電化學免疫傳感器的應用

關于電化學免疫傳感器的應用第1頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五目錄

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前言免疫分析電化學免疫分析2

電化學免疫傳感器

免疫傳感器電化學免疫傳感器3

發(fā)展及展望第2頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五前言1.免疫分析（Immunoassay）概念：基于用抗體或抗原作為選擇性化學試劑以分析測定抗原或抗體及半抗原的分析方法。分子識別材料：抗原或抗體分子識別基本原理：Ag十AbAg·Ab分類放射性免疫分析（RIA）酶聯免疫分析（ELISA）發(fā)光免疫分析（LIA）電化學免疫分析（ECIA）第3頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五電化學免疫分析法是將免疫技術與電化學檢測相結合的一種分析方法1951年，由Breyer和Radclif首次應用，極譜法測定由偶氮標記的抗原六七十年代后電分析技術方法的發(fā)展：液相色譜電化學分析電化學流動注射分析微分脈沖伏安法陽極溶出伏安法第4頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五電化學免疫傳感器1免疫傳感器與測定抗原抗體反應有關的傳感器1990年Henry等提出結構：感受器、轉換器、電子放大器。分類：電化學免疫傳感器、光學免疫傳感器、壓電免疫傳感器和SPR型免疫傳感器等。

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2.電化學免疫傳感器是一種將電化學分析方法與免疫學技術相結合而發(fā)展出來的具有快速、靈敏、選擇性高、操作簡便等特點的生物傳感器。根據2001年ＩＵＰＡＣ的對生物傳感器分類標準,電化學免疫傳感器是基于抗原抗體反應的,可進行特異性的定量或半定量分析的自給式的集成器件,其中抗原/抗體是分子識別元件,且與電化學傳感元件直接接觸,并通過傳感元件把某種或者某類化學物質濃度信號轉變?yōu)橄鄳碾娦盘枴８鶕z測信號的不同,電化學免疫傳感器可分為電位型、電流型、電導型和電容型。第6頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五

2.1電位型免疫傳感器2.1.1

直接型電位免疫傳感器原理利用抗原或抗體在水溶液中兩性解離本身帶電的特性,將其中一種固定在電極表面或膜上,當另一種與之結合形成抗原抗體復合物時,原有的膜電荷密度將發(fā)生改變,從而引起膜的Donnan電位和離子遷移的變化,最終導致膜電位改變。第7頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五參比電極抗原結合抗體的膜原理：先通過聚氯乙烯膜把抗體固定在金屬電極上，然后用相應的抗原與之特異性結合．抗體膜中的離子遷移移率隨之發(fā)生變化，從而使電極上的膜電位也相應發(fā)生改變。膜電位的變化與待測物濃度之間存在對數關系第8頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五應用早期的研究者利用此原理測定了人血清中的梅毒抗體、人血清白蛋白,并完成了血清鑒定Yamamoto等分別將HCG抗原或其抗體固定在鈦金屬電極表面,檢測了HCG及其抗體國內學者彭圖治等分別報道了對人CA15－3、AFP、IgG、HBsAg的直接檢測.（彭圖治，祝方猛等.測定甲胎蛋白的非標記電位型免疫傳感器.應用化學，1998，01：47－49）第9頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五2.1.2

酶標記電位型免疫傳感器

將免疫化學的專一性和酶化學的靈敏性融為一體,對低含量物質的檢測。標記酶:辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶和脲酶。

酶標記傳感器(電位型或電流型),最后均可歸結為是對NADH、苯酚、O2、H2O2、NH3及新近開發(fā)的電活性物質的檢出。

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應用Ghindilis報道了一種無介質反應體系。它用一種具有電催化活性的生物催化劑(如乳糖酶)來標記抗胰島素抗體。與固定在電極上的胰島素特異性結合，乳糖酶催化電極上氧的電還原反應，從而使電極上電位增加，其增加值與溶液中游離抗原(胰島素)濃度有比例關系。檢測胰島素,獲得了很寬的線性范圍(300mV)（Directelectrontransfercatalyzedbyenzymes:applicationforbiosensordevelopment[J].BiosensBioelectron,2000,28(2):84－89）第11頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五

