病毒抗原與抗體檢測(cè)技術(shù)

關(guān)于病毒抗原與抗體檢測(cè)技術(shù)第1頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五一、抗原—抗體反應(yīng)特異性高可逆氫鍵、范德華力、靜電吸引力可見抗原-抗體比例適宜，復(fù)合物相成團(tuán)第2頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、影響反應(yīng)的因素電解質(zhì)pH≥7時(shí)，適當(dāng)電解質(zhì)使其結(jié)合可見凝集團(tuán)或沉淀溫度37℃溫度升高，反應(yīng)加快<56℃酸堿度pH6~8接近等電點(diǎn)時(shí)易出現(xiàn)假陽性第3頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五第一節(jié)免疫熒光技術(shù)ImmunofluorescenceassayIFA能解決：是什么在哪里有多少熒光激發(fā)光譜發(fā)射光譜熒光效率熒光壽命熒光猝滅熒光偏振第4頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五第一節(jié)免疫熒光技術(shù)熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)490～495nm520～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測(cè)定四乙基羅丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)550nm620nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT藻紅蛋白（PE）490-560nm595nm（紅色）雙標(biāo)記FAT、流式細(xì)胞術(shù)7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（藍(lán)色）雙標(biāo)記或多標(biāo)記FATEu3+螯合物340nm613nm時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定第5頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、免疫熒光試驗(yàn)（一）原理用熒光標(biāo)記物標(biāo)記病毒抗原或抗體，作為分子探針，檢查細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)的病毒抗體或抗原。熒光標(biāo)記物受激發(fā)光照射后發(fā)光，用熒光顯微鏡觀察，可確定病毒種類、定位、定量。第6頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、免疫熒光試驗(yàn)（二）類型熒光抗體法熒光抗原法免疫細(xì)胞（組織）化學(xué)技術(shù)第7頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、免疫熒光試驗(yàn)（三）方法制備標(biāo)本制備熒光抗體熒光抗體染色熒光顯微鏡檢查第8頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、免疫熒光試驗(yàn)1.制作病毒染色標(biāo)本培養(yǎng)敏感細(xì)胞（細(xì)胞爬片）↓種毒

↓固定、干燥丙酮第9頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、免疫熒光試驗(yàn)1.制作病毒染色標(biāo)本臨床樣本（非固型組織）↓涂片↓固定、干燥第10頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、免疫熒光試驗(yàn)1.制作病毒染色標(biāo)本尸檢樣品（3~5mm）

↓↓↓脫水脫色冰凍切片印片↓↓石蠟固定、脫蠟丙酮固定、干燥第11頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、免疫熒光試驗(yàn)2.熒光抗體制備制備抗體用高純度病毒免疫動(dòng)物獲取血清，分離IgG，提純

家兔、綿羊、山羊高特異性高親和力第12頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、免疫熒光試驗(yàn)2.熒光抗體制備標(biāo)記熒光素共價(jià)鍵結(jié)合抗體+熒光素↓4℃持續(xù)攪拌數(shù)小時(shí)純化（離心、透析、過濾）第13頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、免疫熒光試驗(yàn)3.鑒定制成的熒光抗體以FITC為例熒光（F）蛋白（P）結(jié)合率調(diào)整制備液至A280mm=12.87×A495mm

A280mm-0.35×A495mm比值越大，抗體結(jié)合熒光素越多F/P=第14頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、免疫熒光試驗(yàn)3.鑒定制成的熒光抗體測(cè)定抗體效價(jià)：雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)抗體特異性：吸收試驗(yàn)、抑制試驗(yàn)抗體特異性染色滴度：倍比稀釋第15頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、免疫熒光試驗(yàn)4.熒光抗體染色直接法第16頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、免疫熒光試驗(yàn)4.熒光抗體染色間接法第17頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、免疫熒光試驗(yàn)4.熒光抗體染色補(bǔ)體法熒光標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體雙標(biāo)記法兩種熒光素抗體檢測(cè)兩種抗原第18頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、免疫熒光試驗(yàn)5.設(shè)立對(duì)照區(qū)分特異性和非特異性染色標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照熒光抗體對(duì)照陽性抗原對(duì)照阻斷試驗(yàn)第19頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五三、免疫熒光顯微鏡技術(shù)熒光顯微鏡利用一定波長的激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長的熒光，對(duì)樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測(cè)。

