分子生物學技術-第四章 核酸分子雜交技術

1核酸分子雜交技術

NucleicacidHybridization

分子生物學技術?第四章2主要內(nèi)容第一節(jié)核酸雜交的基本原理第二節(jié)核酸探針第三節(jié)核酸分子雜交的影響因子第四節(jié)核酸分子雜交的類型3第一節(jié)核酸雜交的基本原理一、核酸變性二、核酸復性4第一節(jié)核酸雜交的基本原理

核酸的結構

一級結構：核苷酸的排列循序穩(wěn)定鍵：磷酸二酯鍵二級結構：雙螺旋結構穩(wěn)定鍵：氫鍵、堿基堆積力、疏水作用高級結構：染色體5CGA一級結構二級結構高級結構6第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性

變性（denaturation）:指維系核酸雙鏈互補堿基對之間的氫鍵斷裂變成單鏈的過程，并不涉及共價鍵的斷裂。?；瘜W鍵變化：維持雙螺旋穩(wěn)定的氫鍵和疏水鍵發(fā)生斷裂，斷裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的化學結構變化：DNA變性改變了其空間結構，不涉及到其一級結構的改變78加熱極端的pH有機試劑（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）DNA的變性因素：凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素都可以成為變性的條件第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性9變性DNA的性質：變性能導致DNA的一些理化性質及生物學性質發(fā)生改變第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性溶液粘度降低DNA雙螺旋是緊密的“剛性”結構，變性后代之以“柔軟”無規(guī)則單股線性結構，DNA粘度明顯下降溶液旋光性發(fā)生改變變性后DNA分子的對稱性及局部構型改變紫外吸收增加DNA變性后，DNA溶液的紫外吸收增強雙鏈DNA＜單鏈DNA＜單核苷酸10第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性解鏈曲線通常利用DNA變性后在波長260nm處吸光度（A260）的增加來監(jiān)測DNA變性的過程。如果以溫度對A260的關系作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。典型DNA變性曲線呈S型11融解溫度（meltingtemperature,Tm）：DNA變性發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)，通常把熱變性過程中DNA變性一半所需要的溫度稱為融解溫度DNA的Tm值一般在82℃~95℃之間。

第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性融解溫度（Tm）特點：爆發(fā)式：熱變性是在變性溫度范圍內(nèi)突發(fā)的躍變過程，很像結晶達到熔點時的融化現(xiàn)象，故名融解溫度狹窄性：變性溫度范圍很小12Tm的影響因素：

1．DNA分子大小、均一性

2.堿基的組成

3．溶液的離子強度

4．pH值

5．變性劑

DNA復雜度對Tm的影響第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性13DNA的均一性有二種含義DNA分子中堿基組成的均一性：如人工合成的只含有一種堿基對的多核苷酸片段，與天然DNA比較，其Tm值范圍就較窄。因前者變性時氫鍵斷裂幾乎可“齊同”進行①（AAA）n②（AT）n③（ATC）n

④（ATCG）n⑤（ATCGA）n待測DNA樣品組成的均一性：如樣品中只含有一種病毒DNA，其Tm值范圍較窄，若混有其它來源的DNA，則Tm值范圍較寬第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性14DNA的（G+C）含量在溶劑固定的前提下，Tm值的高低取決于DNA分子中的（G+C）的含量（G+C）含量越高，G-C堿基對越多，Tm值越高。因G-C堿基對具有3對氫鍵，而A-T堿基對只有2對氫鍵，DNA中（G+C）含量高顯然更能增強結構的穩(wěn)定性，破壞G-C間氫鍵需比A-T氫鍵付出更多的能量。

第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性15融解溫度的影響因素：

溶液的離子強度溶液中離子與DNA分子中磷酸基團形成離子鍵，需要較高溫度才能使DNA變性離子強度較低時，Tm值較低，而且解鏈的溫度范圍也較寬第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性16融解溫度的影響因素：

pH值pH值影響氫鍵的形成pH值在5-9范圍內(nèi)，Tm值變化不明顯。當溶液pH值小于3時或大于11時，均不利于氫鍵的形成，DNA容易變性第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性17融解溫度的影響因素：

變性劑干擾堿基堆積力和氫鍵的形成，因此可以降低Tm值常用的變性劑有甲酰胺、尿素、甲醛等

第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性18雜交雙鏈（hybridduplex）DNA-DNADNA-RNARNA-RNA第一節(jié)核酸雜交的基本原理

