食品中單增李斯特菌檢測(cè)

食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈫魏思?xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性。熟悉單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的分離鑒定方法?；驹韱魏思?xì)胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)歸屬于李斯特菌屬(Listeria)。單核細(xì)胞增生李斯特菌是李斯特菌屬中唯一對(duì)人致病的病菌。李斯特菌是一種細(xì)胞內(nèi)寄生菌，它不僅可能存在于肉類(lèi)產(chǎn)品中，也可能存在于乳制品、蔬菜、沙拉及海產(chǎn)品等日常食物里面。此菌廣泛分布于自然界中，在土壤、排污下水、地表水、青貯飼料、爛菜中均可分離到。人也可作為無(wú)癥狀攜帶者。據(jù)報(bào)道，健康人糞便中該菌的攜帶率為0.6%?16%，4%?8%的水產(chǎn)品、5%?10%的奶及其制品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被該菌污染。李斯特菌能在1?45r的溫度下生存，能在家用電冰箱的冷藏室內(nèi)較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)、繁殖。該菌為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，有的菌體略彎曲，兩端鈍圓，大小約為0.4?0.5nm'0.5?2.0叩。多單在，有時(shí)是V字型排列。無(wú)芽孢，不產(chǎn)生莢膜。在陳舊培養(yǎng)物中或粗糙型菌落的菌體長(zhǎng)度可達(dá)6?20Rm或更長(zhǎng)的絲狀。在20?25°C培養(yǎng)時(shí)可產(chǎn)生2?4根鞭毛而運(yùn)動(dòng)，但在37C培養(yǎng)時(shí)鞭毛發(fā)育不良，無(wú)運(yùn)動(dòng)性。本菌需氧或兼性厭氧，生長(zhǎng)溫度為1?45C，最適溫度為30?37C。對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，可在普通瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但在血瓊脂培養(yǎng)基或胰酪胴瓊脂上生長(zhǎng)更好。加入0.2%?1%(W/V)的葡萄糖及2%?3%(V/V)的甘油生長(zhǎng)更佳。在含1%(W/V)NaCl的復(fù)合培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)。在4C可緩慢增殖，形成菌落約需7d。在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18?24h后，肉湯呈輕度均勻混濁，數(shù)天后形成粘稠沉淀附著于管底，搖動(dòng)時(shí)沉淀呈螺旋狀，繼續(xù)培養(yǎng)可形成顆粒狀沉淀。不形成菌環(huán)、菌膜。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，光滑(S)型可形成直徑0.5?1.5mm、圓形、露滴狀半透明、低隆起、邊緣整齊、表面有細(xì)致紋理的藍(lán)灰色菌落，斜射光照射時(shí)，菌落呈特征性藍(lán)綠光澤。粗糙()型菌落表面起伏不平，邊緣不整齊，細(xì)菌難以乳化。在血液瓊脂培養(yǎng)基上，可形成狹窄的B-溶血環(huán)，常不超出菌落邊緣，移去菌落才可見(jiàn)。弱溶血或疑似溶血菌株可用協(xié)同溶血試驗(yàn)(CAMP)鑒定。半固體培養(yǎng)基：沿穿刺線(xiàn)呈云霧狀，隨后緩慢擴(kuò)散，在培養(yǎng)基表面下3?5mm處呈傘狀。該菌接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陰性。能發(fā)酵多種糖類(lèi)，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，如發(fā)酵葡萄糖、果糖、海藻糖、乳糖、鼠李糖、麥芽糖、山梨糖，不發(fā)酵木糖、阿拉伯糖、棉子糖、蔗糖、甘露醇、蜜二糖、菊糖、纖維二糖和側(cè)金盞花醇。不利用枸櫞酸鹽。不還原硝酸鹽，不產(chǎn)生靛基質(zhì)和硫化氫。甲基紅及VP試驗(yàn)呈陽(yáng)性。不液化明膠和凝固血清?？伤馄呷~苷和馬尿酸鈉。實(shí)驗(yàn)材料儀器恒溫培養(yǎng)箱：30C±1C、36C±1C；均質(zhì)器；顯微鏡：10x?100X；電子天平：感量0.1g；錐形瓶：100mL、500mL；無(wú)菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)；無(wú)菌平皿：直徑90mm；無(wú)菌試管：16mmx160mm；離心管：30mmx100mm；無(wú)菌注射器：1mL；金黃色葡萄球菌(ATCC25923)；馬紅球菌(Rhodococcusequi)單增李斯特氏菌(L.monocytogenes)、伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii)、英諾克李斯特氏菌(L.innocua)培養(yǎng)基和試劑含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)；李氏增菌肉湯LB(LB］，LB2)；鹽酸吖啶黃(acriflavineHCl)溶液：見(jiàn)附錄A中A.3.2.1；1%萘啶酮酸鈉鹽(naladixicacid)溶液；PALCAM瓊脂；革蘭氏染液；SIM動(dòng)力培養(yǎng)基；緩沖葡萄糖蛋白胨水［甲基紅(MR)和V-P試驗(yàn)用］;5%?8%羊血瓊脂：；糖發(fā)酵管；過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)；李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基。樣品：鮮肉、鮮奶、蔬菜等實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)路線(xiàn)圖：1增菌以無(wú)菌操作取樣品25g(mL)加入到含有225mLLB1增菌液的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1min?2min；或放入盛有225mLLB1增菌液的均質(zhì)杯中，8000r/min?10000r/min均質(zhì)1min?2min。