第20頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五三、免疫熒光顯微鏡技術(shù)光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素?zé)魹V光片：隔熱、激發(fā)和吸收濾光片光路：透射光、落射光聚光器：明視野、暗視野和相差熒光聚光器鏡頭：消色差鏡頭第21頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五三、免疫熒光顯微鏡技術(shù)透射光：照明光線從標(biāo)本下經(jīng)聚光器透過標(biāo)本進(jìn)入物鏡。落射光：照明光線從標(biāo)本上經(jīng)垂直照明器落射到標(biāo)本，經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡。第22頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五四、時(shí)間分辯免疫熒光技術(shù)Time-resolvedfluoroimmunoassayTR-FIA（一）原理自發(fā)熒光壽命短:1ns～10ns鑭系元素壽命長:10μs～1000μs短壽命熒光完全衰變后再測(cè)定鑭系元素特異熒光銪Ed3+锝Tb3+釤Sm3+鏑Dy3+第23頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五四、時(shí)間分辯免疫熒光技術(shù)（二）方法類型雙抗體夾心法固相抗體和Eu3+標(biāo)記抗體與待檢抗原結(jié)合，形成固相抗體-待檢抗原-Eu3+標(biāo)記抗體復(fù)合物，酸性增強(qiáng)液下，Eu3+解離，340nm激發(fā)光下發(fā)射613nm熒光。第24頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五四、時(shí)間分辯免疫熒光技術(shù)（二）方法類型固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法待檢抗原和Eu3+標(biāo)記抗原與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,溫育洗滌后在固相中加入熒光增強(qiáng)液,測(cè)定熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法待檢抗原和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合定量的Eu3+標(biāo)記抗體，溫育洗滌后在固相中加入熒光增強(qiáng)液,測(cè)定熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。第25頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五第二節(jié)酶免疫技術(shù)Enzymeimmunoassay抗原抗體反應(yīng)特異性酶高效催化反應(yīng)專一性

第26頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五第二節(jié)酶免疫技術(shù)酶底物顯色反應(yīng)

測(cè)定波長

辣根過氧化物酶HRP

鄰苯二胺OPD

四甲替聯(lián)苯胺TMB

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色

黃色

棕色

蘭色藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶AP4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色

400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420第27頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五第二節(jié)酶免疫技術(shù)酶標(biāo)記戊二醛交聯(lián)法過碘酸氧化法醛基酶蛋白質(zhì)HRP過碘酸鹽HRP醛基第28頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五第二節(jié)酶免疫技術(shù)固相載體塑料制品微粒膜載體NC膜、尼龍膜第29頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五第二節(jié)酶免疫技術(shù)包被與封閉包被適宜濃度蛋白質(zhì)封閉二次包被填補(bǔ)空隙小牛血清第30頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)Enzyme-linkedimmunosorbentassayELISA酶標(biāo)記抗體（抗原）與待測(cè)抗原（抗體）發(fā)生特異性反應(yīng)，加入酶底物，通過酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)，對(duì)待測(cè)抗原（抗體）進(jìn)行定位、定性或定量分析。第31頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五第32頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五間接法檢測(cè)抗體+++固相抗原標(biāo)本酶標(biāo)抗體底物顯色第33頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五雙抗體夾心法檢測(cè)抗原+++固相抗體標(biāo)本酶標(biāo)抗體底物顯色第34頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五競(jìng)爭(zhēng)法可檢測(cè)抗原、抗體YYY+YYY+YYY參考管酶標(biāo)抗原YYY+YYY+YYY待測(cè)管酶標(biāo)抗原抗原第35頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五捕獲法檢測(cè)IgM抗體+++抗IgM標(biāo)本抗原酶標(biāo)抗體顯色

（含IgM）+第36頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五三、免疫酶染色試驗(yàn)ImmunoenzymaticstainingtestIEST酶標(biāo)抗體（抗原）—抗原（抗體）復(fù)合物