二、核酸復性復性（renaturation）：當變性條件緩慢去除后，兩條彼此分開的互補單鏈重新締合成雙螺旋結構的過程，是變性的一種逆轉過程。退火（annealing）：熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，此過程稱之為“退火”19

復性影響因素：

DNA的復性不僅受溫度影響，還受DNA自身特性等其它因素的影響第一節(jié)核酸雜交的基本原理

二、核酸復性溫度和時間DNA濃度DNA分子大小和復雜度離子強度20復性影響因素：

1.溫度和時間一般認為比Tm低25℃左右的溫度是復性的最佳條件，越遠離此溫度，復性速度就越慢復性時溫度下降必須是一緩慢過程，若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫（如4℃以下），復性幾乎是不可能的第一節(jié)核酸雜交的基本原理

二、核酸復性21復性影響因素：

2.DNA濃度

DNA復性的第一步是兩個單鏈分子間的相互作用“成核”“成核”速度與DNA濃度的平方成正比溶液中DNA分子越多，相互碰撞結合“成核”的機會越大第一節(jié)核酸雜交的基本原理

二、核酸復性22復性影響因素：

3.DNA分子大小和復雜度用非重復堿基對（bp）數(shù)表示核酸分子的復雜性。多聚（A）的復雜性為1，重復的（ATGC）n組成的多聚體的復雜性為4，分子長度是105核苷酸的非重復DNA序列的復雜性為105原核生物基因組均為非重復順序，故以非重復核苷酸對表示的復雜性直接與基因組大小成正比真核生物基因組中的非重復片段也是如此第一節(jié)核酸雜交的基本原理

二、核酸復性23DNA順序的復雜性對復性的影響簡單順序的DNA分子，如多聚（A）和多聚（T）這二種單鏈序列復性時，互補堿基的配對較易實現(xiàn)順序復雜的DNA，如小牛DNA的非重復部分（一般以單拷貝存在于基因組中），這種復雜的特定序列要實現(xiàn)互補，顯然要比上述簡單序列困難得多第一節(jié)核酸雜交的基本原理

二、核酸復性24復性影響因素：

4.離子強度對復性的影響增加鹽濃度可增進互補鏈合成雙鏈的速度，鹽中和DNA單鏈中磷酸基團的負電荷，減少互補鏈靜電排斥第一節(jié)核酸雜交的基本原理

二、核酸復性25Cot值

在核酸復性研究中，定義了一個Cot的術語，與DNA復雜度之間的關系。Co為單鏈DNA的起始濃度t是以秒為單位的時間復性速度一般可以用Cot1/2來衡量，Cot1/2表示單鏈DNA的起始濃度與復性一半所需時間之積（mol.s/L），與復性速率成反比，Cot1/2增大意味著反應速度變慢。第一節(jié)核酸雜交的基本原理

二、核酸復性26第一節(jié)核酸雜交的基本原理

三、核酸分子雜交基本原理核酸雜交示意圖

利用核酸變性和復性的性質，使具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下按照堿基互補配對原則形成異質雙鏈的過程。分子雜交可以發(fā)生在同源或異源的DNA鏈與DNA鏈之間，也可在RNA鏈與DNA鏈之間形成。

27雜交的本質：就是在一定條件下使互補核酸鏈實現(xiàn)復性分子雜交技術：利用探針（probe）與靶DNA（RNA）雜交，特異性識別靶DNA（RNA）第一節(jié)核酸雜交的基本原理

三、核酸分子雜交基本原理28第二節(jié)核酸探針一、核酸探針的種類二、核酸探針的標記三、核酸探針的純化四、核酸探針的檢測29第二節(jié)核酸探針

一、核酸探針的種類核酸探針（nucleicacidprobe)：是特定核苷酸序列（單鏈，被標記）與特定靶基因序列發(fā)生特異性互補（可雜交）雜交后可用特殊方法檢測的已知被標記的核酸分子30高度特異性靈敏度高易于標記和檢測且穩(wěn)定制備方便第二節(jié)核酸探針

