致，故可作為HBV復(fù)制及強(qiáng)感染性的指標(biāo)。其刺激機(jī)體產(chǎn)生HBeAb，對(duì)HBV感染有一定的保護(hù)作用，通常認(rèn)為HbeAb的出現(xiàn)是預(yù)后良好的征象。在這三對(duì)抗原、抗體系統(tǒng)中，核心抗原較難檢測(cè)到，一般不作為臨床常規(guī)檢查，故稱為“兩對(duì)半”。其中HBsAg、HBeAg、HBcAb三項(xiàng)陽(yáng)性稱為“大三陽(yáng)”，HBsAg、HBeAb、HBcAb三項(xiàng)陽(yáng)性稱為“小三陽(yáng)”。二“兩對(duì)半”檢測(cè)與HBV-DNA定量“兩對(duì)半”是從免疫學(xué)水平來(lái)檢測(cè)HBV感染機(jī)體后引起免疫應(yīng)答，產(chǎn)生相應(yīng)抗原抗體的含量（這個(gè)“含量”還不是定量，而只是抗原抗體的“有”或“無(wú)”），它實(shí)際上測(cè)定的是機(jī)體感染HBV后免疫應(yīng)答結(jié)果的反映。由于個(gè)體反應(yīng)的差異，不同的人在感染HBV后會(huì)出現(xiàn)不同的免疫應(yīng)答，從而得到不同的“兩對(duì)半”結(jié)果模式。如產(chǎn)生抗體、表現(xiàn)為“攜帶者”、“大三陽(yáng)”、“小三陽(yáng)”等等。但是所有這些免疫學(xué)指標(biāo)不能反映患者或病人體內(nèi)病毒的復(fù)復(fù)水平及傳染程度，不能提示其與乙型肝炎的發(fā)生和發(fā)展過程之間的聯(lián)系。熒光探針定量PCR技術(shù)則是從分子生物學(xué)水平直接檢測(cè)HBV病毒自身的遺傳物質(zhì)DNA，是病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的指標(biāo)。HBsAg雖然是HBV的感染標(biāo)志，但在感染的早期，或由于S基因（編碼HBsAg）的低水平表達(dá)或變異，常規(guī)方法難以檢出，會(huì)導(dǎo)致漏檢。HBV-DNA檢測(cè)比免疫學(xué)檢測(cè)更早期、更靈敏。免疫學(xué)方法檢測(cè)為HBsAg（一）的病人中，約有3%以上檢測(cè)出HBV-DNA（+）,健康供血者用PCR方法檢測(cè)HBV-DNA，也有一定比例的陽(yáng)性。HBsAg陰性的慢性肝炎中，仍有部分是HBV感染引起的。所以單憑HBsAg陽(yáng)性與否來(lái)判斷肝臟中HBV的復(fù)制及有無(wú)傳染性是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，易造成部分慢性型病毒性肝炎的漏診。對(duì)于HBsAg陰性或有HBV感染后的任何血清學(xué)依據(jù)都應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行HBV-DNA熒光定量檢測(cè)。也有時(shí)出現(xiàn)HBeAg（一）而HBV-DNA（+）的結(jié)果，這是因?yàn)榫幋ae抗原的PreC區(qū)基因極易出現(xiàn)變異，在PreC區(qū)出現(xiàn)終止密碼子，使PreC區(qū)基因與C區(qū)基因不能轉(zhuǎn)譯出完整的e抗原，導(dǎo)致HBeAg表達(dá)缺失，機(jī)體感染HBV不表達(dá)HBeAg，當(dāng)然血清學(xué)方法也不能檢測(cè)出HBeAg的存在。HBsAg（+）患者中大約有1-10%檢測(cè)不出HBV-DNA，這種情況在世界各國(guó)都有報(bào)道。一方面，由于HBV-DNA整合于宿主細(xì)胞基因組，或基因變異，與常用的PCR引物、探針不匹配，PCR擴(kuò)增不出相應(yīng)的基因序列，因而未能檢出。此外，由于HBV的復(fù)制有反轉(zhuǎn)錄過程，S基因（編碼表面抗原）可以以2.1KbRNA為mRNA轉(zhuǎn)譯成HBsAg，故在部分HBV感染中雖無(wú)病毒復(fù)制，但可長(zhǎng)期產(chǎn)生HbsAg。5?10%HBV感染者表現(xiàn)為單項(xiàng)HBcAb陽(yáng)性。有許多報(bào)道證明，單項(xiàng)HBcAb陽(yáng)性的血液可以引起HBV的輸血后感染。如果同時(shí)檢查HBV-DNA，可以減少漏檢，預(yù)防輸血后肝炎的發(fā)生。