發(fā)展

敏感膜如PVC膜、醋酸纖維素膜、聚合物薄膜、蠶絲膜,以及固定化技術、膜電極制備技術的提高離子選擇電極(ISE）、pH電極和氣敏電極的發(fā)展不足之處

較低的信號/噪聲比;線性范圍窄;與ISE（離子選擇電極）相聯系的免疫傳感器不可避免地要受到其他離子的影響。第12頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五電流型免疫傳感器概念

在恒定電壓的情況下監(jiān)測由于抗原抗體結合或繼后反應中電流的變化分類非酶標記電流型免疫傳感器酶標記電流型免疫傳感器第13頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五

2.2.1

非酶標記電流型免疫傳感器標記的電活性物質：

Fe(CN)63-/Fe(CN)34-

、二茂鉻鐵、Pb2+、Zn2+

等．主要是根據抗原和標記抗原對定量抗體進行競爭結合，而標記抗原與抗體結合后氧化或還原電流減少。應用

二茂鐵標記嗎啡，以伏安免疫測定法，測定二茂鐵—嗎啡結合物在抗嗎啡抗體的存在與不存在時的氧化作用，在抗體存在時，由二茂鐵—嗎啡結合物產生的氧化電流減少，這個結果構成對嗎啡均相測定的依據。使用的工作電位為500mv，因此很容易使其他藥物氧化，選擇性欠佳。（孫寶元楊寶清主編.傳感器及其應用手冊.北京：機械工業(yè)出版社，2004：348）第14頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五劉志國用納米金的優(yōu)良吸附性能和褐藻酸鈉的強負電性，將褐藻酸鈉通過胱胺共價修飾到納米金表面形成褐藻酸鈉-納米金復合物（ASN）標記T3抗體（三碘甲狀腺氨酸抗體）；用為Fe(CN)63-/4-電化學探針，用循環(huán)伏安法獲取金電極表面微環(huán)境改變的電流信息來檢測T3抗體，檢測的線性范圍為100-1600ng/ml，檢出限為45ng/ml

（基于褐藻酸鈉-納米金復合物作非酶標記的新型電化學免疫傳感器的研制.理化檢驗-化學分冊，2004，40(8）:445-449）第15頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五2.2.2酶標記電流型免疫傳感器第16頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五2.2.2酶標記電流型免疫傳感器酶標記電流型免疫分析原理：主要是競爭法和夾心法前者是用酶標抗原與樣品中的抗原競爭結合電極上的抗體，催化氧化還原反應，產生電活性物質而引起電流變化，從而可測得樣品中抗原濃度。后者則是在樣品中的抗原與電極上的抗體結合后，再加酶標抗體與樣品中的抗原結合，形成夾心結構，從而催化氧化還原反應產生電流值變化。第17頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五電流型酶標記免疫傳感器的工作原理第一代酶標記電流型免疫傳感器以非電活性物質如O2作為氧化還原的電子受體為代表。先用競爭法或夾心法葡萄糖氧化酶或過氧化物酶標記物結合到膜或電極上,再通過氧電極測量葡萄糖轉化為葡萄糖酸中消耗的氧,或過氧化氫分解中產生的氧。第18頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五以過氧化氫酶作為標記酶來說明其工作原理(圖10—56)：