一、核酸探針的種類確定特定核苷酸序列（與靶序列互補）標記（檢測方法）選擇探針的最基本的要求31第二節(jié)核酸探針

一、核酸探針的種類核酸探針的類型基因組DNA探針cDNA探針RNA探針寡核苷酸探針32來源：這類探針來源于某種生物的基因組，多為某一基因的全部或部分序列制備方法:基因克隆的方法聚合酶鏈反應(PCR)特點:克隆在載體中的DNA片段，可無限繁殖，取之不盡PCR制備探針簡便和省時相對RNA而言，DNA探針不易降解，標記方法也較成熟第二節(jié)核酸探針

一、核酸探針的設計-基因組DNA探針33cDNA（complementaryDNA）：是指與mRNA互補的DNA分子特點:不存在內(nèi)含子和高度重復序列，是一種較理想的核酸探針，尤其是用于基因表達的研究排除了RNA酶的影響，現(xiàn)已成為分子生物學實驗室的常規(guī)實驗第二節(jié)核酸探針

一、核酸探針的種類-cDNA探針34RNA探針與靶序列的雜交效率較高，穩(wěn)定性也高RNA分子大多以單鏈形式存在，幾乎不存在互補雙鏈的競爭結合RNA分子中不存在高度重復序列，非特異性雜交少，雜交后未雜交的探針分子水解可用RNA酶去除，本底的干擾低。RNA探針有易降解和標記方法復雜等缺點，限制了其廣泛應用。

第二節(jié)核酸探針

一、核酸探針的種類-RNA探針35

特點:探針長度較短（一般為10～50bp）人工合成（避免天然探針的缺點）尤其適合點突變的檢測由于探針的長度較短，特異性較低，雜交信號較弱，但經(jīng)過精心設計仍可設計出非常特異的寡核苷酸探針

第二節(jié)核酸探針

一、核酸探針的種類-寡核苷酸探針36寡核苷酸探針設計原則探針長度：一般要求在20～50bpG／C含量為40％～60％探針分子中應避免互補序列避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)，一般不能多于4個，如GGGG-或-CCCC-

借助計算機相應軟件與已知的各種基因序列進行同源性比較

第二節(jié)核酸探針

一、核酸探針的種類37理想的探針標記物應具有以下特點特異：靶序列特異穩(wěn)定：標記物與探針結合后，應不影響雜交反應，尤其是雜交特異性、穩(wěn)定性和Tm值靈敏：標記物被檢測無毒：標記物對環(huán)境污染小，對人體無損傷簡便：操作簡單便易：價格低廉第二節(jié)核酸探針

二、核酸探針的標記381.缺口平移法（雙鏈）2．隨機引物法（單鏈）第二節(jié)核酸探針

二、核酸探針的標記-放射性同位素標記

393．DNA探針的末端標記

（1）Klenow大片段的末端標記法

第二節(jié)核酸探針

二、核酸探針的標記-放射性同位素標記

40（2）T4噬菌體多核苷酸激酶標記法（polynucleotidekinase，PNK)，也稱5'-末端標記法

多用于寡核苷酸探針的標記3．DNA探針的末端標記

第二節(jié)核酸探針

二、核酸探針的標記-放射性同位素標記

41

1．生物素標記核酸探針生物素-UTP的結構示意圖

第二節(jié)核酸探針

二、核酸探針的標記-非放射性同位素標記

422．光敏生物素標記核酸探針

光敏生物素結構圖

第二節(jié)核酸探針

二、核酸探針的標記-非放射性同位素標記

3．地高辛標記核酸探針

4．酶標記核酸探針

5．熒光素標記核酸探針

43第二節(jié)核酸探針

三、標記探針的純化探針制備和標記時加入的dNTP是過量，除去游離標記物及其dNTP凝膠過濾層析法利用凝膠的分子篩作用乙醇沉淀法沉淀探針DNA44第二節(jié)核酸探針