于30°C±1°C培養(yǎng)24h,移取0.1mL,轉(zhuǎn)種于10mLLB2增菌液內(nèi)，于30°C±1°C培養(yǎng)18h?24ho2分離取LB2二次增菌液劃線(xiàn)接種于PALCAM瓊脂平板和李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上，于36C±1C培養(yǎng)24h?48h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落。典型菌落在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周?chē)凶睾谏馊?，有些菌落有黑色凹陷；典型菌落在李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上的特征按照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行判定。3初篩自選擇性瓊脂平板上分別挑取5個(gè)以上典型或可疑菌落，分別接種在木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于36C±1C培養(yǎng)24h；同時(shí)在TSA-YE平板上劃線(xiàn)純化，于30C±1C培養(yǎng)24h?48h。選擇木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。4鑒定4.1染色鏡檢：李斯特氏菌為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，大小為(0.4pm?0.5gm)x(0.5pm?2.0gm)；用生理鹽水制成菌懸液，在油鏡或相差顯微鏡下觀察，該菌出現(xiàn)輕微旋轉(zhuǎn)或翻滾樣的運(yùn)動(dòng)。4.2動(dòng)力試驗(yàn)：李斯特氏菌有動(dòng)力，呈傘狀生長(zhǎng)或月牙狀生長(zhǎng)。4.3生化鑒定：挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性反應(yīng)的菌落繼續(xù)進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)和MR-VP試驗(yàn)。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的主要生化特征見(jiàn)表1。4.4溶血試驗(yàn)：將羊血瓊脂平板底面劃分為20個(gè)?25個(gè)小格，挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落刺種到血平板上，每格刺種一個(gè)菌落，并刺種陽(yáng)性對(duì)照菌(單增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌)和陰性對(duì)照菌(英諾克李斯特氏菌)，穿刺時(shí)盡量接近底部，但不要觸到底面，同時(shí)避免瓊脂破裂，36°C±1°C培養(yǎng)24h?48h，于明亮處觀察，單增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周?chē)a(chǎn)生狹小的透明溶血環(huán)，英諾克李斯特氏菌無(wú)溶血環(huán)，伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生大的透明溶血環(huán)。4.5協(xié)同溶血試驗(yàn)(cAMP)：在羊血瓊脂平板上平行劃線(xiàn)接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌，挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落垂直劃線(xiàn)接種于平行線(xiàn)之間，垂直線(xiàn)兩端不要觸及平行線(xiàn)，于!0C±1C培養(yǎng)24h?48h。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌的接種端溶血增強(qiáng)，斯氏李斯特氏菌的溶血也增強(qiáng)，而伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌的接種端溶血增強(qiáng)。表1.單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的主要生化特征表曲利溶血反應(yīng)葡萄糖麥芽糖MR-VP甘露醇鼠李糖木糖七葉昔單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(￡.monocytogenes)++++/+++格氏李斯特氏菌4-++/++十斯氏李斯特氏菌(L.seeligeri)++++/++威氏李斯特氏菌(L.Welshmen)++4-/4-V++伊氏李斯特氏菌(￡.ivanovii)4-1+4-/4-++英諾克李斯特氏菌(￡.iunocua)+++/+V+注：+陽(yáng)性：一陰性：V反應(yīng)不定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果和生化試驗(yàn)及溶血試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告你所檢測(cè)的食品中是否有單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。注意事項(xiàng)：注意在試驗(yàn)中用已知陽(yáng)性菌和陰性菌進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)操作正確與否。思考題：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌的主要生化特征有哪些？與英諾克李斯特氏菌有何區(qū)別？單核細(xì)胞增生李斯特氏菌可能存在在哪些食品中，冷藏食品中是否有存在可能？單核細(xì)胞增生李斯特氏菌有哪些危害？日常生活中如何進(jìn)行防控？