(1)在測定溶液中加人標記過氧化氫酶抗原，然后將抗體膜免疫傳感器插入上述溶液中，未標記抗原(被測物)和標記抗原與膜上的抗體發(fā)生競爭結合；

(2)洗去未反應的抗原；

(3)將傳感器插人測定酶活性的溶液中，這時傳感器顯示的電流值是由測定液中溶存氧量決定的；

(4)向溶液中加人定量的H2O2，結合在膜上的過氧化氫酶使H2O2分解產生O2,傳感器的電流值增大。

(5)據此可以測定IgG、HCG、甲胎蛋白、茶堿和胰島素等。第19頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五易受樣品溶解氧及pH的影響,工作電位較高,背景較差。雖然通入氣體氬能有效消除溶解氧,但無形中又增添了許多麻煩。第20頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五第二代酶標記電流型免疫傳感器使用電活性物質替代分子O2,這些電活性物質包括二茂鐵衍生物、苯醌、氯醌、亞甲基藍、血紅素等。應用：Ciana選擇對羥基磷酸苯為堿性磷酸酶的底物,結合FIA(流動注射分析)使AFP(α-甲胎蛋白)檢測下限達到0.07ng/ml。(CianaLD,BernaccaG,NittiCD,etal.Highlysensitiveamperometricenzymeimmunoassayforα-fetoproteininhumanserum[J].JImmunolMethods,1996,193(1):51-62.)第21頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五優(yōu)點酶促反應放大，靈敏度高不足多次洗滌分離操作、酶標容易失活、費時和重現性較差等第22頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五2.3

電導型免疫傳感器原理化學反應產生或消耗的離子,能使溶液的導電能力發(fā)生改變。應用1996年Yagiuda用電導法測定了尿中的嗎啡.(YagiudaK,HemmiA,ItoS,etal.Developmentofconductivity-basedimmunosensorforsensitivedetectionofmethamphetamine(stimulantdrug)inhumanurine[J].BiosensBioelectrion,1996,11(8):703-707.)2001年Diiksma用交流阻抗法測定了γ－干擾素,下限達到0.02fg/ml。(DiiksmaM,KampB,HoogvlietJC,etal.Developmentofanelectrochemicalimmunosensorfordirectdetectionofinterferon-γattheattomolarlevel[J].AnalChem,2001,73(3):901-907)電導法易受被測樣品離子強度和緩沖液容積的影響,并且難以克服非特異吸附第23頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五determinationofMAintheconcentrationrange1-10μg/mlwaspossiblewithinabout15minforeachsample.determinethecriticalconcentration(1μg/ml)ofMAinhumanurine.第24頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五電容型免疫傳感器

其信號轉換器由一對處于流體環(huán)境的導電體組成。識別分子固定在電極上,相關檢測物及液體的移動引起介電常數的改變,導致電容的變化?？梢杂糜趯崟r檢測免疫反應此類傳感器的報道甚少。第25頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五發(fā)展及展望發(fā)展尋找更合適的固定方法和固定材料,探求更靈敏穩(wěn)定的標記系統(tǒng)和電活性物質,追求更完美的信號檢出系統(tǒng)。電極表面的設計是提高電極壽命并增強反應信號的重要因素原因：在免疫反應發(fā)生時，抗原和抗體的結合會導致工作電極表面微環(huán)境的改變，宏觀上則表現為電流、電壓、電導率等電化學信息的變化第26頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五用戊二醛交聯法在鉑或銀電極上固定IgG抗體,電位差△E與抗原濃度C之間存在著良好的線性關系,回收率高,使用儀器裝置簡單,可重復使用（孫寶元楊寶清主編.傳感器及其應用手冊.北京：機械工業(yè)出版社，2004：348）第27頁，共33頁，2022年，5月20日，11點37分，星期五Louis等在用巰基烷烴保護金電極減少雜蛋白的非特異吸附又不降低其導電能力的同時,用含巰基的硅烷作偶聯劑將鏈霉親合素定向固定在金電極表面的SiO2層,使之能夠與生物素化抗原精確結合,效果很好。（TiefenauerLX,KossekS,PadesteC,etal.Towardsamperometricimmunosensordevices[J].BiosensBioelectron,1997,12(3):213－223.）Diiksma指出,如果使用短鏈的烷基硫醇效果更佳。(DiiksmaM,KampB,HoogvlietJC,etal.Developmentofanelectrochemicalimmunosensorfordirectdetectionofinterferon-γattheattomolarlevel[J].AnalChem,2001,73(3):901-907)Liu用高氟磺化陽離子樹脂處理玻碳圓盤電極,結合多聚苯胺,偶聯葡萄球菌蛋白A,定向固定兔IgG,脲酶標記山羊抗兔IgG,對兔IgG的測定線性范圍很寬(50～2000ng/ml）（LiuCH,LiaoKT,HuangHJ,Amperometricimmu