四、探針的檢測-放射性同位素探針的檢測

1.放射自顯影將雜交膜與X膠片在暗盒中曝光一定時間2.γ計數(shù)器

雜交膜剪成小塊，真空干燥后轉入閃爍瓶，加入閃爍液，在液閃儀上自動計數(shù)45

1．偶聯(lián)反應

2．顯色反應

(1)酶促顯色法

(2)熒光法

(3)化學發(fā)光法

第二節(jié)核酸探針

四、探針的檢測-非放射性的探針的檢測

46標記物性質標記分子標記方法檢測方法放射性分子

[α32P]dNTPNT、PCR、RP放射自顯影或計數(shù)[γ32P]dNTPTL放射自顯影或計數(shù)35SNT放射自顯影或計數(shù)非放射性分子生物素Bio-11-dUTPNT、PCR、RP酶標親和素或酶標光敏生物素600W可見光照抗生物素抗體顯色生物素化補骨脂素365紫外線照抗生物素抗體顯色酶過氧化物酶化學合成法或直接法直接底物顯色或用酶抗體+底物顯色堿性磷酸酶化學合成法或直接法直接底物顯色或用酶抗體+底物顯色熒光素羅丹明和FITC合成法熒光顯微鏡觀察或酶標抗體+底物顯色半抗原地高辛RP、NT酶標抗體+底物顯色常用核酸探針的標記和檢測第二節(jié)核酸探針

47第二節(jié)核酸探針

四、探針的檢測

48第三節(jié)核酸分子雜交類型一、Southern印跡雜交二、Northern印跡雜交三、菌落雜交 四、斑點雜交 五、原位雜交六、熒光原位雜交七、微板酶聯(lián)雜交

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固相雜交探針被測DNA（RNA）在固體支持物上雜交容易洗膜液相雜交探針被測DNA（RNA）在液體中雜交靈敏度高按照雜交的反應條件分為固相和液相雜交兩類：第三節(jié)核酸分子雜交技術

雜交分類正向雜交（靶序列固定）反向雜交（探針固定）50分子雜交技術一般過程☆探針制備及標記（同位素或非同位素）☆待測核酸樣品制備（分離，純化）☆雜交（液相，固相，原位雜交）☆雜交后處理（去掉非特異雜交分子）☆顯示結果（顯色，發(fā)光，放射自顯影）☆結果分析第三節(jié)核酸分子雜交技術

51核酸分子雜交技術類型

雜交類型檢測目的及范圍Southern印跡雜交檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉移至膜上的DNA分子Northern印跡雜交檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉移至膜上的RNA分子菌落雜交檢測固定在膜上,經(jīng)裂解從細菌體釋放的DNA分子斑點雜交或狹縫雜交檢測固定在膜上的DNA或RNA分子原位雜交檢測細胞或組織中的DNA或RNA分子第三節(jié)核酸分子雜交技術

52DNA變性中和Southern印跡預雜交雜交洗膜檢測

第三節(jié)核酸分子雜交技術

一、Southern印跡雜交

53

毛細管轉移示意圖第三節(jié)核酸分子雜交技術

一、Southern印跡雜交

54電轉移示意圖第三節(jié)核酸分子雜交技術

一、Southern印跡雜交

55Northern印跡(Northernblot)雜交是應用DNA探針檢測特異mRNA的另一種膜上印跡技術是由Alwine于1977年建立的。后經(jīng)Thomas等人改進主要用于分析mRNA分子大小及mRNA的轉錄情況第三節(jié)核酸分子雜交技術

二、Northern印跡雜交56Northern印跡雜交流程圖

第三節(jié)核酸分子雜交技術

二、Northern印跡雜交57與Southern印跡雜交比較：RNA提取過程中需特別注意RNA酶的污染所用的器材最好與Southern印跡實驗的分開使用RNA變性的方法：不能用堿變性，因為堿會水解RNA2’-OH變性劑的作用：防止RNA分子形成發(fā)夾式的二級結構，以保持其單鏈線形狀態(tài)第三節(jié)核酸分子雜交技術

二、Northern印跡雜交58斑點雜交正向：是將待檢樣（DNA、RNA或細胞）直接點到膜上，烘烤固定反向：是將探針固定第三節(jié)核酸分子雜交技術

三、斑點雜交（Dot-blot）59斑點雜交不需電泳和轉膜過程，整個操作過程簡便、快速特別適合做點突變第三節(jié)核酸分子雜交技術

三、斑點雜交（Dot-blot）60線粒體DNA的8個突變位點膜雜交結果32563290331633943593360636183688野生型突變型3290T→C

3593T→C3394T→C3618T→C3316G→A3606A→GC3256TG3316AG3688C第三節(jié)核酸分子雜交技術

三、斑點雜交（Dot-blot）61菌落雜交示意圖第三節(jié)核酸分子雜交技術

四、菌落雜交62原位雜交（Insituhybridization）是以特定標記的已知序列的核酸分子作為探針與細胞或組織切片中