底物

有色底物第37頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五三、免疫酶染色試驗(yàn)細(xì)胞免疫酶染色均相酶免疫測(cè)定——無需分離游離與結(jié)合的酶標(biāo)記物酶標(biāo)記物結(jié)合后改變酶活性非均相酶免疫測(cè)定—需分離游離與結(jié)合的酶標(biāo)記物液相：用二抗或沉淀去除游離酶標(biāo)記物固相：ELISA第38頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五第三節(jié)放射免疫技術(shù)RadioimmunoassayRIA利用放射性核素靈敏精確性與抗原抗體反應(yīng)特異性相結(jié)合進(jìn)行定量分析放射免疫核素標(biāo)記抗原與未標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合特異性抗體免疫放射核素標(biāo)記抗體結(jié)合待測(cè)抗原R.S.Yalow第39頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五第三節(jié)放射免疫技術(shù)125I、131I、3H、14C標(biāo)記純化鑒定放射性免疫活性第40頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五第三節(jié)放射免疫技術(shù)第41頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五第三節(jié)放射免疫技術(shù)放射免疫競(jìng)爭(zhēng)法第42頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五++++++++BoundFreeAgAb6/8=0.754/8=0.52/8=0.251/8=0.125B/B+F第43頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五第三節(jié)放射免疫技術(shù)放射免疫以未結(jié)合的Ag*為F，Ag*Ab復(fù)合物為B，則B/F或B/(B＋F)與Ag的量變存在著函數(shù)關(guān)系－劑量反應(yīng)曲線第44頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五第四節(jié)血清學(xué)試驗(yàn)中和試驗(yàn)血凝/血凝抑制試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)第45頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五一、中和試驗(yàn)neutralizationtest體外將病毒與特異性抗體混合并發(fā)生反應(yīng)，再將混合物接種至敏感的宿主體內(nèi)，然后測(cè)定殘存病毒感染力的方法。

中和抗體第46頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五一、中和試驗(yàn)（一）原理中和抗體存在使病毒不能吸附和穿入宿主細(xì)胞，使病毒失去感染力。當(dāng)病毒與抗體混合后，接種敏感宿主細(xì)胞再觀察敏感宿主的情況，即觀察殘存的病毒對(duì)宿主的感染力。第47頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五一、中和試驗(yàn)（二）方法步驟病毒---已知滴度，并有感染力測(cè)滴度：細(xì)胞培養(yǎng)，將病毒10倍稀釋接種敏感細(xì)胞或動(dòng)物，觀察CPE或動(dòng)物感染情況，確定滴定終點(diǎn)以CCID50或LD50表示標(biāo)準(zhǔn)病毒試驗(yàn)濃度：100CCID50/單位體積或100LD50/單位體積第48頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五一、中和試驗(yàn)抗體用細(xì)胞培養(yǎng)法測(cè)病毒抗體的滴度：將倍比稀釋的病毒抗血清液與等量的標(biāo)準(zhǔn)病毒液混合，接種敏感細(xì)胞，觀察CPE。病毒抗體滴度的確定：抗血清保護(hù)細(xì)胞免受病毒感染的最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)。抗體滴度的含義：抑制CPE的最高稀釋倍數(shù)的抗血清中，每單位體積含一個(gè)抗體單位。第49頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五一、中和試驗(yàn)舉例如觀察結(jié)果是1：10至1：320抗血清均能抑制病毒的CPE，也就是當(dāng)抗血清稀釋到320倍時(shí)，0.1ml抗血清含有1個(gè)抗體單位。請(qǐng)問：1：160及1：40含有幾個(gè)抗體單位？標(biāo)準(zhǔn)抗體濃度為20個(gè)抗體單位/0.1ml第50頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五一、中和試驗(yàn)宿主細(xì)胞培養(yǎng):觀察CPE和空斑（最理想和常用）雞胚：觀察雞胚的死亡（流感）、絨毛尿囊腔上痘瘡及血凝現(xiàn)象（天花、牛痘、HSV）動(dòng)物（小白鼠）:成年和幼鼠易感，如乙腦病毒、森林腦炎病毒第51頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五一、中和試驗(yàn)（二）方法步驟固定血清—稀釋抗病毒法檢測(cè)病毒及其滴度固定病毒—稀釋抗血清法檢測(cè)血清效價(jià)第52頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五一、中和試驗(yàn)（二）方法步驟固定血清—稀釋病毒法用中和試驗(yàn)方法鑒定病毒時(shí)，將不同稀釋倍數(shù)的病毒與標(biāo)準(zhǔn)的抗血清(20個(gè)抗體單位/單位體積)混合、孵育，使二者充分反應(yīng)，然后將混合液接種到敏感宿主體內(nèi)，觀察試驗(yàn)結(jié)果。第53頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五固定血清稀釋病毒法試驗(yàn)材料宿主:敏感細(xì)胞和動(dòng)物、雞胚標(biāo)準(zhǔn)抗病毒血清(20個(gè)抗體單位/0.1ml)病毒分離物試驗(yàn)步驟不同濃度病毒液與等量的抗病毒血清混合細(xì)胞培養(yǎng)液倍比稀釋病毒不同濃度病毒液與等量陰性血清混合接種細(xì)胞,設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，CO2孵箱觀察CPE中和試驗(yàn)病毒CCID50：當(dāng)抗血清組的CCID50與陰性組之差的對(duì)數(shù)大于2,才說明中和試驗(yàn)陽性。第54頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五固定血清稀釋病毒法陰性血清病毒CCID50的計(jì)算病毒稀釋度CPE孔數(shù)/接種孔數(shù)