應(yīng)用PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)“大三陽(yáng)”病人血中能夠檢出HBV-DAN（檢出率約為96%左右），有相當(dāng)一部分人e抗原轉(zhuǎn)化e抗體后，即“大三陽(yáng)”轉(zhuǎn)化為“小三陽(yáng)”后，其血清中仍有DNA存在（檢出率約為30%），說(shuō)明病毒仍未消失和停止復(fù)制?！靶∪?yáng)”病人血清中HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率約為60-70%，這與病毒遺傳物質(zhì)突變或與宿主基因組整合、用藥后復(fù)制暫停、以及血清HBV病毒炎癥清除使血清中的HBV-DNA消失或下降至極低濃度（低于檢測(cè)下限）有關(guān)，這種情況下并不表示病人恢復(fù)，應(yīng)隨訪并復(fù)查血清HBV-DNA以免誤癥。要特別指出的是，近年來(lái)由于抑制病毒復(fù)制的核苷類藥物藥物（如拉咪呋啶）在臨床的大量使用，使得HBV-DNA復(fù)制水平可能會(huì)在短時(shí)期內(nèi)迅速降低至不可檢測(cè)水平（這時(shí)候免疫學(xué)檢測(cè)指標(biāo)可不發(fā)生改變），但是隨著患者出現(xiàn)藥物耐受或產(chǎn)生基因突變，HBV-DNA復(fù)制水平又可能呈現(xiàn)一種上升趨勢(shì)，從而使HBV-DNA定量檢測(cè)出現(xiàn)相對(duì)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果。熒光探針PCR定量檢測(cè)HBV-DNA的意義（一）HBV-DNA定量檢測(cè)，臨床上以＜103copies/ml為檢測(cè)臨界值，可作為乙肝病毒無(wú)復(fù)制狀態(tài)或低水平復(fù)制的指標(biāo)。慢性乙肝患者血清中HBV-DNA〉105copies/ml的患者，如果體內(nèi)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平異常，應(yīng)考慮接受抗病治療。（二）HBV-DNA定量檢測(cè)是直接對(duì)HBV的遺傳物質(zhì)DNA進(jìn)行基因擴(kuò)增，是病毒復(fù)制和存在的最早期、最靈敏也是最可靠的指標(biāo)，可對(duì)HBV感染作出早期診斷。乙肝病人傳染性與其血清中HBV-DNA含量高低呈正相關(guān)，病人血清中HBV-DNA復(fù)制水平越高，其傳染性越強(qiáng)。（三）乙肝的治療目前尚無(wú)特效方法，常用的有干擾素和拉咪呋啶。臨床上一般認(rèn)為用藥后HBV-DNA下降至U105copies/ml以下為對(duì)藥物完全應(yīng)答；定量下降大于2個(gè)數(shù)量級(jí)（102）為對(duì)藥物部分應(yīng)答；未達(dá)上述標(biāo)準(zhǔn)為低應(yīng)答或無(wú)應(yīng)答。研究表明，對(duì)于干擾素治療：（1）治療前HBV低水平復(fù)制者對(duì)干擾素的反應(yīng)性明顯優(yōu)于高水平復(fù)制者。HBsAg轉(zhuǎn)陰的幾乎都是那些治療前血清HBV-DNA含量較低者，而治療前HBV-DNA含量特別高者大多療效不佳；（2）治療中病毒復(fù)制水平迅速降低者，有望治愈。相反，治療期間HBV-DNA水平下降較慢，或下降幅度較小，或變化不明顯者，大多治療無(wú)效；（3）治療結(jié)束后，采用PCR定量法監(jiān)測(cè)，HBV-DNA完全轉(zhuǎn)陰一年以上者，可能不再?gòu)?fù)發(fā)，而終止治療后HBV-DNA仍保持較低水平者，反跳的可能性較大。核苷類藥物拉咪呋啶有顯著降低高病毒載量作用，近期療效頗有優(yōu)勢(shì)，但是長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致HBV基因突變，患者易產(chǎn)生耐受性，且易出現(xiàn)停藥后反彈。（四）肝移植前患者血清HBV-DNA水平的高低決定移植后肝臟是否再感染HBV。因?yàn)镠BV主要侵犯肝臟，建議移植前使用抗HBV藥物，最大限度降低血清HBV-DNA濃度，有助于防止HBV侵犯移植后肝臟，提高肝臟移植的效果。（五）乙肝婦女懷孕前進(jìn)行定量PCR測(cè)定，有助于選擇有利的懷孕時(shí)機(jī)，要選擇低病毒載量時(shí)受孕。乙肝孕婦懷孕期間定期進(jìn)行定量PCR檢查，有助于使部分病人得到及時(shí)、正確的診斷，減少宮內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)；母一嬰傳播多發(fā)生于胎兒期和圍生期。尤其是HBsAg和HBeA