參考文獻(xiàn)：中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB478930-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn).北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.李平蘭，賀稚非.食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2005.附錄：A.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)A.1.1成分胰胨17.0g多價(jià)胨3.0g酵母膏6.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g蒸餾水1000mLpH7.2?7.4A.1.2制法將上述各成分加熱攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH,分裝，121。。高壓滅菌15min,備用。A.2含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)A.2.1成分胰胨17.0g多價(jià)胨3.0g酵母膏6.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g瓊脂15.0g蒸餾水1000mLpH7.2?7.4A.2.2制法將上述各成分加熱攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，121。。高壓滅菌15min,備用。A.3李氏增菌肉湯(LB1，LB2)A.3.1成分胰胨5.0g多價(jià)胨5.0g酵母膏5.0g氯化鈉20.0g磷酸二氫鉀1.4g磷酸氫二鈉12.0g七葉苷1.0g蒸餾水1000mLpH7.2?7.4將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。A.5.2革蘭氏碘液A.5.2.1成分碘1.0g碘化鉀2.0g蒸餾水300mLA.5.2.2制法將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。A.5.3沙黃復(fù)染液A.5.3.1成分沙黃0.25g95%乙醇10.0mL蒸餾水90.0mLA.5.3.2制法將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。A.5.4染色法A.5.4.1將純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落涂片，火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗。A.5.4.2滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。A.5.4.3滴加95%乙醇脫色，約15s?30s，直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色，水洗。A.5.4.4滴加復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。A.6SIM動(dòng)力培養(yǎng)基A.6.1成分胰胨20.0g多價(jià)胨6.0g硫酸鐵銨0.2g硫代硫酸鈉0.2g瓊脂3.5g蒸餾水1000mLpH7.2A.6.2制法將上述各成分加熱混勻，調(diào)節(jié)pH，分裝小試管，121。。高壓滅菌15min，備用。A.6.3試驗(yàn)方法挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落穿刺接種到SIM培養(yǎng)基中，于30°C培養(yǎng)24h?48h，觀察結(jié)果。A.7緩沖葡萄糖蛋白胨水（MR和VP試驗(yàn)用）A.7.1成分多胨7.0g葡萄糖5.0g磷酸氫二鉀5.0g蒸餾水1000mLpH7.0A.7.2制法溶化后調(diào)節(jié)pH，分裝試管，每管1mL，121C高壓滅菌15min，備用。A.7.3甲基紅（MR）試驗(yàn)A.7.3.1甲基紅試劑A.7.3.1.1成分甲基紅10mg95%乙醇30mL蒸餾水20mLA.7.3.1.2制法10mg甲基紅溶于30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸餾水。A.7.3.1.3試驗(yàn)方法取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于本培養(yǎng)基，36C±1C培養(yǎng)2d?5d。滴加甲基紅試劑一滴，立即觀察結(jié)果。鮮紅色為陽(yáng)性，黃色為陰性。A.7.4V-P試驗(yàn)A.7.4.16%a-萘酚-乙醇溶液成分及制法：取a-萘酚6.0g，加無(wú)水乙醇溶解，定容至100mL。A.7.4.240%氫氧化鉀溶液成分及制法：取氫氧化鉀40g,加蒸餾水溶解，定容至100mL。A.7.4.3試驗(yàn)方法取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于本培養(yǎng)基，36°C±1°C培養(yǎng)2d?4土加入6%a■萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氫氧化鉀溶液0.2mL,充分振搖試管，觀察結(jié)果。陽(yáng)性反應(yīng)立刻或于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色，如為陰性，應(yīng)放在36C±1C繼續(xù)培養(yǎng)4h再進(jìn)行觀察。A.8血瓊脂A.8.1成分蛋白胨1.0g牛肉膏0.3g氯化鈉0.5g瓊脂1.5g蒸餾水100mL脫纖維羊血5mL?10mLA.8.2制法除新鮮脫纖維羊血外，加熱溶化上述各組分，121C高壓滅菌15min，冷到50C，以無(wú)菌操作加入新鮮脫纖維羊血，搖勻，傾注平板。A.9糖發(fā)酵管A.9.1成分牛肉膏5.0g蛋白胨10.0g氯化鈉3.0g磷酸氫二鈉(Na2HPO412H2O)2.0g0.2%漠麝香草酚藍(lán)溶液12.0mL蒸餾水1000mLA.9.2制法A.9.2.1葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分裝于有一個(gè)倒置小管的小試管內(nèi)，調(diào)節(jié)pH至7.4，115C高壓滅菌15min，備用。A.9.2.2其他各種糖發(fā)酵管可按上述成分配好后，