累計(jì)數(shù)CPE數(shù)存活數(shù)CPE陽性比例CPE陽性率（％）10-45/510010/10100.010-54/5515/683.010-61/5151/617.010-70/50100/10

0第55頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五固定血清稀釋病毒法距離比例＝（大于50%的CPE陽性率—50%）/（大于50%的CPE陽性率－小于50%的CPE陽性率）＝（83－50）/（83－17）＝0.5lgCCID50=大于50%的CPE陽性率血清稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)=lg10-5+0.5×lg0.1=-5.5,其反對(duì)數(shù)是10-5.5.陰性血清組的病毒CCID50為10-5.5/0.1ml。第56頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五固定血清稀釋病毒法陽性血清病毒CCID50的計(jì)算病毒稀釋度CPE孔數(shù)/接種孔數(shù)累計(jì)數(shù)CPE數(shù)存活數(shù)CPE陽性比例CPE陽性率（％）10-25/510010/10100.010-33/5525/771.010-42/5252/729.010-50/50100/10

0第57頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五固定血清稀釋病毒法距離比例＝（大于50%的CPE陽性率—50%）/（大于50%的CPE陽性率－小于50%的CPE陽性率）＝（71－50）/（71－29）＝0.5大于50%的CPE陽性率血清稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)=lg10-3+0.5×lg0.1=-3.5,其反對(duì)數(shù)是10-3.5。陽性血清組的病毒CCID50為10-3.5/0.1ml。因抗血清組的CCID50為10-3.5，陰性血清組的病毒CCID50為10-5.5,所以10-3.5-10-5.5=2,表明分離的病毒是與中和抗體相對(duì)應(yīng)的病毒。第58頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五一、中和試驗(yàn)（二）方法步驟固定病毒—稀釋血清法用于血清抗體滴度的測(cè)量。用已知病毒檢測(cè)位置抗體滴度。100CCID50/單位體積的病毒+連續(xù)倍比稀釋血清→孵育1h→接種敏感宿主→觀察不同稀釋度的血清保護(hù)宿主感染病毒的情況第59頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五固定病毒稀釋血清法試驗(yàn)材料:敏感宿主標(biāo)準(zhǔn)滴定的病毒100CCID50/0.1ml急性期或恢復(fù)期血清試驗(yàn)步驟細(xì)胞培養(yǎng)液倍比稀釋急性或恢復(fù)期血清取不同稀釋濃度血清與標(biāo)準(zhǔn)病毒混合并37℃孵育1h取混合液0.2ml接種細(xì)胞,CO2孵箱觀察CPE50％血清中和終點(diǎn)：50%細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞病變的血清稀釋度第60頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五固定病毒稀釋血清法恢復(fù)期血清中和病毒的結(jié)果血清稀釋度CPE孔數(shù)/接種孔數(shù)累計(jì)數(shù)CPE數(shù)無CPE數(shù)CPE陽性比例CPE陽性率（％）1：16(10-1.2)0/4080/80.01：32(10-1.5)1/4141/520.01：64(10-1.8)3/4414/580.01：128(10-2.1)4/4808/8100.0第61頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五固定病毒稀釋血清法距離比例＝（50%—小于50%的CPE陽性率）/（大于50%的CPE陽性率－小于50%的CPE陽性率）＝（50－20）/（80－20）＝0.550%血清中和終點(diǎn)的范圍:1:32與1:64之間。中和終點(diǎn)濃度=小于50%的CPE陽性率血清稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)=lg10-1.5+0.5×lg0.5=-1.65,其反對(duì)數(shù)是1/45即50%血清中和終點(diǎn)為1:45含義：1:45稀釋度的恢復(fù)期血清可保護(hù)50%細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)。第62頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五二、血凝/血抑血凝HA第63頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五血凝抑制HI第64頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五

123456789101112血凝試驗(yàn)HA試驗(yàn)方法選擇96孔板（V型）病毒液倍比稀釋稀釋好后加雞紅細(xì)胞混勻后±20℃室溫靜置30min+50μlPBS吸出一半1:21:221:231:24+100μl病毒液+50μl雞紅細(xì)胞吸棄一半第65頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五血凝試驗(yàn)HA血凝滴度：以出現(xiàn)++的稀釋度的倒數(shù)為判定終點(diǎn),為1個(gè)血凝單位。凝集效價(jià)：能使血球產(chǎn)生++凝集的病毒最高稀釋度為病毒的凝集效價(jià)，即0.5ml病毒液含1個(gè)血凝單位。第66頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五三、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)補(bǔ)體：正常人和動(dòng)物血清與組織液中的一組經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)，輔助抗體介導(dǎo)免疫溶菌和溶血作用。對(duì)熱不穩(wěn)定。綿羊紅細(xì)胞與抗綿羊紅細(xì)胞抗體（溶血素）作用形成溶血素致敏的綿羊紅細(xì)胞。補(bǔ)體可使這種致敏紅細(xì)胞溶解。補(bǔ)體可結(jié)合任何病毒抗原抗體復(fù)合物第67頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五三、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)如果反應(yīng)系統(tǒng)中存在待測(cè)的抗體（或抗原），則抗原抗體發(fā)生反應(yīng)后可結(jié)合補(bǔ)體；再加入指示系統(tǒng)時(shí)，而不出現(xiàn)溶血，是為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽性。如果反應(yīng)系統(tǒng)中不存在的待檢的抗體（或抗原），則在液體中仍有游離的補(bǔ)體存在，當(dāng)加入指示系統(tǒng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)溶血，是為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陰性。第68頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五三、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)有3個(gè)系統(tǒng)：①反應(yīng)系統(tǒng)，即已知的抗原（或抗體）與待測(cè)的抗體（或抗原）；②補(bǔ)體系統(tǒng)；③指示系統(tǒng)，即SRBC與相應(yīng)溶血素，形成致敏紅細(xì)胞。第69頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五三、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)病毒抗原從組織培養(yǎng)、雞胚和動(dòng)物試驗(yàn)中獲得病毒抗原應(yīng)適當(dāng)提純，純度愈高，特異性愈強(qiáng)如使用粗制抗原時(shí)，須經(jīng)同樣處理的正常組織作抗原對(duì)照，以識(shí)別待檢血清中可能存在的、對(duì)正常組織成分的非特異性反應(yīng)

第70頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五三、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)抗體免疫用的病毒抗原最好不是同一細(xì)胞或動(dòng)物，以免發(fā)生交叉反應(yīng)血清樣品應(yīng)加熱滅活處理，消除補(bǔ)體活性和非特異性抗補(bǔ)體活性人和豚鼠滅活溫度為56℃；家兔和馬滅活溫度為65℃第71頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五三、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)補(bǔ)體檢測(cè)人和哺乳動(dòng)物血清應(yīng)用豚鼠新鮮血清補(bǔ)體臨用前使用1％SRBC制備綿羊頸靜脈采血，生理鹽水洗滌溶血素用綿羊紅細(xì)胞免疫家兔獲得效價(jià)達(dá)到1:4000可獲得56℃30分鐘滅活，加甘油后長期保存稀釋液含鈣鎂離子的生理鹽水，可維持補(bǔ)體的穩(wěn)定第72頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五三、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)溶血素的滴定先將溶血素稀釋成1:100~1:1000,再依次加入溶血素0.1ml，鈣鎂鹽水0.2ml，1:60補(bǔ)體0.2ml、1％綿羊紅細(xì)胞0.1ml，混勻后再水浴結(jié)果判定：完全溶血的試管液體紅色透明，離心后見少許細(xì)胞;不溶血的試管液體混濁，放置后見紅細(xì)胞沉淀，上清無色透明溶血素效價(jià)的測(cè)定;以完全溶血的最高稀釋倍數(shù)確定為1個(gè)單位本例1個(gè)單位的溶血素的效價(jià)為1：4000；正式使用2個(gè)單位第73頁，共79頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期五三、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)補(bǔ)體的滴定補(bǔ)體不穩(wěn)定，每次試驗(yàn)前需滴定管號(hào)1：60補(bǔ)體鈣鎂鹽水（ml)2U抗原(ml)1％致敏SRBC(ml)結(jié)果10.040.260.10.2不溶20.060.240.10.2不溶30.080.220.10.2微溶40.100.200.10.2微溶50.120.180.10.2全溶60.140.160.10.2全溶70.140.